Abstract

As conexinas (Cx), que constituem junções canais intercelulares em vertebrados, foram mostrados para suprimir o crescimento de células transformadas e tumorigênese, mas o mecanismo (s) ainda permanecem em grande parte especulativo. Aqui, nós definimos a base molecular pelo qual Cx26, mas com menos frequência Cx43 ou Cx32, conferem seletivamente supressão do crescimento de células cancerosas. acoplamento intercelular funcional é mostrado a ser necessário, a produção de blocos parcial do ciclo celular, devido à activação prolongada de várias cinases mitogénicas. PKA é necessário e suficiente para a inibição do crescimento induzida Cx26 em baixa soro e ausência de ancoragem. A activação de PKA não foi associada a níveis elevados de AMPc, mas apareceu como resultado de uma redistribuição de cAMP em toda a população celular, eliminando as oscilações do ciclo celular em AMPc necessária para a progressão do ciclo celular eficiente. Cx43 e Cx32 não conseguem mediar essa redistribuição como, ao contrário de Cx26, estes canais são fechados durante a fase G2 /M do ciclo celular de cAMP quando os níveis de pico. Comparações de linhas de células tumorais indica que este é um padrão geral, com a supressão do crescimento por conexinas que ocorrem sempre que oscila de cAMP com o ciclo celular, e a junção de hiato permanecer aberta durante todo o ciclo celular. Deste modo, o acoplamento por junções de hiato, na ausência de quaisquer sinais externos, proporciona os meios necessários para limitar a taxa mitótica das populações de células

citação:. Um Chandrasekhar, Kalmykov EA, Polusani SR, Mathis SA, Zucker SN, Nicholson BJ (2013) intercelular redistribuição de cAMP subjacente a supressão selectiva of Cancer Cell Growth por Connexin26. PLoS ONE 8 (12): e82335. doi: 10.1371 /journal.pone.0082335

Autor: David M. Ojcius, University of California Merced, Estados Unidos da América

Recebido: 30 de agosto de 2013; Aceito: 30 de outubro de 2013; Publicação: 03 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Chandrasekhar et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho foi apoiado pelo seguinte: NIH – R01 CA048049, CA54174 P30, P01 AG19316 e AG013319 P30. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução junções

Gap são matrizes de canais intercelulares que são os únicos mediadores de permuta intercelular directa de pequenos metabolitos e moléculas de sinalização em sistemas multicelulares [1,2]. Nos vertebrados, estes canais são compostos de proteínas de membrana integrais chamados conexinas (Cx), com quatro domínios transmembranar e citoplasmático N e C -termini. Seis conexinas se juntam para formar um hemichannel ou connexon, e duas dessas hemicanais de oposição células doca para criar o canal intercelular por junções de hiato [3]. O papel fundamental, mas especializado de junções de hiato em tecidos variados é facilitada pela presença de, pelo menos, 21 diferentes isoformas de conexinas em seres humanos, com proteínas distintas que são classificados de acordo com o seu peso molecular [4], e uma nomenclatura de genes descrita em [5 ]. As proteínas Cx43, Cx32 e Cx26 aqui estudados são codificados pelo

GJA1

,

GJB1

e

GJB2

genes, respectivamente.

Quase desde a sua descoberta, as junções de hiato foram implicados como supressores tumorais em vários tecidos [6]. Isto foi confirmado em telas genéticos de numerosos tipos de tumores, incluindo carcinoma da mama [7], o cancro da próstata [8], e melanoma [9]. Uma grande variedade de tipos de tumor e linhas de células transformadas demonstram a diminuição da expressão da proteína de conexina e /ou a funcionalidade de junções de hiato (revisto em 10). Além disso, existem vários casos documentados em que a expressão de conexinas exógeno numa linha celular transformada pode suprimir dramaticamente as suas propriedades transformadas e a sua capacidade para formar tumores em ratinhos nus [Cx43 em células de glioma C6 [11]; Cx43 em células 10T1 /2 células mesenquimais embrionárias [12]; Cx43 e Cx32 em células de cancro da próstata LNCaP [13]; Cx26 em células de câncer cervical HeLa [14]; Cx26 e Cx43 em MDA-MB-231 células de cancro da mama [15,16], e; Cx32 em células de hepatoma SKHep1 [17]. O último também é consistente com um aumento na tumorigénese hepática observada em Cx32 – /- ratos [8,18]

a supressão do crescimento de células transformadas por expressão Cx tem sido associada à regulação da pro- e anti-apoptóticas. proteínas (por exemplo, Bcl-2) [19,20] ou alterações nas proteínas do ciclo celular, tais como NOV (CCN3) [21], Skp2 [22] e p21 [23,24]. No entanto, estabelecer uma conexão direta entre qualquer um destes eventos e a troca de moléculas de sinalização entre as células através de junções provou evasivo. Progressos nesta matéria tem sido restrita por informações limitadas sobre as propriedades de permeabilidade de conexinas e a distribuição espaço-temporal de concentrações baixas de peso do metabolito moleculares em populações multicelulares. Em alguns casos, as conexinas têm sido propostos para suprimir o crescimento, mesmo na ausência de actividade do canal de junções de hiato demonstrável [15,21,24,25,]. Isto pode ocorrer através de interacções com outras proteínas que se sabe ligarem a conexinas (revisto por [26]), através da sua função como hemicanais, o que pode contribuir para o aumento da morte de células [27], ou mesmo através de mis-localização de partes da proteína ( 25). No entanto, as ligações definitivas entre qualquer um desses processos e fatores anti-oncogênicos continuam a ser estabelecida.

Embora o papel do acoplamento de células, em comparação com outras funções conexina, ainda é um assunto para debate na supressão do tumor, o link entre o acoplamento por junções de hiato e mitogénese foi estabelecido em várias condições não patogénicas. Vários factores de crescimento, tais como EGF [28] e PDGF [12] demonstraram induzir desacoplamento transiente de células como parte da resposta precoce imediato que precede o início da mitose. Oncogenes como

v-src

ter sido demonstrado que têm similar, mas mais efeitos duradouros sobre o acoplamento [29].

In vivo

, como parte da resposta regenerativa seguinte hepatectomia parcial, uma perda aguda de junções comunicantes entre hepatócitos é visto a preceder imediatamente a primeira onda da mitose [30]. No entanto, como foi o caso em tumores, a base molecular da inibição mitogénica associada a acoplamento célula permanece para ser resolvido. Neste estudo, procurou-se definir o mecanismo molecular de supressão do crescimento de conexinas em células HeLa, uma linha celular de cancro do colo do útero transformado muito bem caracterizadas, e testar a generalização de tais mecanismos com outros tipos de células. Os nossos resultados demonstram que Cx26 permite especificamente a passagem de cAMP entre células, nivelando os picos e depressões de AMPc que ocorrem durante o ciclo de célula e, através da activação de PKA, causando atrasos do ciclo celular. O efeito é conexina específico, como outras conexinas, como Cx43 e 32, perto durante o ciclo celular, exatamente no momento em que os níveis de cAMP acumular. O exame de várias linhas de células tumorais indica uma generalidade para este efeito, desde que as oscilações de cAMP são vistos e os canais permanecem abertos durante todo o ciclo celular.

Resultados

Cx26, mas não Cx32 ou 43, inibem transformado crescimento de células HeLa

As células HeLa são uma linha de células de câncer cervical amplamente estudados, que não possuem junções comunicantes endógenos, mas permitir a expressão robusta, o tráfico apropriado, e processamento de conexinas exogenamente expressas. Nós utilizamos este sistema para caracterizar as propriedades de crescimento conexina através da preparação de clones em pool de células HeLa que expressam Cx43 (HeLa43), Cx32 (HeLa32) e Cx26 (HeLa26). Cada um dos transfectantes HeLa expressam conexinas em níveis semelhantes, e de acordo com o PM previsto em transferências de Western (Figura S1). Eles formam placas típicas de junções de hiato na interface célula-célula (Figura 1A), e apresentam taxas semelhantes de transferência de corante calceína pré-carregada com as células não marcadas circundantes, com ~ 95% de células carregadas a ser acoplado a pelo menos um vizinho, e 73-83% de vizinhos de primeira ordem a receber corante (Tabela 1).

(a) coloração por imunofluorescência, utilizando o anticorpo anti-Cx adequado, mostra a expressão característica de conexinas em placas entre as células. HeLaPar resultados negativos com todos os três anticorpos anti-Cx (resultados anti-Cx26 anticorpos são mostrados aqui) (barras de escala, 10 ^ m).

(B) Crescimento do HeLaPar (quadrados), com piscinas de clones HeLa transfectadas com Cx26 (círculos), Cx32 (triângulo invertido) ou Cx43 (triângulo em posição vertical), submetido a 3 dias de privação de soro (0-3 dias), seguido por 3 dias em soro de 1% (dias 3-6), revela a supressão do crescimento selectiva pela Cx26. Os dados representativos a partir de uma de três experiências é mostrado, com pontos representam a média ± SEM de plaqueamentos em triplicado.

(C) Topologia diagrama de Cx26, com a superfície extracelular, na parte superior, descreve a localização de dois mutantes pontuais utilizados neste estudo que interrompem diferentes aspectos da função de canal (R75Y e T135A).

(D) A coloração por imunofluorescência com um anticorpo anti-Cx26 mostra que ambas as placas mutantes forma conexinas na superfície da célula, com R75Y ter um pouco menor, placas menos frequentes, e T135A tendo placas maiores e mais frequentes do que W.T. Cx26 (painel A) (barra de escala, 10 ^ m).

função (E) Hemichannel foi ensaiada por fixação de corante LY num ensaio de corante soltando (Batedor et al., 2002). O painel esquerdo mostra a imagem de contraste de fase (asteriscos indicam células ocupando o corante) e o painel direito mostra a imagem fluorescente (barras de escala, 20 um). Note-se que algumas células com corante positivo parecem ter corante recebidas através de transferência intercelular da célula original que ocupava corante nas culturas HeLa26.

(F) A comparação do crescimento em baixa de soro (cf painel B) de Cx26 mutante células que expressam (- Cx26T135A diamantes, Cx26R75Y – triângulos) com aqueles em peso expressando HeLa26 (círculos) e HeLaPar células (quadrados) demonstra que os canais intercelulares funcionais de W. T. Cx26 são necessários para a supressão do crescimento. Os dados representativos de uma das três experiências é mostrado, com pontos que representam a média ± SEM de platings em triplicado.

Gap junção

Hemichannel

HeLa Tipo celular

% Juntamente

um

% Primeira Ordem

b acoplamento

% células enchimento com extracelular Dye

c

Parental000Cx 4395 ± 1,3273 ± 10.43NTCx 3296 ± 2,0180 ± 9.53NTCx 2693 ± 0,6783 ± 8,283 ± 1.7Cx26 R75Y006 ± 1.2Cx 26T135A000Table 1. Análise funcional dos cruzamentos e Gap hemicanais.

a percentagem de células pré-carregadas de passagem de corante, pelo menos, uma célula receptora.

b a percentagem de células de primeira ordem (isto é, aquelas imediatamente adjacente à célula do dador) que recebe corante após 6 horas de plaqueamento.

c a percentagem de células que mostram a absorção do corante Amarelo Lúcifer (LY) (ver Figura 1E). Os resultados não incluem células receber LY em segundo lugar, através de acoplamento (isto é Cx26) .nt: condições de soro não testado CSV Baixar CSV

O efeito da expressão da conexina sobre as características de crescimento transformadas de células HeLa foi avaliada sob baixa (1%) e na poli (2-hidroxietil metacrilato) (polyHEMA) placas revestidas que não suportam-substrato celular de adesão [31]. Apesar dos níveis semelhantes de acoplamento de conexinas em todos os transfectantes, descobrimos que apenas HeLa26 apresentaram atraso de crescimento, consistente com estudos anteriores (Mesnil et al., 1995). HeLa26 mostram três vezes mais longa tempos de duplicação em condições de soro baixo (Figura 1B), e ≥2 vezes mais lento o crescimento independente de ancoragem (Figura S2) em comparação com as células parentais HeLa (HeLa PAR) ou outros transfectantes de conexina, conforme demonstrado em três HeLa26 independente clones. Todos os dados apresentados aqui foi obtida a partir de conjuntos de clones misturados em proporções iguais para cada experimento.

comunicação intercelular por Cx26 é necessário para a supressão do crescimento

A função específica de Cx26 responsável pela supressão do crescimento foi avaliada através de mutações pontuais Cx26 que extirpadas função de canal. A mutação Cx26T135A na extremidade citoplasmática do terceiro domínio transmembranar (Figura 1C) impede a abertura de ambos os canais de junções de hiato ou hemicanais [32]. A mutação Cx26R75Y no primeiro loop extracelular (Figura 1C) impede a formação de canais de junções de hiato, mas deixa hemichannel funcionar praticamente inalterado [33]. das junções de hiato e as propriedades de todos os hemichannel constrói Cx26, Cx43, bem como e 32, foram confirmadas utilizando a transferência de Amarelo Lúcifer entre as células, ou a absorção a partir do suporte após a estimulação mecânica (Figura 1E), respectivamente (resumidos na). Ambos os mutantes de Cx26 formar placas em células HeLa (Figura 1D), documentando que estas mutações ainda apoiar a montagem de estruturas de junções de hiato [32]. As placas parecia ser mais numerosas no caso de HeLa26T135A, e menor no caso de HeLa26R75Y (c.f. Figuras 1A e D), de acordo com as indicações anteriores, que Cx26R75Y podem reduzir a estabilidade e o tamanho das placas de junções de hiato [34].

Ao contrário do tipo selvagem (W.T.) Cx26, nenhum dos mutantes Cx26 causou supressão do crescimento de células HeLa, quer em baixo teor de soro (Figura 1F), ou sob condições independente de ancoragem (Figura S2). Assim, a comunicação intercelular é necessário para retardo de crescimento por Cx26. Enquanto a função de hemichannel HeLa26R75Y fez reduzir a densidade de saturação, o que sugere um papel para hemicanais parcial no grau de empacotamento de células, o efeito foi moderada por um 20%, em comparação com W.T. Cx26, o que reduziu a densidade de saturação de 60%. Apesar de acoplamento intercelular era claramente necessária para conexina mediada reversão das características de crescimento transformadas, o acoplamento através de outras conexinas (Cx43 e Cx32) foi ineficaz, indicando um papel único para os canais de Cx26.

efeitos de crescimento de junções de hiato Cx26 são mediadas por blocos do ciclo celular reversíveis

Como um primeiro passo para identificar o mecanismo pelo qual Cx26 acoplamento junção gap suprime transformado crescimento de células HeLa, perguntamos se este foi uma consequência do aumento da morte celular, ou a divisão celular reduzida. HeLa26 células não mostrou nenhum aumento na coloração TUNEL, ou a actividade da caspase-3 (não mostrado), indicando que Cx26 não aumentar a apoptose em células HeLa (Tabela S1). Houve algum aumento na Anexina V e rotulagem de Hoechst células HeLa26, mas essas células não apresentaram características morfológicas características da morte celular por apoptose, necrose ou autofagia. Em vez disso, eles mostraram características consistentes com células que tenham sido bloqueados na citocinese (ver abaixo), que, tipicamente, apresentam uma maior permeabilidade da membrana. A análise FACS das células HeLa Par e Cx26 transfectantes após a libertação em 1% de soro de bloco timidina /nocodazole (paragem G2), revelou uma saída prolongada da mitose em células HeLa26, com atrasos aparentes em todas as fases do ciclo celular. (Figura 2A). HeLa43, HeLa32, e os dois Cx26 HeLa transfectantes distribuições ciclo show de células mutantes semelhantes a HeLa Par (dados não mostrados). Estudos semelhantes comparando o crescimento após a libertação a partir do bloco G1 induzida por bloco timidina dupla produziu resultados semelhantes, com a saída da fase G1 /S sendo nomeadamente atrasado em células HeLa26 comparação com HeLa43, HeLa32, e os mutantes transfectantes Cx26 HeLa (dados não mostrados).

(A) A distribuição do ciclo celular de HeLaPar (painel superior) e HeLa26 (painel inferior) foi analisada por FACS [separação de células em G1 (luz barras cinzentas), S (barras cinzentas escuras) e G2-M (preto bares) fases] nos tempos indicados após a adição de soro de 1% após privação de soro. HeLa26 células mostram uma progressão mais lenta através do ciclo celular (por exemplo, o tempo para voltar a G2: 24 horas contra 16 horas para HeLaPar), bem como uma perda notável de sincronização. Os dados são médias ± SEM de três experiências independentes.

(B) coloração do núcleo com DAPI (coluna da esquerda) revela uma frequência muito mais elevada de núcleos multilobed em células que expressam Cx26 (10-14% – Painéis III, V e VII) que HeLaPar células (2 – 5% – painel I). Co-coloração das mesmas células para gama-tubulina (coluna da direita) mostra um (células quiescentes) ou dois (células que se dividem) centrossomas em células HeLaPar (Panel II). Em contraste, as células HeLa26 (painéis IV, VI e VIII), muitas vezes compartilhar uma única centrossoma entre múltiplos núcleos (setas), ou ter um conjunto de múltiplas centrioles (seta) (barras de escala, 10 ^ m).

(C ) a percentagem de células de multi-lóbulos determinados em diferentes dias após a adição de 1% de soro, é consistentemente mais elevado em HeLa26 (barras a cheio) do que HeLaPar (barras abertas), com a diferença máxima em 1 dia. Dados é média ± SEM. * Denota significância para p valor 0,05. ** Indica a significância para valores de p 0,005.

Hoechst ou coloração DAPI no soro a 1% mostrou uma acumulação significativa de núcleos polimórficos, ou células nucleadas em multi-HeLa26 (≥10% 24 horas após a adição de soro) em comparação com o observado em células HeLa Par ( 4%) (Figura 2B). Estas células são significativamente maiores e mais achatado do que aqueles com núcleos individuais, e parecem consistentes com o fracasso para concluir com êxito fase M e /ou citocinese. Estas alterações nucleares são ligadas quer simples (setas na Figura 2B, IV e VI), ou múltiplos centrossomas (ponta de seta na Figura 2B VIII) dentro de uma única célula, compartilhado por vários núcleos, ou lóbulos nucleares. Isto está em contraste com os habituais dois centrossomas associados com divisão de células HeLa Par (seta aberta na Figura 2B II), e sugere que as células HeLa26 têm problemas com a regulação da duplicação centrossoma. membranas nucleares intactos, a falta de cromatina condensada, e a ausência de marcação TUNEL em HeLa26 (Tabela S1), indicam que as células não entram apoptose, mas eventualmente sair mitose. Coerente com isso, enquanto as células de multi-lobed ou multi-nucleadas são sempre mais abundante em culturas HeLa26, eles não se acumulam ao longo do tempo (Figura 2C).

acoplamento Cx26 junção gap afeta os níveis e atividade de várias mitogênica moléculas de sinalização

de acordo com os efeitos observados de Cx26 no ciclo celular de células HeLa, foi encontrado o estado de activação de vários reguladores mitogénicos para ser cronicamente aumentados em HeLa26 em comparação com células HeLa par e outros transfectantes (Cx Cx26R75Y mostrados como um exemplo) durante o crescimento no soro 1% (Figura 3 e Figura S3). Especificamente, os níveis de inibidores da CDK, p21 e p27, que regulam directamente G1 (p21 e p27) e G2 (p27) progressão, foram de 1,5 a 2 vezes superiores em células HeLa26 durante a privação de soro (0 ponto de tempo), e mantiveram-se elevados durante 48 ou 24 horas após a adição de soro de 1%, respectivamente.

(AG) Os níveis de proteína em HeLaPar (barras abertas), HeLa26 (barras a cheio) e HeLa26R75Y (barras de xadrez) foram quantificados a partir de imagens digitalizadas de transferências de Western (Figura 2, os dados suplementares) imediatamente após a privação de soro (dia 0), e diariamente após a adição de soro de 1%. Os níveis de proteína para cada um foram normalizadas para que HeLaPar de células no dia 0. Actina serviu como o controlo de carga interna. Os níveis dos inibidores de CDK, p21 (A) e p27 (B), e o rácio de fosforilado (activado) para os níveis totais de os membros da família de MAPK e seus reguladores, MEK (C), ERK (D), de JNK (E) p38MAPK (F) e a subunidade catalítica de PKA (g) foram cada um em maior HeLa26. Esta elevação, evidente durante a privação de soro, persistiu a partir de 1 – 3 dias, dependendo da proteína.

(H) os níveis de cAMP foram avaliados por ELISA em HeLaPar (open bar), HeLa26 (barra fechada) e HeLa26T135A (barra de xadrez). Ao contrário de actividade de PKA, os níveis de cAMP não mostram aumentos consistentes na HeLa26 em comparação com os outros tipos de células. células HeLa26R75Y mostrar os níveis de cAMP semelhantes a HeLa26T135A. Os dados são a média ± SEM de pelo menos três experiências independentes. Os asteriscos indicam os casos em que a actividade em HeLa26 é significativamente maior (* = p 0,05; ** = p 0,005) do que ambas as células T135A HeLaPar e HeLa26R75Y ou

Vários membros do mitogen activado. proteína quinase (MAPK) familiar, conhecido para regular os níveis de p21 e p27 (Erk 1/2, p38 e JNK) (Figura 3 CE), mostraram aumentos persistentes (2 a 3 vezes) em HeLa26. Duas cinases, mais a montante, MEK e a proteína cinase A (PKA) alfa subunidade catalítica (Figura 3 F e G), mostraram aumentos ainda maiores prolongados na actividade em HeLa26 (com 3 a 5 vezes para mais de 72 horas após a adição de soro). Estes aumentos não foram observados em todas as vias mitogénicas como não foram observadas mudanças na Akt ou p70 S6 quinase.

Apesar da ativação prolongada de MAPKs está associada à diminuição divisão celular [35,36], a sua ativação aguda é tipicamente pró-mitogênica. Consistente com isto, nas primeiras 2 horas após a estimulação com soro a 1%, células HeLa Par mostrou uma activação transiente de Erk e JNK e uma diminuição na p38, seguido de retoma do estado basal. Em contraste, HeLa26 não apresentaram essas alterações transitórias na atividade (Figura S4), mas apenas uma partida de ativação mais lento início ~ 2 horas após a adição de soro.

é necessária e suficiente para a supressão do crescimento de Cx26 A ativação de PKA

a contribuição funcional da elevação destas cinases para a supressão do crescimento da Cx26 foi avaliada por estudos de siRNA knockdown de Erk, JNK e a alfa subunidade catalítica de PKA. siRNAs adicionado durante a privação de soro inicial, 24 horas antes da adição de soro de 1%, provocou uma redução de 5 vezes na JNK e uma redução de 2 vezes de Erk e PKA (Figura 4A). níveis mais elevados de siRNA não foram usadas para evitar efeitos tóxicos sobre as células, à medida que cada uma destas vias de sinalização, também é necessário para a divisão celular basal.

(A) Os lisados ​​de HeLa26 (painel da esquerda), tratou-se com sequência aleatória siRNA (controlo), ou ARNsi específico para as cinases indicados, foram preparados 24 h após a adição de soro e sondadas com anticorpos contra a proteína total como indicado à esquerda de cada blot. Níveis de todos os quinases foram reduzidos, com decréscimos JNK sendo mais dramática. Os lisados ​​de células HeLaPar (painel da direita) transfectadas com uma construção de CA-PKA (constitutivamente activa) mostraram muito mais elevado de expressão da PKA do que os controlos não transfectadas. Actina serviu como um controlo de carga.

(B) Crescimento das diferentes ARNsi células tratadas HeLa26 (barras em branco), ou células HeLaPar com e sem expressão de PKA constitutivamente activa (barras a cheio) são comparados como uma razão de célula número 24h após, e no momento da, adição de soro. O papel da activação constitutiva de cada uma das cinases mitogénicas na inibição do crescimento de HeLa26 é evidente na reversão de Cx26 supressão do crescimento induzida pelos respectivos ARNsi. Isto é mais dramático no caso da PKA, onde o crescimento retorna para os mesmos níveis de células HeLaPar. supressão do crescimento de células HeLaPar, no mesmo grau como se vê na HeLa26, por expressão do CA-PKA PKA indica que só podem mediar este efeito. diferenças significativas no crescimento são indicadas por asteriscos (p 0,05).

Durante as primeiras 24 horas em 1% de soro, as células HeLa Par duplicou em número, enquanto que as células HeLa26 não mostraram crescimento significativo (Figura 4B ), consistente com o atraso na progressão do ciclo celular observada na análise de FACS na Figura 2A. O tratamento com ARNsi de sequência aleatória não teve qualquer efeito sobre este padrão de crescimento. ERK e JNK siRNAs individualmente, ou em conjunto, causou uma perda parcial de inibição do crescimento em células HeLa26, mas siRNA para PKA causou uma reversão completa para o padrão de crescimento de células HeLa par. Além disso, a sobre-expressão da subunidade catalítica de PKA alfa em células HeLa (Figura 4A, painel da direita) suprimiu o seu crescimento para a mesma taxa que a de células HeLa26 (Figura 4B). Assim, enquanto que a activação de outras quinases a jusante contribui para a regulação do crescimento de células HeLa, a activação de PKA parece ser o factor de influência predominante, sendo ambas necessárias e suficientes para os efeitos de Cx26 em crescimento HeLa em baixo teor de soro.

A ativação de PKA por acoplamento por junções de hiato Cx26 é causado por redistribuição de cAMP, e não pela elevação do seu nível

O principal papel da PKA demonstrado acima implica fortemente cAMP como um sinal regulamentar provável crescimento. No entanto, comparações dos níveis de cAMP globais em HeLa26, HeLa Par e culturas HeLa26R75Y (Figura 3H) não revelaram diferenças consistentes entre as linhas de células ao longo de três dias de crescimento no soro 1%. No entanto, o AMPc tem sido mostrado para ser permeável através de Cx26 canais de junções de hiato entre as células HeLa [37,38]. Uma vez que os canais intercelulares funcionais são necessárias para a activação de PKA e supressão do crescimento, isto levou-nos a investigar se uma difusão de cAMP a partir de células com concentrações elevadas de células com concentrações mais baixas podem resultar em uma maior fracção de células com PKA activado, sem qualquer necessidade de adicional a produção de AMPc.

a fim de visualizar diretamente os níveis de cAMP espacialmente, um repórter FRET empregando EPAC como o domínio de detecção cAMP imprensado entre PCP e fluoróforos YFP foi introduzido nas células por transfecção. O branqueamento da YFP (o aceitador) fluorphore resultou num aumento da PCP (doador) fluorescência (23%) (Figura 5A), que não foi observado quando PCP e YFP foram expressas isoladamente (2%) ou em conjunto, mas em moléculas diferentes ( ~ 4%). Elevação de cAMP por 8-Br AMPc (agonista de AMPc), forscolina (adenil-ciclase activador) e 3-isobutil-1-metilxantina (inibidor da fosfodiesterase) causou uma perda de FRET para 10%, presumivelmente devido a extensão da molécula EPAC em AMPc de ligação (dados resumidos na Figura 5B). leituras FRET de células individuais em culturas não-sincronizado HeLa Par e HeLa26 fotografada em um microscópio confocal foram correlacionados com conteúdo de DNA e morfologia nuclear. Os níveis de cAMP em células HeLa aumentada Par ~ 2 vezes em relação a interfase na mitose. Esta diferença foi quase completamente perdido em células HeLa26, devido aos níveis de interfase aumento e diminuição dos níveis em células mitóticas (Figura 5C). Acompanhando os níveis de cAMP ao longo de um ciclo celular normal em células par HeLa sincronizados pelo bloco duplo timidina, confirmou que os níveis de cAMP permanecem baixas durante G1 e S, subir no G2, pico em metáfase, e depois declinar na última parte da mitose (Figura 5D) . Estes “picos e vales” de AMPc parecem ser eliminado nas células HeLa26 devido à difusão de cAMP das relativamente poucas células na fase M, para a maioria das células em fase G1 /S. O aumento resultante no AMPc nas células em fase G1 /S induz a activação de PKA, que é inibidor do crescimento nesta fase do ciclo celular [39]. Isto explica os resultados na Figura 4b, onde knock-down da PKA (particularmente durante a fase G1 /S) pode eliminar os efeitos supressivos de crescimento Cx26 Cx26, enquanto que a sua activação pode imitar-lo.

(A) Representação de aceitante de fotodegradação FRET, mostrando um aumento no doador (PCP) fluorescência após completa receptor (YFP) fotodegradação.

(B) FRET eficiência é mínimo quando PCP e YFP estão expressos em separado ou em conjunto, mas não ligados através de um transportador comum. FRET eficiência da duplamente marcada EPAC construir aumenta em quase 10 vezes, mas cai para apenas 3-4 vezes acima de fundo quando os níveis de cAMP são aumentadas.

(C) FRET medições um dia após a adição de soro a partir de células individuais em quer interfase ou mitose mostram que as alterações nos níveis de cAMP com o ciclo celular observada em células HeLa é eliminado após a expressão de Cx26.

(D) FRET análise de uma população de células sincronizadas em HeLaPar G1, mostra a oscilatório padrão de cAMP com o ciclo celular, com os níveis permanecendo baixo ao longo da interfase e um pico durante a porção de metafase da mitose.

Barra de escala representam ~ 40μM. Um mínimo de 25 células foi calculada a média para cada tipo de célula e estágio do ciclo celular para FRET.

(E) Imunocitoqu�ica da ativa fosfo-PKA (catalítico subunidade alfa) 1 dia após 1% de adição de soro (linha superior) revela um padrão de coloração heterogênea em células HeLaPar e células que expressam Cx43 ou o canal de junção gap deficiente Cx26R75Y mutante. Por outro lado, os níveis de p-PKA em HeLa26 são maiores e mais uniforme em todas as células. Marcando células individuais de conteúdo líquido de sinal e DNA p-PKA como avaliado por coloração DAPI revela uma correlação (gráficos inferiores), com níveis de p-PKA ser baixa no G1 /S (conteúdo de DNA inferior) e rica em G2 /M (DNA maior conteúdo). Esta diferença é drasticamente reduzido em HeLa26 culturas.

Para confirmar se esta redistribuição de cAMP foi consistente com o aumento global da PKA fosforilação no local Thr197 ativando [40] tínhamos observado (Figura 3G), que também examinou os padrões espaciais de p- coloração PKA em HeLa Par, 26, 43 e culturas 26R75Y (Figura 5E). A coloração das células individuais é bastante heterogênea em todas as culturas que mostram um crescimento rápido em baixa de soro (HeLa Par, Cx43 e Cx26R75Y). Co-coloração com DAPI revelou uma correlação clara entre a intensidade de marcação P-PKA de cada célula com o seu conteúdo de DNA (Figura 5E – parcelas por baixo de cada imagem de imunofluorescência), com os níveis mais elevados de P-PKA após a replicação do ADN a ser consistente com o pico observado nos níveis de AMPc em fase M mostrado na Figura 5B. HeLa26 células apresentaram uma exceção a esse padrão em que a coloração de células foi mais uniforme. Não surpreendentemente, a correlação de intensidade P-PKA com conteúdo de DNA também foi drasticamente reduzida, consistente com as diferenças mínimas que vemos em níveis de cAMP entre fase M e células em fase S nestas culturas (Figura 5C). Estes resultados só são prontamente explicados por uma redistribuição de AMPc através de canais de Cx26, a partir de células com concentrações mais elevadas (fase M), para células com concentrações inferiores (G1 /fase S). Isto resulta aparentemente de uma fracção muito maior de células que alcançam os níveis de cAMP suficientes para induzir a fosforilação de PKA, que conduz à sua activação e uma regulação positiva global da actividade de PKA na cultura sem qualquer aumento efectivo do nível geral de cAMP.

Cx43 e os canais de Cx32 foram ineficazes na supressão do crescimento uma vez que estes canais estreitos durante o ciclo celular

como as células HeLa43 e HeLa32 mostrar acoplamento intercelular robusta, e dado provas antes que cAMP pode passar de forma eficaz através de ambos os canais de Cx43 e Cx26 nestes células [37], buscou-se determinar por que Cx43 e 32 foram ineficazes na supressão do crescimento. Uma vez que os níveis de cAMP aumentar apenas durante a fase M, onde foi relatado que o acoplamento por junções de hiato pode diminuir, nós examinamos se estes três conexinas são regulados diferencialmente durante o ciclo celular. As células foram sincronizadas em fase S por bloco timidina dupla em (10%) de soro normal. Ao contrário do comportamento em baixo teor de soro (Figura 1), todas as linhas de células HeLa cresceram a taxas semelhantes em soro normal. O grau de sincronia, assim como a progressão do ciclo celular após a libertação a partir do bloco, verificou-se ser o mesmo para todos os três transfectantes de conexina, em condições de soro normais. .