Abstract

Objectivo

A genisteína é uma isoflavona da soja que tem atividade antitumoral tanto in vitro como in vivo. Tem sido demonstrado que a genisteína inibe muitos tipos de cancros incluindo o cancro da próstata (CaP), regulando diversas vias de sinalização celular e microARNs (miARNs). Estudos recentes sugerem que as longas RNAs não-codificantes (lncRNAs) também estão envolvidos em muitos processos celulares. No momento não há relatos sobre a relação entre gensitein, miRNAs e lncRNAs. Neste estudo, nós nos concentramos em miRNAs, lncRNA que são regulados por genisteína e investigou seu papel funcional em CaP.

Método

Microarray (GE SurePrint G3 Humano 8 × 60K) foi utilizado para a expressão profiling de genisteína tratada e controlar células PCA (PC3 e DU145). ensaio funcional (ensaios de proliferação celular, migração, invasão, apoptose e ciclo celular) foram realizadas com o CaP linhas celulares, PC3 e DU145. Tanto in vitro e modelos in vivo (ratinho nu) foram usadas para ensaios de crescimento. ensaios de repórter de luciferase foram utilizados para a ligação de miR-34a para HOTAIR.

Resultados

lncRNA perfis mostraram que HOTAIR foi altamente regulada por genisteína e sua expressão foi maior em linhas celulares de CaP resistente à castração que em células da próstata normais. Knockdown (siRNA) de HOTAIR diminuição da proliferação de células APC, migração e invasão e apoptose induzida e interrupção do ciclo celular. miR-34a também foi regulada por genisteína e pode atingir diretamente HOTAIR em ambas as células PC3 e DU145 APC.

Conclusões

Nossos resultados indicaram que a genisteína inibiu o crescimento de células CaP através de down-regulação da HOTAIR oncogênico, que também é alvo de supressor de tumor miR-34a. Estas descobertas melhorar a compreensão de como a genisteína regula lncRNA HOTAIR e miR-34a em CaP

Citation:. Chiyomaru T, Yamamura S, Fukuhara S, Yoshino H, Kinoshita T, Majid S, et al. (2013) de genisteína inibe o cancro da próstata crescimento celular por Segmentação miR-34a e Oncogênicos HOTAIR. PLoS ONE 8 (8): e70372. doi: 10.1371 /journal.pone.0070372

editor: Arun Rishi, Wayne State University, Estados Unidos da América

Recebido: 23 Abril 2013; Aceito: 17 de junho de 2013; Publicação: 01 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Chiyomaru et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado pelo Centro Nacional de pesquisa de Recursos dos Institutos Nacionais de Saúde, através Grant Número R01CA160079, R01CA138642, T32DK007790 e VA Mérito Review and VA Projeto de Programa. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a genisteína é uma isoflavona de soja na dieta. A sua estrutura é semelhante à da 17-β-estradiol humana causando estrogénico e /ou efeitos antiestrogénicos [1]. A genisteína é também um inibidor da tirosina proteína quinase [2] e possui efeitos anti-tumor in vitro e in vivo. Tem sido demonstrado que a genisteína inibe muitos tipos de cancros incluindo o cancro da próstata (CaP) [3], [4], através da regulação de várias vias de sinalização celular, tais como o Wnt, Akt e vias de JAK /STAT [5] – [8].

a evidência recente sugere que os ARN não codificantes (ncRNAs) estão envolvidos em muitos processos celulares. microARNs (miARNs), classe de pequenos ncRNAs cerca de 22 nucleótidos de comprimento, de função como reguladores negativos de mRNAs alvo transcricional e pós-transcricionalmente [9]. Sabe-se que miARNs regular até dois terços do genoma humano [10], e desempenham um papel importante em numerosos processos biológicos, incluindo o desenvolvimento, diferenciação, proliferação, a angiogénese, o metabolismo e pluripotência [11], [12]. Tem sido relatado que a genisteína a expressão aumentada do supressor de tumor de miR-146a, fazendo com que a inibição do EGFR e do NF-kB via de [13], [14]. miR-27a tem sido relatada como sendo um miARN oncogénicos regulados por genisteína e regula a sinalização de VEGF por segmentação ZBTB10 [15], [16]. Os nossos estudos anteriores mostraram que o tratamento genisteína significativamente regulada negativamente a expressão oncogénica de miR-151 que tem como alvo directamente Sox17 ARHGDIA e [17]. Sox17 foi relatado como sendo um gene supressor de tumor que inibe a sinalização de Wnt /β-catenina tanto por segmentação β-catenina e o factor de células T (TCF) /factor de proteínas linfóides potenciador (LEF) [18] – [20]. ARHGDIA regula negativamente a família Rho de GTPases Rho (, Rac e CDC42) [21] que estão envolvidos na via de sinalização Wnt [22]. Nós também descobrimos que a genisteína down-regula a RAC1 e EP300 genes que são importantes reguladores da angiogênese mediada pelo VEGF [23], [24] e do gene EGFR por up-regulação miR-574-3p [25].

ncRNAs são divididos em duas classes principais com base no tamanho transcrição; pequena ncRNAs e longo ncRNAs (lncRNAs). lncRNAs são em geral definidos como genes de ARN maiores que 200 nucleótidos que não têm proteína potencial de codificação. sequenciamento em larga escala de bibliotecas de cDNA e sequenciamento de próxima geração indicam que lncRNAs em mamíferos número na casa das dezenas de milhares. Até agora, apenas 126 lncRNAs humanos foram funcionalmente anotado em lncRNA base de dados [26]. Assim, não há relatos sobre a relação entre gensitein e lncRNAs.

O RNA transcrito antisense HOX (HOTAIR) gene está localizado dentro do aglomerado de genes homeobox C (HOXC) no cromossomo 12 e codifica s 2,2 kb lncRNA molécula. Este gene é transportado do cromossoma 12 e cromossoma 2 por um componente do Polycomb repressiva Complexo 2 (PRC2) e reprime a transcrição de genes (D homeobox HOXD) [27]. HOTAIR interage com ambos PRC2 e desmetilase específica lisina (1) LSD1 complexos e casais histona H3 lisina 27 e lisina metilação 4 desmetilação para silenciamento de epigenética não apenas HOXD genes, mas também muitos outros genes [28]. Este gene é altamente expresso em vários cancros, tais como cancro da mama, colo-rectal, fígado, pâncreas, e cancro da laringe [29] – [33]. Alta expressão de HOTAIR no cancro da mama é um preditor de metástases e mau resultado [29]. HOTAIR também se pensa ser um biomarcador potencial para a existência de linfonodo metástases no carcinoma hepatocelular [34]. HOTAIR é um factor de prognóstico negativo e actua como um oncogene no cancro pancreático tanto in vitro como in vivo [32]. Portanto, neste estudo, focado no lncRNA HOTAIR que é regulada por genisteína e investigou seu papel funcional em CaP.

Resultados

Efeito da genisteína Tratamento sobre a proliferação, apoptose e ciclo celular em CaP células

Para verificar as características supressores tumorais da genisteína, foi realizada análise de funções. O ensaio MTS mostraram que a proliferação de células foi reduzida por tratamento de genisteína em ambas as células PC3 e DU145 (Fig. 1A). Ensaio de apoptose induzida demonstrado que a genisteína significativamente a apoptose de células DU145 (Fig. 1B). No entanto, não foi observado efeito significativo de apoptose em células PC3. ensaio do ciclo celular demonstraram que o tratamento com genisteína causada /M paragem do ciclo celular G2, em ambas as fases PC3 e DU145 células (Fig. 1C).

(A) A genisteína inibe significativamente a viabilidade celular. A viabilidade celular foi analisada pelo ensaio de proliferação celular MTS após 4 dias de tratamento (25 uM). **, P 0,0001. *, P 0,01. Os dados são apresentados como a média ± SE. ensaio (B) A apoptose por citometria de fluxo. figuras quadrante representativas de controle e genisteína (25 M) células tratadas no PC3 (esquerda) e DU145 (à direita) células. P 0,05. (C) Os valores típicos da análise do ciclo celular de controlo, ou genisteína (25 ^ M) as células tratadas são mostrados. O gráfico de barras mostrada à direita de cada um dos valores representa a percentagem de células em G0 /G1, S, G2 ou fase /M, conforme indicado. * P 0,05

Identificação de genes alvo e vias moleculares reguladas pela genisteína em CaP

Para identificar genes e vias alvo de genisteína em células APC, realizamos perfis de expressão genética. genisteína e células PC3 e DU145 tratados veículo (controlo). A expressão de 918 genes foram significativamente regulada em ambas as linhas celulares (CaP média razão log2 -0.5, Tabela S1). Estes genes foram designados Enciclopédia Kyoto de Genes e anotações Genomas (KEGG) usando análise de enriquecimento singular de GeneCodis. vias significativamente enriquecida em KEGG foram identificadas como «Percursos no câncer”, “ciclo celular”, “Regulamento do citoesqueleto de actina” e “via de sinalização Jak-STAT” (P 0,05, Tabela S2). Estamos focados em ‘Caminho no câncer’ do KEGG e os genes nesta via são destacadas no mapa do KEGG (Fig. S1).

Para determinar a expressão de genes em amostras clínicas APC, realizamos análises de expressão para todos os candidatos alvejar genes envolvidos nos «Percursos no câncer” usando dados de expressão microarray, que foram aprovados pelo Gene Expression Omnibus (GEO). Os níveis de expressão destes genes foram examinados em 47 CaP e 47 amostras de indivíduos normais, como mostrado no diagrama de mapa de calor na Fig. S2. Os genes regulados positivamente em CaP são mostrados em genes vermelho, regulada negativamente são mostrados a azul, enquanto as barras brancas indicam os genes que são expressos em níveis semelhantes em ambos. A partir desta análise, foram identificados vários genes alvos cruciais, incluindo a histona-desacetilase 1 (HDAC1), inibidor de proteína de STAT activada, 3 (PIAS3), tropomiosina 3 (TPM3), factor de transcrição 7-like 2 (de células T específicas, HMG box) (TCF7L2), receptor aril-hidrocarboneto translocator nuclear 2 (ARNT2), a ligação CREB proteína (CREBBP), junção placoglobina (JUP), e v-akt timoma murino viral homólogo oncogene 2 (AKT2).

identificação de lncRNAs Regido pela genisteína em CaP

O SurePrint G3 GE Humano 8 × 60K plataforma de microarray também inclui sondas para lincRNAs. Para identificar os lncRNAs regulados pela genisteína em células APC, realizamos expressão gênica profiling. Cinco lncRNAs foram regulados negativamente em linhas celulares de CaP (média de razão log2 -1.0, Tabela 1) com lncRNA HOTAIR mostrando o maior efeito. Para determinar os níveis de expressão relativos de HOTAIR em células da próstata, foi realizada quantitativa PCR em tempo real utilizando linhas de células não tratadas com CaP e comparou-os com células epiteliais prostáticas normais (RWPE-1). Observou-se que a expressão HOTAIR foi significativamente regulada para cima em linhas celulares de CaP resistente à castração (PC3 e DU145) em comparação com RWPE-1 (células PC3 3,35 vezes, DU145 6,47 vezes) (Fig. 2A). Para confirmar os dados de microarray, foi realizada uma análise por PCR em tempo real quantitativo TaqMan e observou-se que a expressão HOTAIR foi significativamente regulada negativamente com o tratamento de genisteína (Fig. 2B). Assim, nós nos concentramos em HOTAIR porque muitos investigadores relataram que HOTAIR tem uma função oncogénica em vários outros tipos de câncer (mama, fígado, pâncreas, cancro colorectal e carcinoma de células escamosas da laringe) [29] – [33].

( a) Expressão de HOTAIR em linhas celulares de CaP (LNCaP, PC3 e DU145) e células epiteliais de próstata normais (RWPE-1). PCR em tempo real mostraram que os níveis de expressão foram HOTAIR regulados positivamente em linhas celulares de CaP resistente à castração (PC3 e DU145). Os dados são apresentados como média ± SE. *, P 0,05. os níveis de (B) a expressão de HOTAIR após o tratamento com a genisteína (25 ^ M). expressão HOTAIR diminuiu 30-40% em células genisteína tratado em comparação com os controles. expressão HOTAIR foi normalizado para GAPDH. *, P 0,05. (C) A expressão do miR-34a em linhas celulares de PCA (PC3 e DU145) e células epiteliais de próstata normais (RWPE-1). PCR em tempo real mostraram que os níveis de expressão de miR-34a foram regulados negativamente em linhas celulares de CaP resistente à castração (PC3 e DU145). expressão de miR-34a foi normalizada para RNU48. (D) Os níveis de expressão de miR-34a após o tratamento com a genisteína (25 ^ M) em células DU145. P . 0,05

Regulamento do HOTAIR expressão em linhas celulares de CaP por miR-34a

Recentemente, foi relatado que alguns miRNAs regulam a expressão de lncRNAs [35] – [37]. Para procurar potenciais miRNAs que regulam HOTAIR, utilizamos o algoritmo miRcode. Em vários miRNAs candidatos segmentação HOTAIR, nós nos concentramos em miR-34a desde o nosso laboratório foi previamente funciona como um supressor de tumor relatado e é regulada para baixo em tecidos CaP [38]. Para determinar os níveis de expressão relativos de miR-34a em células da próstata, foi realizada quantitativa PCR em tempo real utilizando linhas celulares de PCA (PC3 e DU145) e comparou-os com células epiteliais prostáticas normais (RWPE-1). Observou-se que a expressão de miR-34a foi significativamente regulada para baixo em linhas celulares de CaP resistente à castração (PC3 e DU145) em comparação com RWPE-1 (células PC3 0,22 vezes, DU145 0,14 vezes) (Fig. 2C). Para procurar o efeito de genisteína a expressão de miR-34a, foi realizada uma análise por PCR em tempo real quantitativo TaqMan e observado que a expressão de miR-34a foi significativamente regulada para cima com o tratamento de genisteína em células DU145 (1,36 vezes) (Fig. 2D) .

de modo a confirmar a ligação de miR-34a a HOTAIR, realizamos ensaios de repórter de luciferase. HOTAIR tem um local de ligação previsto para o miR-34a (Fig. 3A) que foi clonado num vector de ensaio de repórter de luciferase. Os ensaios de repórter de luciferase demonstrado que o miR-34a diminuiu as actividades de luciferase relativas do tipo selvagem vetor (Fig. 3B). A mutação dos locais de ligação de miR-34a putativos também diminuiu a resposta a miR-34a, indicando que o miR-34a liga-se directamente ao HOTAIR. A análise quantitativa por PCR em tempo real mostraram que os níveis de expressão de HOTAIR em PC3 e DU145 foram reprimidos nos transfectantes de miR-34a em comparação com os controlos (Fig. 3C).

(A) putativo de ligação 34a e miR- locais mutados em HOTAIR. Os ensaios (B) repórter de luciferase usando vectores que codificam para sítios de ligação putativos. células PC3 e DU145 foram transientemente transfectadas com precursora pré-miR miARN ou um controlo negativo, seguido por transfecção transiente com o vector base ou plasmídeos repórter de tipo selvagem ou plasmídeos mutados para 24 horas. actividade repórter foi medida por ensaio de luciferase e normalizada para a actividade de luciferase de Renilla. Os dados são apresentados como a média ± SE. *, P 0,05. (C) O nível de expressão foi determinado HOTAIR por quantitativo em tempo real análises de PCR após a transfecção imita com miR-34A e controlo negativo em linhas celulares de PCA (PC3 e DU145). expressão HOTAIR foi normalizado para GAPDH. *, P . 0,05

in vitro e in vivo Efeito de HOTAIR da ACP proliferação celular, migração e invasão

Para examinar o papel funcional da HOTAIR, realizamos deficitária estudos de função utilizando si-RNA knockdown com células PC3 e DU145. Nós inicialmente confinado que a expressão de HOTAIR foi marcadamente reprimidos em transfectantes SI-ARN em comparação com os controlos (Fig. 4a). A proliferação celular (Fig. 4B) e a cicatrização de feridas de ensaio (Fig. 4C) mostrou uma inibição significativa em transfectantes Si-HOTAIR em ambas as células PC3 e DU145 em comparação com os transfectantes de controlo. ensaio de invasão (Matrigel) também mostraram que o número de células invasoras foi significativamente diminuído em transfectantes SI-HOTAIR em comparação com os seus homólogos de controlo (Fig. 4D). Para confirmar o efeito de HOTAIR na tumorigenicidade in vivo, HOTAIR siRNA e células DU145 Si-controlo-transfectadas foram injectados subcutaneamente em ratinhos nus. Observamos que knock-down de expressão HOTAIR inibiu a formação de tumor de células DU145 in vivo (Fig. 4E). Estes resultados sugerem que HOTAIR desempenha um papel importante na progressão de células CaP.

(A), os níveis de expressão HOTAIR em linhas celulares de CaP (PC3 e DU145) foram determinadas por PCR em tempo real às 96 horas após a transfecção transiente de siRNA . a expressão do gene foi normalizado para GAPDH. Os dados são apresentados como a média ± SE. **, P 0,0001. *, P 0,0005. (B) Knockdown de HOTAIR inibe significativamente a viabilidade celular. A viabilidade celular foi analisada pelo ensaio de proliferação celular MTS 96 horas após a transfecção transitória. (C) Queda de HOTAIR inibe significativamente a migração celular. Após a transfecção (48 horas), uma ferida foi formado por raspagem e medidos após 24 horas. Imagens representativas de ensaio de cicatrização de feridas são mostrados em 200 × ampliação. **, P 0,0001. (D) Queda de HOTAIR diminuiu significativamente a invasão celular. Imagens representativas de ensaio de invasão são mostrados em 200 × ampliação. **, P 0,0001. (E) Imagens representativas de tumores em ratinhos nus 5 semanas após a injecção subcutânea de linhas transfectadas HOTAIR siARN DU145 celulares ou linhas de células de controlo e decurso de tempo do crescimento do tumor.

HOTAIR Influencia Celular e Apoptose ciclo celular nas as células CaP

ensaio

a apoptose demonstrou que knock-down de HOTAIR apoptose induzida significativamente em ambas as células PC3 e DU145 (Fig. 5a). ensaio do ciclo celular mostraram que knock-down de HOTAIR causada /H de fase a paragem G2 do ciclo celular em células PC3 (Fig. 5B), enquanto as células DU145 transfectadas teve um aumento significativo na fase S do ciclo celular.

( A) ensaio de apoptose utilizando citometria de fluxo. figuras quadrante representativas de controle e si-HOTAIR trataram células no PC3 (superior) e DU145 células (mais baixos). **, P 0,005. *, P 0,05. (B) Os valores típicos de análise do ciclo celular de controle, ou células tratadas si-HOTAIR são mostrados. O gráfico de barras mostrada à direita de cada valor representa a percentagem de células em G0 /G1, S, G2 ou fase /M, conforme indicado. **, P 0,001. *, P . 0.005

Discussão

genes codificadores de proteínas compreendem apenas uma pequena parte do genoma, eo resto consiste de ncRNAs, íntrons e /ou outras sequências às quais nenhuma função ainda não foi atribuído [39]. NcRNAs (miARNs e lncRNAs) têm mostrado desempenhar um papel crítico na regulação de processos celulares, tais como o crescimento celular e a apoptose em células normais e malignas. Os papéis de miARNs em cancros têm sido extensivamente investigada e, recentemente, muitas lncRNAs têm sido associados com o desenvolvimento e progressão do cancro. A expressão de lncRNAs muda freqüentemente durante a transformação maligna e ncRNAs estão emergindo como moléculas chave no cancro humano, com o potencial para servir de novos marcadores e alvos terapêuticos. No entanto, até à data, o papel de apenas alguns lncRNAs foram caracterizadas em CaP. De alto rendimento de sequenciação mostrou que associada a cancro da próstata ncRNA transcrição 1 (PCAT-1) é um regulador específico da próstata de proliferação celular em APC e um alvo de PRC2 [40]. Prostate gene do câncer de expressão do marcador 1 (PCGEM1) polimorfismos podem contribuir para CaP risco [41]. Expressão de PlncRNA-1 é significativamente mais elevada em APC e esta lncRNA regula a proliferação celular e a apoptose através de direccionamento do receptor de androgénio [42]. Neste estudo, nós nos concentramos em lncRNAs regulados pela genisteína em células APC e identificados HOTAIR no perfil desses lincRNAs expressão.

Neste estudo, verificou-se alta expressão de HOTAIR em linhas celulares de CaP resistente à castração. Os nossos ensaios funcionais mostraram que knockdown de HOTAIR diminuição da proliferação de células CaP in vitro e in vivo e induziu apoptose. Portanto HOTAIR podem desempenhar um papel funcional no crescimento de células tumorais em CaP. A evidência crescente sugere que HOTAIR regula vias-chave na invasão e metástase do câncer. HOTAIR aumentada capacidade de invasão e metástase do cancro da mama através da indução de reguladores positivos da metástase do cancro (ABL2 caracol, LAMB3 LAMC2 e) de um modo dependente PRC2 [29]. expressão alta HOTAIR é um risco de recorrência após a hepatectomia no carcinoma hepatocelular e pode regular os genes MMP9 e VEGF [34]. Os nossos ensaios funcionais mostraram que knockdown de HOTAIR diminuiu a migração celular e invasão CaP. Nossos dados de matriz mRNA e análise bioinformática também mostraram que a genisteína tem como alvo genes MMP9 e VEGF que são componentes do KEGG ‘Caminho no câncer “. Estes resultados indicam que HOTAIR pode desempenhar um papel importante na progressão CaP.

Como reguladores de genes, miARNs se ligam à 3’UTR do ARNm alvo e pode, individualmente, um número de genes codificadores de proteínas. No entanto, ele continua a ser determinado se miRNAs também pode segmentar lncRNAs. Recentemente, alguns estudos têm descrito as interações entre miRNAs e lncRNAs. miR-29 regula indiretamente expressão de supressor de tumor lncRNA, maternalmente expressa 3 (MEG3), agindo sobre a sua metilação no câncer hepatocelular [35]. miR-671 dirige a clivagem de um transcrito anti-sentido do cerebelo degeneração relacionada com a proteína de 1, 34 kDa (CDR1), que conduz a uma diminuição concomitante na CDR1 [37]. No presente estudo, nós olhamos para ver se a expressão impactos miR-34a lncRNA. O nosso ensaio de repórter de luciferase e em tempo real Os resultados da PCR mostraram que o miR-34a liga-se à sequência de ARNm e para baixo HOTAIR-regula a expressão em linhas celulares HOTAIR APC. Assim, este estudo é o primeiro a demonstrar que o miR-34a visa diretamente HOTAIR tanto em células DU145 CaP PC3 e.

Em conclusão, nossos resultados mostraram que a genisteína inibe o crescimento de células CaP através de down-regulação da HOTAIR oncogênico que é alvo de supressor de tumor miR-34a. Estas descobertas melhorar a nossa compreensão de como a genisteína interage com lncRNA em APC e indica potenciais alvos adicionais para terapia de CaP.

Materiais e Métodos

Cultura celular

linhas celulares CaP Humano, LNCaP, PC3 e DU145 e uma linha de células de próstata epitelial não maligna, RWPE-1, foram comprados na American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). As linhas celulares de CaP foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) numa atmosfera humidificada de 5% de CO2 e 95% de ar a 37 ° C. A linha celular RWPE-1 foi cultivada em meio de crescimento de queratinócitos suplementado com 5 ng /de factor de crescimento epidérmico humano recombinante mL e 0,05 mg /mL de extracto de pituitária de bovino (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). As células subconfluentes (60% -70% confluentes) foram tratados com a genisteína (25 umol /L; Sigma, St Louis, MO, EUA) e as células tratadas com veículo (dimetilsulfóxido) serviu como controlo. meios de comunicação celular e genisteína foram trocadas todos os dias e as células foram cultivadas durante 4 dias.

Extração de RNA

O ARN total foi extraído a partir de linhas de células APC e uma linha epitelial de células de próstata não maligno utilizando um miRNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

microarray

para microarray, o RNA total foi extraído a partir de células PC3 e DU145 tratados com genisteína usando um kit Mini miRNeasy . SurePrint G3 humano GE 8 × 60K Microarray (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA) foi utilizado para perfis de células tratadas genisteína e de controlo de expressão. Os dados de microarranjos atuais foram aprovadas pelo GEO e foram atribuídos GEO número de acesso GSE47657.

Quantitative PCR em tempo real

RNA total extraído foi de transcrição reversa em cDNA de cadeia simples usando um iScript cDNA Synthesis kit (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) e um TaqMan MicroRNA Transcrição reversa kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). a análise por PCR em tempo real quantitativo foi realizado com um sistema de detecção de sequência rápida da Applied Biosystems Prism7500 utilizando TaqMan Universal PCR Master Mix de acordo com o protocolo do fabricante (Applied Biosystems). Os níveis de expressão do RNA foram determinadas usando o 7500 Fast System SDS software versão 1.3.1 (Applied Biosystems). parâmetros de PCR para amplificação foram como se segue: 95 ° C durante 20 segundos, 40 ciclos de PCR a 95 ° C durante 3 segundos, e 60 ° C durante 30 segundos. Todas as reacções foram realizadas num volume de reacção de 10 ul, em triplicado. Os dados foram analisados ​​com o delta-delta método Ct para calcular o fold-change. As sondas TaqMan e iniciadores para HOTAIR (ensaio ID: Hs03296680_s1), GAPDH (ensaio ID: Hs02758991_g1), miR-34a (ensaio ID: 000426), e RNU48 (Ensaio ID: 001006) foram obtidos de Applied Biosystems. GAPDH e RNU48 foram usados ​​como controles internos

A transfecção

HOTAIR siRNA (SASI_Hs02_00380445 e SASI_Hs02_00380446, Sigma) e controle negativo siRNA (D-001810-10;. Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) foram utilizados em experiências de perda de função. Pré-miR precursor de miARN e controlo negativo (Applied Biosystems) foram usadas em experiências de ganho-de-função. células PC3 e DU145 foram transitoriamente transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 reagente de transfecção (Invitrogen), de acordo com as recomendações do fabricante.

proliferação celular, migração e invasão Ensaios

A proliferação celular foi medida utilizando um CellTiter 96 Aqueous One Solution Ensaio de Proliferação celular (MTS) kit (Promega, Madison, WI, EUA) realizada de acordo com as instruções do fabricante. A proliferação celular foi determinada por medições de absorvância a 490 nm utilizando SpectraMAX 190 (Molecular Devices Co., Sunnyvale, CA, EUA). actividade de migração celular foi avaliada por ensaio de cicatrização da ferida. As células foram plaqueadas em placas de seis poços, e as monocamadas de células foram raspadas utilizando uma ponta de micropipeta de P-20. A largura do intervalo inicial (0 h) e a abertura residual 24 horas após a lesão, foi calculada a partir de fotomicrografias. ensaio celular invasão foi levada a cabo usando Boyden modificada secções de Matrigel inserções de filtro de membrana Transwell-pré-revestidas com oito poros micron em placas de 24 poços de cultura de tecidos (BD Biosciences, Bedford, MA, EUA). meio mínimo essencial contendo 10% de FBS na câmara inferior serviu de quimioatractor, tal como descrito anteriormente [43]. Todos os experimentos foram realizados em triplicado.

In vivo Tumor Crescimento

Todos os cuidados com os animais foi de acordo com as orientações do Centro Médico San Francisco Veterans Affairs e o estudo foi aprovado pelo San Francisco VA (número de protocolo: 11-008-01) IACUC. usuários animais tenham concluído programas de treinamento para lidar e trabalhar com camundongos através AALAS (Associação Americana de Ciência Animal Laboratory) antes de experiências com animais. Para o modelo subcutâneo do rato xenoenxerto, células DU145 (5 × 10

6) que foram transfectadas transitoriamente com Si-HOTAIR ou Si-controlo foram suspensas em 100 uL de meio RPMI 1640 e injectada subcutaneamente nos flancos esquerdo e na parte traseira direita de fêmea ratinhos nus, respectivamente. (Estirpe BALB /c nu /nu; Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA, EUA, 5 semanas de idade). Um total de 4 ratinhos nus foram usadas e o crescimento tumoral foi examinado ao longo de 35 dias. O volume do tumor foi calculado com base na largura (x) e o comprimento (y):. x

2y /2, em que x y

Apoptose e Ciclo Celular Ensaios

Fluorescence- a análise de separação de células activadas por (FACS) para a apoptose foi feito 96 horas pós-transfecção, utilizando um Kit de anexina V-FITC /7-AAD (Beckman Coulter, Brea, CA, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante. análise do ciclo celular foi realizada 96 horas após a transfecção. As células foram colhidas, lavadas com PBS frio e ressuspensas em corante nuclear 49,6-diamidino-2-fenilindole (Beckman Coulter). As células coradas foram imediatamente analisados ​​com um citômetro de fluxo (Cell Lab Quanta SC; Beckman Coulter).

Identificação da genisteína genes alvo regulado e análise bioinformática

Para procurar genes que são regulados por genisteína, foi realizada de microarray. Para identificar os processos biológicos ou vias potencialmente regulados pela genisteína, foi realizada a análise GeneCodis [44], [45] através de todos os genes candidatos. Em seguida, identificar as redes entre genisteína e seus genes-alvo, foram analisados ​​e caracterizados os genes em Processo Biológico GO e KEGG Categorias da via. Estes dados foram utilizados para examinar as redes moleculares regulada por genisteína em células humanas. Foram realizadas análises de todos os genes candidatos envolvidos em cada uma das vias que utilizam dados de expressão microarray, que foram aprovados pela GEO e foram atribuídos os números de acesso GEO (GSE29079) a expressão do gene. No Affymetrix Exon Human 1.0 ST Array (Affymetrix, Santa Clara, CA, EUA) conjuntos de dados, foram examinados 47 tecidos APC e 47 tecidos da próstata normais, todos os quais foram coletadas de pacientes que não tinham sido expostos ao neo-adjuvante radioterapia, cytotoxic- terapia endócrina ou antes da operação. Os dados foram normalizados e analisados ​​com o GeneSpring (Agilent Technologies). As análises estatísticas foram realizadas utilizando o teste U de Mann Whitney com cut-off P . 0,05, e os resultados são mostrados como um diagrama de mapa de calor

plasmídeo Construção e ensaios de repórter de Dual-luciferase

para procurar alvos de miRNA de HOTAIR, foi utilizado o algoritmo miRcode (versão 6.2, https://www.mircode.org/). MiRcode fornece previsões humanos miRNA-alvo com base na anotação gene GENCODE abrangente [46], incluindo 10.000 longos genes de RNA não-codificantes. Para o ensaio de repórter de luciferase, PmirGLO Dual-Luciferase miARN alvo vector de expressão utilizado (Promega). As sequências de oligonucleótidos (tipo selvagem) utilizados são mostrados na Tabela S3. Nós também construídos oligonucleótidos mutados para cada um dos oligonucleótidos do tipo selvagem (Tabela S3). Num volume total de 25 ul, 1 ul de cada um de 100 | iM para a frente e o oligonucleótido reverso, 2,5 ul de 10 x tampão de emparelhamento (Tris-HCl a 100, pH 7,5, NaCl 1 M e 10 mM de ácido etilenodiaminotetraacético) e 20,5 uL de água eram incubada a 95 ° C durante três minutos e depois colocado a 37 ° C durante 15 min. Os oligonucleótidos foram ligados no local PmeI-Xbal de pmirGLO Dual-Luciferase miARN alvo vector de expressão. Para o ensaio repórter luciferase, as células CaP foram co-transfectadas com pré-miR precursor miRNA e vectores de expressão pmirGLO Dual-Luciferase miRNA alvo usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) e X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent (Roche Diagnóstico, Basel, Suíça, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. ensaio de repórter de luciferase foi realizada utilizando o Sistema de Ensaio Repórter Dual-Luciferase (Promega), 24 horas após a transfecção.

Análise estatística

A relação entre duas variáveis ​​e os valores numéricos obtidos por RT-tempo real -PCR foram analisados ​​utilizando o teste não paramétrico de Mann-Whitney. Todas as análises foram realizadas utilizando Especialista StatView (versão 4, SAS Institute Inc.). Os dados são apresentados como valores médios ± erro padrão. Na comparação entre as três variáveis, a nível estatístico não ajustada de significância de P 0,05 corresponde a um nível de Bonferroni ajustado de P . 0,0167

Informações de Apoio

Figura S1. genisteína putativo regulada genes em ‘Caminho no câncer “. A genisteína putativo genes regulados (destacado em vermelho), conforme definido pela Kyoto Encyclopedia of Genes e Genomas via (KEGG) e determinada por meio de análise GENECODIS

doi:. 10.1371 /journal.pone.0070372.s001

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Figura S2. O diagrama de mapa de calor dos “Percursos no câncer”. Análise mostra tecidos de câncer de próstata (n = 47) e amostras de próstata normais (n = 47). Cada quadrado representa o nível de expressão de um dado gene em uma amostra individual. O vermelho representa o aumento da expressão e azul representa a diminuição da expressão em relação à expressão normalizada do gene em todas as amostras

doi:. 10.1371 /journal.pone.0070372.s002

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Tabela S1. Genes regulados negativamente pela genisteína

doi:. 10.1371 /journal.pone.0070372.s003

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Tabela S2. Vias reguladas pelas metas de genistein (KEGG anotação)

doi: 10.1371. /Journal.pone.0070372.s004

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Tabela S3. sequências de oligonucleotídeos iniciadores (do tipo selvagem e mutante)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0070372.s005

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Reconhecimentos

Agradecemos ao Dr. Roger Erickson por seu apoio e assistência com a preparação do manuscrito.