Abstract

Fundo

A previsão do prognóstico da doença do cancro da próstata através da análise da expressão gênica está recebendo cada vez mais interesse. Em muitos casos, essas análises são baseadas em, material de biópsia fixado em formalina parafina (FFPE) do núcleo da agulha em que foi realizado Gleason de classificação para o diagnóstico. Uma vez que cada paciente normalmente tem múltiplas amostras de biópsia, e desde Gleason de classificação é um processo dependente do operador conhecido por ser difícil, o impacto da escolha do operador da biópsia foi avaliada.

Métodos

Várias amostras de biópsia de 43 pacientes foram avaliados usando uma assinatura gene anteriormente relatados de IGFBP3, F3 e VGLL3 com potencial valor prognóstico na estimativa de sobrevida global em diagnóstico de câncer de próstata. Foi utilizado um kit de uma etapa de teste qRT-PCR em multiplex quatro, concebido e optimizado para medir o assinatura em amostras de biópsia com agulha grossa FFPE. Concordância dos níveis de expressão de genes entre os padrões primários e secundários do tumor Gleason, bem como amostras de tecido benigno, foi analisada.

Resultados

Os níveis de expressão do gene de IGFBP3 e F3 na próstata epitelial do câncer cell- contendo tecido representando os padrões de Gleason primário e secundário eram altas e consistente, enquanto a baixa expressa VGLL3 mostrou maior variação nos seus níveis de expressão.

Conclusão

a avaliação dos níveis de expressão de genes IGFBP3 e F3 em tecido de câncer de próstata é independente de padrões de Gleason, o que significa que o impacto da escolha do operador da biópsia é baixa

Citation:. Peng Z, Andersson K, Lindholm J, Bodin I, Pramana S, Pawitan Y, et al. Choice (2014) dependente do operador de cancro da próstata Biópsia tem impacto limitado sobre a análise do gene assinatura para os genes altamente expressa IGFBP3 e F3 em células de cancro da próstata epiteliais. PLoS ONE 9 (10): e109610. doi: 10.1371 /journal.pone.0109610

Edição: Natasha Kyprianou, da Universidade de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 04 de junho de 2014; Aceito: 01 de setembro de 2014; Publicação: 08 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Peng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seu arquivo de Informações de Suporte

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo Uppsala Bio (https://www.uppsalabio.com/), a Sociedade de Câncer Sueco (http: //www.cancerfonden.se/sv/Information-in-English/), o V Jubilee Fundação Rei Gustaf (https://www.rahfo.se/Metamenyn/In-English/), eo Conselho do condado de Estocolmo (http: //www.sll.se/om-landstinget/Information-in-English1/). Os financiadores forneceu apoio sob a forma de salários para Zhuochun Peng, Karolinska Institutet, mas não tinha nenhum papel adicional no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Competindo interesses: Dr. Chunde Li é um dos co-fundadores, sócio e vice-presidente do conselho de administração da Chundsell Medicals AB, uma empresa start-up com o objetivo de desenvolver um kit Prostatype ® qRT-PCR com base no estudo de assinatura relatado anteriormente mencionado no referências. Ele também é um dos inventores da patente Sueco (SE 536.352), de propriedade de Chundsell Medicals AB. Zhuochun Peng trabalha como consultor científico e gerente de produto para Chundsell Medicals AB, além de ser um accionista. Ela é também um dos inventores da patente Sueco (SE 536.352), de propriedade de Chundsell Medicals AB. Karl Andersson trabalha como consultor estatísticas para Chundsell Medicals AB. Ele é afiliado com o Ridgeview Instruments AB, que é um desenvolvedor contratual para Chundsell Medicals AB. O acima divulgada competindo interesse não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

A previsão do prognóstico da doença do cancro usando análise de expressão gênica é uma abordagem relataram num número cada vez maior de estudos [1]. Para muitos diagnósticos de câncer, um tipo de amostra conveniente e acessível é formalina parafina fixo incorporado (FFPE) de material a partir de qualquer material de biópsia ou tecido do tumor removido cirurgicamente. Para o câncer de próstata (PCA), biópsias FFPE estão prontamente disponíveis nos laboratórios de patologia de rotina clínica e adequado para tais análises. No entanto, em muitos casos, estão disponíveis múltiplas biópsias para cada paciente, e a análise da expressão do gene é normalmente conduzida em apenas uma amostra por paciente. Isto significa que o patologista tem que escolher qual a biópsia para analisar

.

O Índice de Gleason (GS) sistema de classificação é o método de classificação histopatológica dominante para carcinoma prostático em todo o mundo, tanto em pesquisa e na rotina clínica. escore de Gleason é a soma dos graus de Gleason o mais comum eo segundo padrões de tumores mais comuns. GS é um dos parâmetros clínicos mais importante para indicar prognóstico de sobrevivência em doentes com cancro da próstata. Há, porém, uma grande zona cinzenta em GS 7 em termos de diferenças de sobrevivência: por exemplo, pacientes com GS 3 + 4 têm um prognóstico muito melhor do que pacientes com GS 4 + 3 [2]. É um fato comumente notado que a classificação de Gleason, mesmo quando avaliada por patologistas especializados, é um método dependente do operador. Isto conduz a riscos para relatar os resultados não concordantes sobre o mesmo material de tumor, em particular quando discriminar 3 + 4 4 + 3 [3]. Este tipo de dependência operador pode ter um impacto sobre a análise da expressão gênica.

Um relatório recente do nosso laboratório mostraram que uma assinatura de IGFBP3, F3 e VGLL3 expressão do gene poderia estimar a sobrevida global dos pacientes de câncer de próstata no momento da diagnóstico [4]. Os três genes foram selecionados de forma gradual a partir de um conjunto inicial de preditores de genes de células estaminais 641. Por isso, esta assinatura potencialmente captura haste propensão célula ou ‘stemness’ de células cancerosas independentes do subtipo histopatológico [4]. Foi avaliada uma coorte sueca de 189 pacientes CaP diagnosticados entre 1986 e 2001 com os dados de sobrevida global de acompanhamento quase concluída. Nesta coorte, 78% dos pacientes foram tratados primeiramente com apenas terapia hormonal. A assinatura a expressão do gene foi mostrado suficiente para categorizar os pacientes em alto risco, de risco intermediário e baixo risco subtipos.

O IGFBP3, F3 e gene VGLL3 assinatura foi identificada usando Aspirativa com Agulha Fina amostras de citologia (FNA) . A prática clínica atual para o diagnóstico do câncer de próstata é a utilização de amostras de biópsia por agulha FFPE. Uma vantagem de amostras FFPE é que eles podem ser facilmente arquivados e que muitos têm coortes de dados de acompanhamento a longo tempo clínicos disponíveis, o que facilita grandemente os estudos clínicos. Mesmo que o RNA extraído de amostras de FFPE podem ser de qualidade relativamente baixa, vários estudos recentes têm demonstrado resultados promissores quando se utiliza ARN degradado extraído de amostras de FFPE arquivo, para quantificar os níveis de expressão do gene por métodos de qRT-PCR optimizadas [5] – [7]. Um exemplo é o kit Prostatype qRT-PCR, que foi desenvolvido e optimizado para a medição dos níveis de um gene assinatura de IGFBP3, F3 e VGLL3 de expressão de genes particularmente em amostras de FFPE.

Na análise dos níveis de expressão de ARN em amostras de biópsia FFPE, há uma multiplicidade de factores que têm um impacto sobre os resultados. Cada biopsia tem uma fracção de material diferente do tumor e as condições de armazenagem pode ter influenciado a qualidade de ARN de diferentes maneiras. Para isso, há um certo número de factores no processo de análise que irá induzir variação, de tal modo que a eficiência de extracção de ARN, os erros de pipetagem, a estabilidade dos reagentes ao longo do tempo, impurezas, contaminações e assim por diante.

a luz do variabilidade e dependência do operador de Gleason classificação, investigou-se a nível de IGFBP3, F3 e VGLL3 expressão em biópsias múltiplas a partir do mesmo paciente, e focada sobre a variação relacionada com a escolha de qual muito biópsia para ser analisado. Isso tornou possível avaliar o impacto da escolha do operador da amostra sobre o nível de expressão do gene medido.

declaração de Ética Materiais e Métodos

O protocolo de estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Karolinska (número de aprovação: 00-164) e foi realizada de acordo com os princípios éticos descritos na Declaração de Helsinki 1964

consentimento informado por escrito para a coleta de material de bio-bancária geral. foi obtido de todos os participantes de acordo com a lei bio-banco sueco, antes da sua inclusão no estudo.

biópsias por agulha de núcleo de próstata FFPE

as amostras de biópsia com agulha grossa FFPE próstata foram coletadas no tempo de diagnóstico CaP de acordo com o procedimento de rotina usada na Aleris Diagnostik AB (Aleris Medilab) em Estocolmo, Suécia. Para cada paciente, 6-10 biópsias por agulha grossa foram tiradas para classificação de Gleason [2]. Biópsias de 43 pacientes com diagnóstico de CaP entre 2004-2007, onde usados ​​para este estudo. Até o final de 2013, 22 desses pacientes morreram de APC, 10 morreram de outras doenças e 11 ainda estavam vivos. Todas as biópsias foram armazenados na instalação biobanco Aleris Medilab em condições adequadas para amostras FFPE para pelo menos 6 anos antes da sua utilização nesta análise.

A preparação da amostra e RNA extração

O processo de preparação da amostra antes a extração de RNA é descrito passo a passo como se segue

etapa a:.. Seccionamento de amostras FFPE

biópsias por agulha núcleo FFPE foram cortadas em seções separadas e foram anexados em lâminas de vidro fosco essencialmente de acordo com histopatológicos protocolos de rotina [8], excepto que a DNase /RNase água livre foi usada e o passo de fusão de parafina depois de secções de secagem foi omitido. A primeira seção qualificada de espessura 5 mm foi H E manchado [9], e usado para a marcação região do cancro por patologistas. secções sequenciais de 10 mm de espessura após a primeira amp; H E lâmina corada gerado no passo (a) foi digitalizados. A imagem digitalizada foi ampliada até 20 vezes, a área de câncer foi marcado, e calculada usando a imagem software de visualização (Visualizador de Imagens, Ventana Medical Systems, Inc.). Além disso, os primeiros e segundos padrões de Gleason foram anotados. Em seguida, as marcas da área de câncer foram copiados a partir da imagem e marcado de volta para o original amp H E manchado lâmina de vidro usando um microscópio, servindo como um “mapa” que guiou as células cancerosas procedimento de raspagem

Etapa c: Raspagem. área de câncer

Usando o H marcados . e lâmina de vidro manchado como um mapa, foram identificadas as áreas correspondentes das seções FFPE 10 mm de espessura corados. Para cada padrão de Gleason, uma área de pelo menos 10 mm

2 de células de cancro contendo tecido foi raspada para DNase /RNase tubos de centrífuga de micro livres usando um novo bisturi descartável para cada amostra a ser extraída. A maioria das amostras de raspados continha células epiteliais% cancerosas mais de 70.

medições de exemplo

Para cada medição de amostra, material tumor de um tipo de padrão patológico (padrão de tumor Gleason ou padrão benigno) foi recolhido, por vezes, a partir de biópsias diferentes do mesmo paciente, para um frasco para análise posterior. Isto significa que os patologistas recolhido áreas cancerosas com o mesmo tipo histológico das células de uma ou mais biópsias para a colheita de tecido suficiente para o procedimento analítico. A percentagem de material de tumor em cada amostra contendo células de cancro foi avaliado e confirmado por patologistas usando imagens digitalizados de H E lâminas coradas. Definimos uma amostra de cancro como uma medida numa amostra de tumor com uma grande fracção de células cancerosas, e uma amostra benigna (a partir do mesmo paciente de cancro da próstata incluídos no estudo) como uma medida numa amostra de tecido da próstata contendo apenas células benignas.

No total, 127 medições de amostras válidas derivadas de 43 pacientes foram produzidos. Para esses 43 pacientes, medimos 97 amostras de câncer. Para 30 dos 43 pacientes, uma amostra benigna por paciente foi coletado e medido, além de suas amostras de câncer (Tabela 1).

Entre as medidas de amostras de câncer, 33 dos 43 pacientes tiveram dois amostras de câncer foram avaliados, os pacientes restantes tiveram três ou quatro amostras de câncer avaliados. De 41 pacientes havia uma amostra de câncer primário e pelo menos uma amostra de cancro secundário disponível. Os restantes 2 pacientes tiveram duas amostras de cancro primário muito semelhantes no que diz respeito ao padrão de Gleason (Tabela 1).

extracção de ARN total

O ARN total foi extraído de amostras de tecido raspado utilizando a alta FFPE puro RNA Micro Kit (Roche Applied Science /Roche Diagnostics GmbH, número de catálogo: 4823125001) de acordo com as instruções do fornecedor. Extraído RNA foi imediatamente submetido à análise qRT-PCR.

One-Step qRT-PCR reação

Os níveis de expressão de IGFBP3, F3, VGLL3 e GAPDH foram medidos usando uma versão de pré-produção de o kit Prostatype qRT-PCR comercial, (Chundsell Medicals AB, Suécia). Esta é uma de quatro em multiplex em uma etapa kit de qRT-PCR, o qual é desenhado para medir os níveis de três genes de biomarcadores de IGFBP3, F3, e VGLL3, normalizados para o nível do gene GAPDH expressão de expressão de genes (gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase ) em RNA extraído de amostras de tecido de cancro da próstata humano FFPE. A informação sobre a sequência de sondas e de iniciadores tem sido relatado previamente [4]. ARN total extraído pode ser utilizado para esta reacção de qRT-PCR imediatamente mesmo sem quantificar a entrada de ARN de acordo com as instruções de utilização. O kit contém ainda controlos positivos e negativos, que foram ensaiadas em conjunto com cada lote de amostras de tecido de cancro da próstata. As medições foram realizadas utilizando Roche LightCycler 480 instrumento II, uma plataforma de qPCR em que um método de compensação de cor foi executado antes de realizar a análise qPCR.

A análise dos dados

Os valores Ct de todos os lotes de amostras foram extraídos de acordo com as instruções dos fabricantes (Roche e Chundsell Medicals). Um lote de experimentos qRT-PCR foi considerada válida apenas se controlos positivos e negativos eram válidos. As amostras com valor GAPDH Ct de ≥29.0 foram excluídos devido a baixa quantidade de RNA extraído. Os níveis dos genes IGFBP3, F3, e VGLL3 expressão foram normalizados para que de GAPDH e foram apresentados como o valor de Ct Delta, que se correlaciona inversamente com o nível de expressão do gene. Estes valores Ct delta foram utilizados para uma análise estatística do desempenho positivo amostra de controlo. Os valores delta Ct foram ainda utilizadas para formar Diff (delta Ct) = Max (valor de Ct Delta) -min (delta valor Ct) para duas amostras diferentes de tumor obtidos a partir do mesmo paciente. Os histogramas e diagramas de dispersão foram usadas na análise de Diff (delta CT).

Resultados

Para a maioria dos pacientes (76,7%), duas amostras de cancro diferentes foram avaliados. Os demais pacientes tiveram três ou quatro amostras de cancro diferente avaliadas (Tabela 1). A maioria dos pacientes foram testados em 2 medições das amostras, contendo cada um dois padrões de Gleason. A distribuição dos pacientes de acordo com a pontuação de Gleason mostra que mais de 80% dos pacientes tiveram pontuação de Gleason ímpares, tais como 3 + 4/4 + 3 (7) ou 4 + 5/5 + 4 (9). Na maioria (79,4%) das medições de amostras de cancro padrões de tumores primários e secundários, do material de tecido continham as células epiteliais mais do que 90% do cancro. As medições restantes de padrões de tumores primários e secundários tinham proporções maiores de células do estroma, em alguns casos mesmo mais do que 40% de células do estroma.

As variações nos níveis de expressão dos três genes de assinatura (IGFBP3, F3, e VGLL3 ) através de múltiplas amostras cancerosas do mesmo paciente, em particular nas medições das amostras, representados cancro que o primeiro e os segundos padrões de Gleason, foram utilizados para avaliar o impacto do operador no resultado reportado. As diferenças no delta valores Ct dos genes assinatura de medições de amostras colhidas no mesmo paciente foram utilizados para caracterizar a variabilidade genética nível de expressão. Por exemplo, para um determinado paciente, diferença de delta valor Ct da F3 equivale delta Ct F3 da primeira amostragem delta menos Ct F3 da segunda amostragem. Os valores delta Ct para amostras de cancro primário estão apresentados na Tabela S1.

De modo a ilustrar a distribuição do delta diferenças de valores Ct (Dif (delta Ct)), foram geradas histogramas de diferenças de frequência para cada um dos três níveis de expressão de “genes obtidos em medições de amostras para um determinado paciente (Figura 1). Um histograma representa frequências tabelados, mostradas como retângulos, erigidas em intervalos discretos (ou seja Diff (delta Ct)), cada um com uma área proporcional à frequência das observações nesse intervalo. Neste contexto, com um aumento de 1,0 em Diff (delta Ct) para cada intervalo, a frequência das observações foi contado em cada intervalo, é igual à área de um retângulo.

A mesma definição de medidas de amostras como descrito na secção Materiais e Métodos são aqui utilizados. Os níveis de expressão de três genes foram medidos como os valores Ct Delta (isto é, valor de Ct de valor Ct do gene de GAPDH-). As diferenças nos níveis de expressão de genes entre diferentes amostras provenientes do mesmo paciente são apresentados como Diff (delta Ct), = max (delta valor Ct) min (valor Ct delta). Estimou-se a similaridade dos níveis de expressão de genes em biópsias de tumores, comparando os valores dos três genes “Diff (delta Ct) em amostras de câncer primário e secundário a partir de 43 pacientes (painéis A, B e C) e apresentando os resultados sob a forma de histogramas de frequência. Entre estes pacientes, 30 pacientes foram também medidos quanto à expressão do gene na sua acompanha amostras de tecido benigna da próstata, e os resultados são apresentados nos painéis direitos valores (Painéis D, E e F), como histogramas de Dif frequência (delta CT) entre o primário amostras de cancro e amostras benignas. As contagens de frequências para diferenças de valores delta Ct dentro ou 0-1,0 1,0-2,0 intervalo eram dramaticamente mais elevados do que aqueles com diferenças maiores do que 2,0 para IGFBP3 e F3, como mostrado nos painéis da esquerda de comparação. Em comparação com os painéis da esquerda, os valores Diff (delta Ct) nos painéis à direita apresentaram maior freqüência nos intervalos de valores maiores Diff (Ct delta) para todos os três genes, mas particularmente para VGLL3.

Figura 1A, B, C mostra histogramas de Diff (delta Ct) para os três genes diferentes quando se comparam padrões primárias e secundárias do tumor Gleason. Para IGFBP3, 34 de 43 pacientes (79%), o Diff (delta Ct) no prazo de medidas foi inferior a 2,0. Para F3, 32 de 43 (74%) pacientes tiveram Diff (delta Ct) inferior a 2,0. Para VGLL3, apenas 20 (46,5%) pacientes apresentavam Diff (delta Ct) ≤2.0, 14 (32,5%) pacientes tinham Diff (delta Ct) valores no intervalo 2,0-4,0 e os restantes 9 pacientes tinham diferenças no delta valor Ct superior 4. observou-se ainda que os valores médios de Ct de IGFBP3, F3 e VGLL3 de todas as medições de amostras 97 de cancro foram de 28,7, 28,3 e 33,2, respectivamente, o que significa que VGLL3 geralmente tinham níveis de expressão mais baixos em comparação com IGFBP3 e F3 em amostras de cancro da próstata.

Em paralelo com as medidas da amostra, a amostra de controlo positivo foi medido 40 vezes. Para IGFBP3 medições de controlo positivo, o delta valor Ct relatado foi em média 3,68, o desvio padrão foi de 0,42, e os valores max /min foram 4,37 /2,62. Para F3, os valores correspondentes foram de 1,87; 0,37; 2,61 /0,71, e para VGLL3, eles foram 5,12; 0,36; 5,91 /3,76. Com base nisso, a variação típica de valores de Ct Delta de execução para executar devido ao ensaio, como tal, foi estimada como sendo de dois desvios padrão, ou seja, para IGFBP3 0,84, 0,74 e 0,72 para F3 para VGLL3.

Figura 1D , E, F mostra histogramas de Diff (delta Ct) para os três genes de assinatura quando se comparam padrão de tumor primário com o tecido benigno. Nesta comparação, IGFBP3 consistentemente desde valores semelhantes ao Diff (delta Ct) dentro das amostras de câncer primário e secundário de cada paciente (Figura 1D). De fato, o padrão primário foi quase igualmente semelhante ao padrão benigna como para o padrão secundário. Para F3, a semelhança primário-benigna era menos do que a semelhança primário-secundário (Figura 1E). VGLL3 mostraram grandes diferenças Diff (delta CT) entre o padrão de tumor Gleason primário e a amostra benigna (Figura 1F).

Uma forma alternativa de ilustrar as diferenças na expressão genética entre os padrões de tumores primários e secundários é fazer scatterplots delta de valores de Ct de medições das amostras de cancro (Figura 2). Neste ponto de vista, é claro que a comparabilidade é bom, em particular para os valores Ct baixo delta, com a exceção de alguns valores discrepantes (círculos vermelhos). O menor grau de comparabilidade para VGLL3 é principalmente devido a diferenças em valores Ct alta delta significando níveis de expressão relativamente baixos (linha tracejada quadrados).

A fim de medir o quão semelhantes as amostras de cancro primário e secundário foram, em termos de os níveis de expressão de genes, e ainda mais para a análise outlier, geramos gráficos de dispersão dos níveis das duas medições de expressão de genes. Os níveis dos três genes assinatura de expressão são apresentados como valores de Ct Delta usando a mesma equação, como descrito na legenda da Figura 1. As medições das amostras, cancro primário e secundários referem-se às duas medições que contém o primeiro e segundo padrões mais comuns de Gleason. Os dois tipos de amostras de câncer de 43 pacientes são comparados usando gráficos de dispersão. Os círculos vermelhos indicam os valores extremos, que foram ainda investigadas em relação grandeza de entrada do tecido e percentagens de células epiteliais câncer. Tracejada quadrado linha indica medições VGLL3 que tiveram alta delta valores Ct e reprodutibilidade pobre.

Os valores extremos nos gráficos de dispersão dos três genes na Figura 2 (círculos vermelhos) foram investigados, verificando a entrada de tecidos, as percentagens de células cancerosas de áreas marcadas ou os padrões histopatológicos especiais das áreas cancerosas selecionados. A maioria dos valores aberrantes foram obtidos a partir de amostras que tiveram uma das seguintes propriedades: 0,1 mm

3 de entrada do tecido, contendo 30% de células do estroma ou que representa infiltrante /tipo de cancro invasivo, em que as células cancerosas normalmente são encapsulados por células do estroma. Este tipo de tecido foi encontrado em 4 de 5 discrepantes para IGFBP3, por F3 3 de 5 e para VGLL3 4 de 6. Um paciente de outliers produzidos em todas as três comparações, e outro paciente valores extremos, tanto para F3 e VGLL3 produzido. discrepantes restantes não puderam ser explicadas.

Discussão

Este trabalho avalia o impacto do operador na escolha de qual biópsia para ser usado para análise de expressão gênica. A fim de minimizar a variação global de resultados de testes em ensaios de expressão de genes, é importante para avaliar a variabilidade induzida por decisões subjectivas e, assim, a possibilidade de reduzir a variação através de procedimentos práticos melhoradas. Na verdade, este estudo de uma assinatura de expressão de três genes no cancro da próstata incluída uma grande percentagem (80%) dos pacientes com estranho classificação de Gleason, tais como 3 + 4/4 + 3 (ou seja, 7) ou 4 + 5/5 + 4 ( ou seja, 9), em que consideramos o risco de erros do operador para ser maior.

os genes IGFBP3 e F3 mostraram diferenças limitadas nos níveis de expressão dentro de amostras de células epiteliais câncer, quando se comparam delta valores Ct de diferentes biópsias proveniente da mesmo paciente. Dentro de medições de tecido de cancro que representam histopatologicamente diferente determinados padrões de Gleason, a variação típica era 1-2 delta unidades de valor Ct. Ao comparar uma biópsia com células benignas com que o padrão de Gleason primário, observou-se uma variação semelhante para IGFBP3 e variação ligeiramente maior para F3. Uma vez que a variação de controlo positivo era 0,7-0,8 unidades delta valor de Ct, a escolha de biópsia é uma fonte de erro e variação de magnitude similar à do próprio ensaio.

A comparação dos valores Ct Delta a partir de amostras de tecidos de origem a partir de o mesmo paciente pode ser realizada de muitas maneiras. Com acesso a múltiplas biópsias de apenas 43 pacientes, o número de métodos adequados para comparar a produção é, infelizmente, limitada. Nós escolhemos usar histogramas para apresentar as diferenças, porque este fornece uma ilustração clara da distribuição das diferenças. Por exemplo, na Figura 1A é evidente que a maior parte das delta Ct diferenças quando se comparam amostra de cancro primário e secundário é entre 0 e 2 unidades delta CT, acompanhados de alguns valores aberrantes. Qualquer tentativa de estimar a concordância por meio de métodos estatísticos seria fortemente influenciada por valores extremos, daí a escolha da representação histograma dos resultados, acompanhados por gráficos de dispersão.

As medições de níveis de expressão VGLL3 mostrou maior variação entre as biópsias, que principalmente foi causada por um nível de expressão baixo em células de cancro da próstata em comparação com os outros dois genes de assinatura. O delta média do Ct de VGLL3 em ensaios de controlo positivo mostrou a sonda e iniciadores para VGLL3 são adequadamente funcional, o que significa que o nível de expressão VGLL3 é realmente baixo no tecido da próstata. quantificação exacta de tais níveis baixos de expressão pode provavelmente ser melhorada pelo aumento da entrada de material de tecido de cancro, de modo a melhorar o sinal. Outros factores que podem influenciar a variabilidade de medições VGLL3 são variações no teor em células do estroma nos diferentes amostras de biópsia ou a degradação de ARNm não uniforme, o que significa que VGLL3 pode sofrer de degradação mais extensa do que os outros genes testados ou pode ser diferentemente distribuídos entre epitelial e várias células estromais.

medições da assinatura do gene em tecido benigno revelou que IGFBP3 fornecida de forma consistente valores semelhantes aos do tecido de tumor a partir do mesmo paciente, F3 permaneceu semelhante, mas com variação maior, e VGLL3 era altamente variável. Uma vez que os tecidos de câncer utilizados na medição continham níveis variados de células do estroma, este tipo de análise é importante para aprender a guiar o operador na seleção biópsia. Em medições de ambos IGFBP3 e F3, os padrões de tumores primários e secundários fornecidos resultados que estavam de acordo e, para estes casos Sabia-se que apenas uma pequena fração das amostras de tumor de fato continham células estromais de expressão gênica. Desde F3 perderam partes do comparabilidade nível de expressão em direção único tecido benigno, é importante ter uma grande fracção de células de tumor na amostra de biópsia utilizado para análise da expressão do gene. O nosso melhor estimativa corrente que é cerca de 2/3 do material tecido deve conter células epiteliais de cancro para F3 para produzir resultados comparáveis. Para VGLL3, a comparabilidade é pobre, mas não se sabe se isso está relacionado a este gene a ser diferente expresso em tecido tumoral benigna contra, em células cancerosas epiteliais contra células do estroma ou se este é simplesmente um efeito das dificuldades técnicas na medição de baixa expressão níveis.

uma observação importante é que o impacto da escolha do operador de que a biópsia é a principal em termos de padrão de tumor (Gleason) não é uma fonte dominante do erro para os dois genes que foram altamente expressos, ou seja, IGFBP3 e F3. Isto significa que uma análise da expressão de genes usando IGFBP3 e F3 será insensível diferenças da classificação de Gleason para moderar. Além disso, para IGFBP3 e F3 o processo é insensível à fracção de células do estroma, enquanto aproximadamente 2/3 do material do tecido é células cancerosas. Estes dois aspectos são importantes fatores que contribuem para uma avaliação verdadeiramente objetiva expressão genética do paciente, que quando combinado com parâmetros clínicos tradicionais, como a pontuação de Gleason pode contribuir para declarações prognósticos mais precisos. Outra observação importante é que uma vez que a análise das amostras que representam os padrões primários e secundários expressão é semelhante para IGFBP3 e F3, não existe necessidade de mantê-las separadas, mas todo o material do tumor a partir de uma única biópsia mais provável pode ser recolhido para um frasco para análise da expressão do gene. Para VGLL3, as grandes diferenças mais observados ocorreram em baixos níveis de expressão. Somente após o procedimento analítico foi alterada para lidar com tais valores baixos, o perfil de desempenho para VGLL3 através de uma variedade de padrões de tumor podem ser investigadas.

Muitas vezes, quando um painel de expressão do gene de prognóstico ou diagnóstico foi desenvolvido com grande e -prima (frescas ou congeladas) de tecido fresco a partir de amostras cirúrgicas do desafio, determinará em transferir o ensaio para lidar com amostras, que estão disponíveis na rotina clínica, em particular utilizando amostras de biópsia contendo áreas cancerosas pequenas. secções de tecido FFPE são comuns em diagnósticos de cancro de rotina, mas que contêm ADN de qualidade inferior /ARN devido aos passos de preparação dos tecidos duros e armazenamento a longo prazo. Este relatório ilustra que para os dois genes altamente expressos, a escolha do espécime de tecido a analisar tem pequena (se houver) impacto no resultado da análise, que é estimulante para o caso geral de transferência de ensaios de expressão de gene a partir do material de tecido fresco de material de FFPE .

para efeitos da utilização do IGFBP3, F3, VGLL3 perfil de expressão gênica por fornecer informações suplementares sobre o prognóstico da doença do cancro da próstata do paciente individual, os dados de ensaio válido é necessário. Este relatório conclui que a dependência do operador não será uma fonte dominante de erro para IGFBP3 e F3 neste perfil de expressão gênica, que é de importância crítica para a aplicação prática do ensaio de expressão gênica em uso rotineiro. O perfil de expressão gênica está actualmente avaliada em material de paciente com câncer de próstata por sua capacidade para ajudar na tomada de decisões de prognóstico, e os resultados desse estudo serão relatados em um momento posterior.

Se o achado relatado neste relatório provar geral, a evidência de apoio para a hipótese subjacente ‘stemness’ na iniciação e progressão de (próstata) câncer seria reforçada. À medida que os níveis de expressão do gene de IGFBP3 e F3 foram independente dos graus histológicos na área do cancro da próstata, o mesmo que na área benigna, o assinatura gene pode reflectir mecanismos patogénicos subjacentes de cancro da próstata. Com base nesta observação, as transferências de ensaio teria uma alta taxa de sucesso na prática clínica.

Em resumo, nós relatamos que a escolha do operador dos quais biópsia para realizar análise de expressão gênica em não ter qualquer impacto dominante os resultados das medições de IGFBP3 e F3 de expressão de genes em células epiteliais do cancro. A análise dos níveis de expressão do gene VGLL3 beneficiariam de optimização devido a níveis de expressão geralmente baixos.

Informações de Apoio

Tabela S1.