Abstract

A família UDP-glucoronosiltransferase (UGT) de enzimas desempenha um papel vital na desintoxicação de substâncias cancerígenas, bem como depuração de fármacos anti-cancro. Nos seres humanos, os membros da família 19 UGT foram identificados e são expressos de uma forma específica para tecidos em todo o corpo. No entanto, os UGTs não tenham sido previamente caracterizado em melanócitos ou melanoma. No presente estudo, UGT2B7, UGT2B10, e UGT2B15 foram identificados como sendo normalmente expressa em melanócitos humanos. As mesmas três membros da família UGT também foram expressas na linha celular de melanoma primário WM115. Nenhuma expressão UGT foi detectada em outra linha de células de melanoma primário, WM3211, ou em qualquer linha de células de melanoma metastático examinados. Estes resultados sugerem que a expressão UGT é perdida durante a progressão do melanoma. Tratamento de WM3211 ou linhas de células de melanoma metastáticas com agentes anti-cancro (incluindo vemurafenib) a expressão induzida de UGT2B7, UGT2B10 e UGT2B15 demonstrando que as células de melanoma reter a capacidade de re-expressam estes mesmos três UGTs. Também foi observado o aumento correspondente na atividade glucuronidação em células de melanoma após o tratamento anti-cancro. Além disso, knockdown de UGT2B7 em WM115 células sensibilizadas destas células a tratamento por adriamicina e epirrubicina UGT2B7 indicando que está envolvido na resistência a estes fármacos. No entanto, knockdown de UGT2B7 não teve nenhum efeito sobre a toxicidade de temozolomida. Tomados em conjunto, estes resultados demonstram claramente um papel para UGTs na etiologia de melanoma. Uma vez que os UGTs são enzimas do metabolismo de drogas, propomos que re-expressão das UGTs constitui um mecanismo previamente insuspeita de resistência aos medicamentos intratumoral no melanoma

Citation:. Dellinger RW, Matundan HH, Ahmed AS, Duong PH, Meyskens FL Jr (2012) Anti-Cancer Drugs Extrair re-expressão de UDP-glucuronosiltransferases em células de melanoma. PLoS ONE 7 (10): e47696. doi: 10.1371 /journal.pone.0047696

editor: Keiran Smalley, O Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 16 de julho de 2012; Aceito: 17 de setembro de 2012; Publicação: 22 de outubro de 2012

Direitos de autor: © Dellinger et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo generoso apoio das Fundações Oxnard e Waltmar, bem como bolsas de Institutos Nacionais de Saúde Instituto Nacional do câncer [P30CA62330] para FLM e uma bolsa de formação biologia do câncer [T32CA009054] apoio salarial prevista RWD para este trabalho. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Competir interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

introdução

a família de enzimas catalisa a UGT a glucuronidação de um vasta gama de compostos xenobióticos e endógenos. UGTs conjugar uma porção de ácido glucorónico para os seus substratos, que altera as propriedades biológicas do substrato e aumentar a sua excreção na urina ou biliar [1], [2]. Em geral, a glucuronidação converte substratos em menos bioativo, mais produtos solúveis em água facilitando a sua remoção do corpo. Desta maneira, os UGTs são integralmente envolvido na desintoxicação de muitas substâncias cancerígenas, o apuramento das drogas e do metabolismo de uma variedade de substratos endógenos tais como bilirrubina, hormonas esteróides e lípidos bioactivos [1], [2]. Existem 19 UGTs humanos funcionais classificadas em três subfamílias com base estrutural e homologia de sequência de aminoácidos, UGT1A, UGT2A UGT2B e [2].

Os UGTs são enzimas ligadas à membrana localizadas em grande parte para o retículo endoplasmático [1], [3]. a especificidade do substrato varia muito entre os membros da família, com sobreposição ampla, e a sua especificidade para o substrato pode ser alterado por modificações pós-tradução tais como a fosforilação [4]. Embora UGTs são expressos principalmente no fígado, como também desempenham um papel vital em outros tecidos do corpo. Por exemplo, UGT2B15 e UGT2B17 são expressos na próstata onde regulam os níveis de andrógenos locais através de glucuronidação [5] e UGT1A10 e UGT2B7 são expressos na mama onde regulam estrogénios [6]. Também há ampla evidência de que os UGTs desempenham papéis importantes no trato aerodigestivo, trato gastrointestinal, pulmão, cólon, bexiga, rins e cérebro [7], [8], [9], [10], [11]. No entanto, o papel dos UGTs na pele, o maior órgão do corpo, ainda tem de ser investigado.

O melanoma é um dos que mais cresce tipos de tumores nos Estados Unidos e o número de casos em todo o mundo dobrou nos últimos 30 anos [12]. Melanoma, que surge a partir de melanócitos, é um tumor extremamente agressivo que invade os sistemas vasculares e linfáticas para formar tumores em outras partes do corpo [12], [13], [14]. O melanoma é um câncer particularmente resistente, representando apenas 4% de todos os cancros da pele, mas responsável por 80% das mortes por câncer de pele [15]. Além disso, apenas 14% dos pacientes com melanoma metastático sobrevivem por 5 anos [15].

abordagens terapia sistêmica ter alcançado um mínimo de sucesso contra o melanoma metastático, resultando em apenas alguns tratamentos aprovados pela FDA [16]. Interferon-a2B, interleucina-2 e temozolomida ter todos demonstraram eficácia limitada, com taxas de resposta geral, menos de 15% no curto prazo sem efeito claro sobre a mortalidade relacionada com o melanoma [16]. No entanto, o recente sucesso do vemurafenib específico inibidor BRAF mutante em uma trilha clínico de Fase 1 é muito promissor [17]. Uma sobrevivência livre de progressão estimada de 7 meses foi relatado entre todos os pacientes que albergam a mutação BRAF V600E [17], que está presente em aproximadamente 50% de todos os melanomas [18]. No entanto, a emoção para vemurafenib como um agente único foi temperada um pouco desde a resistência adquirida já está sendo observado [17]. Assim, a compreensão do mecanismo (s) de resistência à quimioterapia, que empregam células de melanoma é fundamental para o combate a esta doença mortal.

O objetivo do presente estudo foi caracterizar a expressão ea função dos UGTs nos melanócitos e melanoma e para examinar o papel potencial de UGTs na resistência à droga. Evidência apresentada aqui revela três membros da família UGT, UGT2B7, UGT2B10 e UGT2B15, como normalmente expressa em melanócitos humanos isolados de prepúcios neonatais. As mesmas três UGTs foram encontrados para ser expressa na linha celular de melanoma primário WM115. Curiosamente, não foi observada expressão UGT em uma outra linha de células de melanoma primário, WM3211, ou em qualquer uma das três linhas de células de melanoma metastático examinadas, sugerindo que a expressão UGT é perdida durante a progressão do melanoma. No entanto, o tratamento de células de melanoma com agentes anti-cancro resulta na re-expressão dessas mesmas três UGTs. Este romance re-expressão de UGTs no melanoma é investigado adicionalmente aqui.

Materiais e Métodos

Reagentes e Cultura de Células

A temozolomida, adriamicina, epirubicina e alameticina foram obtidos da Sigma . Vemurafenibe foi comprado de Selleck (Houston, TX). melanócitos humanos normais foram isolados a partir de prepúcio neonatal de-identificado a partir de cirurgia de circuncisão de acordo com um protocolo aprovado pelo Conselho de avaliação interna da UC Irvine. De acordo com este protocolo aprovado não há recrutamento dos participantes, o tecido circuncidado única descartado é recolhido. Nenhuma informação de identificação é recolhida em relação a este tecido que de outra forma seriam descartados. Os melanócitos foram isoladas como descrito anteriormente [19], [20] e cultivadas em meio MCDB153 suplementado com 2% de soro bovino fetal, 10 ng /ml de 12-O-tetradecanoylphobol-13-acetato e 0,15% de extracto de pituitária bovina. As linhas celulares de melanoma WM115, WM3211, Lu1205, SKmel28 e A375 foram cultivadas como descrito anteriormente [21], [22], [23]. Apenas WM3211 tem WT B-Raf, todos os outros abrigar mutações V600E. Todas as linhas celulares foram negativas para micoplasma.

Isolamento de ARN total, transcrição reversa e PCR

O ARN total foi isolado a partir de células utilizando o ARN total Aro Mini Kit (BioRad) de acordo com o protocolo fornecidos empresas. O ARN foi quantificado utilizando um NanoDrop 1000 (/Thermo Fisher) cDNA foi, em seguida, feita a partir de 1,0 ug de ARN utilizando a Transcriptase Reversa iScript Kit (BioRad) de acordo com protocolos padrão. A PCR foi então realizada utilizando Taq uma carga rápida (2X) master mix (New England Biolabs) e corridas num termociclador 2700 Applied Biosystems GeneAmp sistema usando o seguinte protocolo: Passo 1 = 94 ° C durante 5 min; Passo 2 (40 ciclos) = 94 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 seg, 68 ° C durante 1 min; Passo 3 = 68 ° C durante 10 min. Tabela S1 em dados complementar lista os iniciadores utilizados para amplificar os membros da família UGT individuais.

PCR em Tempo Real

Para analisar os níveis de expressão de mRNA em células de melanoma UGT-PCR em tempo real foi realizado como anteriormente descrito [3], [24]. Ensaios de Expressão Gênica TaqMan Resumidamente, pré-concebidas [Applied Biosystems (Hs02383831_s1 de ID para UGT2B4; Hs00426592_m1 para UGT2B7; Hs02556282_s1 para UGT2B10; Hs03008769_g1 para UGT2B15 e Hs99999905_m1 para GAPDH)] foram utilizados de acordo com o protocolo do fabricante. PCR em tempo real foi realizado utilizando um volume total de 20 uL contendo 50 ng de ADNc, utilizando GAPDH como gene de normalização “arrumação”. PCR em tempo real foi realizada em uma máquina CFX96 PCR em Tempo Real (BioRad). valores de expressão de mRNA reportados são a média de pelo menos 3 experiências independentes, com desvio-padrão.

shRNA

Pronto-clonado shRNA alvo contra UGT2B7 e controlar os vectores de expressão vazias foram comprados Origene. Cada vector shRNA foi transfectado em WM115 células usando o agente de transfecção Biot (Bioland Scientific) de acordo com protocolos do fabricante e expressão estável foi selecionada pela adição de puromicina (Invivogen).

MTT Assay

Para determinar os efeitos de drogas sobre a proliferação celular foi realizada 3- (brometo de 4,5-dimetiltiazol-2-il-2,5-difeniltetrazólio (MTT) ensaios de (Sigma Aldrich). Resumidamente, as células foram plaqueadas a noite à 2000-4000 células /bem (dependendo da célula tempos de duplicação) em placas de 96 poços, e tratados com adriamicina, epirubicina, ou temozolomida em diluições em série da droga. Após o terceiro dia de pós-tratamento, o MTT diluída em meio isento de corante é adicionada a cada poço e incubou-se durante 3 horas. uma vez que o MTT é metabolizado por células em proliferação activa em água formazen insolúvel, em seguida, adiciona-se dimetilsulf óxido (Sigma Aldrich) e alterações colorimétricas são analisados ​​e quantificados com um espectrofotómetro a 590 nm. os resultados de MTT foram analisados ​​usando Graphpad Prism em que a dosagem do fármaco versus o seu efeito na proliferação é representada graficamente; uma curva de regressão não linear utilizando a equação sigmoidal dose-resposta foi montado sobre o gráfico e a concentração inibitória de metade do máximo (IC

50) é obtido. Relatados IC

50 valores são a média de pelo menos 3 experiências independentes, com um desvio padrão.

UGT Ensaio de Actividade

UGT actividade foi examinada utilizando o ensaio UGT-Glo (Promega) de acordo com a protocolos do fabricante. Os homogenatos celulares foram preparados por re-suspender as células precipitadas em solução salina tamponada com Tris (25 base Tris mM, NaCl 138 mM e KCl 2,7 mM; pH 7,4) e submetendo-os a três ciclos de congelação-descongelação antes da homogeneização utilizando um homogeneizador Dounce de vidro . homogenatos celulares (5-20 mg de proteína /ml) foram armazenadas a -70 ° C em alíquotas de 100 ul. concentrações de proteína total homogeneizado de células foram determinadas usando o ensaio BCA de Pierce Biotechnology (Rockford, IL) após a extracção de proteína utilizando protocolos padrão. microssomas hepáticos humanos (Xenotech, Lenexa, KS) foram usados ​​como um controlo positivo. Os homogeneizados foram incubados com alameticina durante 10 minutos em gelo. Cada reacção consistiu em 50 ng homogeneizado, tampão UGT-Glo, 50 uM de substrato Multienzimáticos UGT e água até um total de 30 ul. Em seguida, 10 ul de água ou 10 ul UDPGA 16 mM (concentração final de 4 mM) foi adicionado. Cada uma destas reacções foi feito em triplicado (total de 6 reacções para cada homogenato). As reacções foram então incubadas a 37 ° C durante 90 min. Apenas as reacções com o co-substrato UDPGA adicionado pode glucuronidate substrato. Depois de 90 minutos, 40 ul de luciferina Reagente de Detecção mais D-cisteína é adicionada a todos os poços e o sinal luminescente é deixada estabilizar à temperatura ambiente durante 20 min. Placa foi em seguida, ler um luminómetro (Turner Biosystems módulo de microplaca). Como controlo negativo um conjunto de seis reações foi realizada sem nenhum UGTs presentes. A UGT Multienzimáticos Substrato irá gerar luminescência, mas o substrato Multienzimáticos UGT glucuronado não. Assim, a média das reacções em triplicado com o UDPGA co-substrato é subtraída da média das reacções em triplicado sem UDPGA para determinar a actividade UGT. Os gráficos são a combinação de vários experimentos independentes, com desvio-padrão.

Resultados

Expression UGT em melanócitos humanos e Melanoma

Enquanto expressão UGT foi previamente relatado na pele [25 ], expressão UGT nos melanócitos não tinha sido especificamente abordada. No presente estudo, os melanócitos humanos isolados a partir de prepúcio identificou-de neonatais foram analisadas quanto à expressão UGT por RT-PCR. Os conjuntos de iniciadores concebidos para os membros da família UGT2B individual foram utilizados, bem como um iniciador comum criado para detectar qualquer membro da família UGT1A. Os UGT2As não foram medidos como eles são largamente encontrados no sistema olfactivo [26]. Como mostrado na Figura 1A, UGT2B7, UGT2B10 e UGT2B15 foram encontrados para ser expressa em melanócitos humanos. Os produtos de PCR indicados pelas setas pretas (Figura 1A) correu aos tamanhos previstos foram excisados ​​e as sequências foram confirmadas UGT individuais. A banda na pista UGT2B4 (Figura 1A, pista 1) também foi excisada e determinado a ser UGT2B7 por sequenciação. Isso não é muito surpreendente que os membros da família UGT2B compartilhar alta homologia. Na verdade, UGT2B4 e UGT2B7 partilhar mais do que 90% de identidade ao nível do ADN e as estratégias de iniciadores específicos é difícil. Como um controlo, a RT-PCR foi realizada utilizando ARN de fígado para demonstrar que os primers conjuntos UGT eram funcionais e mostra tamanhos prevista para cada fragmento amplificado UGT (Figura 1B). A expressão desses mesmos três membros da família UGT também foi observada em melanócitos humanos a partir de uma segunda prepúcio neonatal identificou-des (Tabela 1; Note que os números 322 e 423 indicam simplesmente datas prepúcio foi obtido a partir de recém-nascidos caucasianos). Em seguida, a expressão UGT foi examinada em várias linhas celulares de melanoma primários e metastáticos por RT-PCR. Consistente com o padrão de expressão observado nos melanócitos UGT, a linha celular de melanoma WM115 primário apresentava apenas UGT2B7, UGT2B10 e expressão UGT2B15 (Figura 1C). Devido à elevada homologia dos membros da família, e semelhante à da Figura 1A, a banda ‘UGT2B4’ na Figura 1C foi determinada como sendo UGT2B7 após a sequenciação de ADN. Além disso, a banda superior na pista UGT1A foi excisada e sequenciados (embora tenha sido menor do que o tamanho esperado) e estava determinado a não ser qualquer membro da família UGT. Nenhuma expressão UGT foi observado em uma outra linha de células de melanoma primário, WM3211 (Figura 1D), ou em qualquer uma das três linhas de células metastáticas de melanoma examinadas (resumido na Tabela 1, representado na Figura S1). Estes resultados sugerem que a expressão UGT é perdida durante a progressão do melanoma.

(a) a análise de RT-PCR de ARN total a partir de melanócitos humanos para membros da família UGT. conjuntos de primers para os UGT2Bs foram projetados para ser específico para cada isoforma enquanto um único conjunto de primers dirigido contra a região comum de todos os UGT1As foi utilizado para detectar a expressão UGT1A. O RNA total de fígado humano foi usado como um controlo com primers UGT2B7. As setas indicam as bandas de ADN de tamanho esperado, cuja sequência foi confirmada. (B) Controlo de análise de RT-PCR de ARN total a partir de fígado utilizando conjuntos de iniciadores indicados. Análise (C) RT-PCR do ARN total a partir da linha celular de melanoma humano WM115 utilizando conjuntos iniciadores indicados. As setas indicam bandas que foram excisadas e sequenciados. Banda na pista UGT2B4 foi encontrado para ser UGT2B7 por sequenciação enquanto as bandas UGT2B10 e UGT2B15 foram confirmados de se esperar UGTs. Análise (D) por RT-PCR de ARN total a partir da linha celular de melanoma humano WM3211. GAPDH foi usada como um controlo positivo aqui para garantir a qualidade do ADNc. (E) PCR em tempo real TaqMan utilizando ensaios contra UGTs indicados. ND = não detectado.

A fim de melhorar a sensibilidade e especificidade da UGT mRNA detecção, ensaios de expressão gênica TaqMan foram utilizados para o resto deste relatório. Estes ensaios foram optimizados para ser específico para UGTs individuais usando uma sonda, assim como um conjunto de iniciadores. Para ilustrar este ponto, e re-afirmar que UGT2B7 está presente em melanócitos em oposição a UGT2B4, PCR em tempo real utilizando ensaios TagMan foi realizada em ADNc de melanócitos. Figura 1E mostra claramente que UGT2B7 é de fato expressa em melanócitos humanos e UGT2B4 não foi detectado.

Re-expressão de UGT2B7, UGT2B10 e UGT2B15 no melanoma em resposta a drogas anti-câncer

Tendo em vista que os UGTs fase II são enzimas do metabolismo e uma das suas funções principais sistematicamente é eliminar drogas, nós examinamos se os UGTs pode desempenhar um papel na resistência inerente das células de melanoma a agentes quimioterapêuticos. Assim, a linha celular de melanoma WM3211 foi tratada com vários agentes anti-cancro e expressão UGT foi analisada por PCR em tempo real. WM3211 foi escolhido para estas experiências, uma vez que não tem expressão UGT detectável, como determinado por RT-PCR (Figura 1D).

Primeiro, as células tratadas WM3211 com temozolomida, que é actualmente indicado para o tratamento do melanoma metastático. Uma dose de 100 ^ M foi escolhida para este experimento desde relatórios publicados para o tratamento de temozolomida cultura de células usam geralmente um mínimo de 100 um [27], [28]. Tal como mostrado na Figura 2a, UGT2B7, UGT2B10 UGT2B15 e foram re-expressos em células de WM3211 em resposta a temozolomida. Curiosamente, não há outros UGTs foram induzidas (dados não mostrados), apenas os três membros da família UGT que são normalmente expressas em melanócitos (Tabela 1). A indução da expressão UGT em resposta à temozolomida se comportou de uma forma dependente do tempo com expressão máxima atingindo um máximo de 8 horas após o tratamento (Figura 2A). Para todos os três UGTs sua expressão declina depois de 8 horas, mas a sua expressão é ainda elevada 24 horas após tratamento (Figura 2A).

predesigned Taqman ensaios de expressão de genes foram utilizados para visualizar a expressão de UGT indivíduo por PCR em tempo real seguinte tratamento de células com WM3211 (a) 100 uM temozolomida, (B) 1,0 uM adriamicina ou (C) de 0,1 uM epirubicina. Em todos os casos, UGT2B7, UGT2B10 e expressão UGT2B15 foi examinada por o agente anti-cancro indicado em 0, 8, 16 e 24 horas após o tratamento. * Indica escala diferente para o eixo y.

Para elucidar se a re-expressão destes três membros da família UGT foi específico para temozolomida ou se este observada resposta pode ser um mecanismo geral para o melanoma se defender contra agentes quimioterapêuticos, os agentes anti-cancro adriamicina e epirubicina foram também examinados. foram seleccionados Estes dois compostos, uma vez que estão intimamente antraciclinas que são comumente utilizados para tratar vários tipos de tumores sólidos, embora melanoma provou ser resistente relacionado [29], [30]. Além disso, epirrubicina é conhecido por ser metabolizada principalmente por UGT2B7 [31], enquanto o metabolismo de adriamicina é muito mais complexo e envolve vários Fase II enzimas diferente (incluindo UGTs) e transportadores ABC [30]. WM3211 células de melanoma eram ou não tratados ou tratados com 0,1, 1,0 ou 10 uM adriamicina (Figura S2A) ou epirubicina (Figura S2B) e UGT expressão foi analisada por PCR em tempo real, depois de 8 horas. Em ambos os casos UGT2B7, foram observadas UGT2B10 e UGT2B15 para ser re-expresso. Semelhante a temozolomida, nenhum outro membro da família UGT foi induzida (dados não mostrados). cursos de tempo examinando expressão UGT após o tratamento de células com 1,0 uM WM3211 adriamicina (Figura 2B) ou 0,1 uM epirubicina (Figura 2C) foram, em seguida, levada a cabo. Em ambos os casos UGT2B7, UGT2B10 e UGT2B15 são induzidos de um modo dependente do tempo, com a expressão mais elevada observada em 24 horas.

re-expressão de UGT2B7, UGT2B10 UGT2B15 e em células metastáticas de melanoma em resposta a epirrubicina e Vemurafenibe

para assegurar que a indução observada da UGTs não se limitava a células WM3211, duas linhas de células de melanoma metastático (SKmel28 e A375) foram examinados quanto à indução de UGT2B7, UGT2B10 e UGT2B15 em resposta a epirrubicina. cursos de tempo examinando expressão UGT após o tratamento de SKmel28 (Figura 3A) ou A375 (Figura S3) com 0,1 uM epirubicina foram então realizadas. Mais uma vez, foi observada a indução de todos os 3 UGTs em ambas as linhas de células de melanoma metastático com expressão máxima a 24 horas. Além disso, uma vez que tem sido observada resistência em ensaios clínicos com o novo vemurafenib droga promissora, nós examinamos se os UGTs poderia ser induzida a seguir a tratamento vemurafenib. células SKmel28, que abrigam a mutação BRAF V600E, foram tratadas com 1 mM vemurafenib, coletadas em 0, 8, 16 e 24 horas após o tratamento e ensaiadas para níveis de expressão UGT. Tal como mostrado na Figura 3B, UGT2B7, UGT2B10 e UGT2B15 foram todos induzida em resposta a Vemurafenibe.

predesigned Taqman ensaios de expressão de genes foram utilizados para visualizar a expressão de UGT indivíduo por PCR em tempo real após o tratamento de células com SKmel28 (A ) epirubicina ou B) vemurafenib (. Curso de tempo de UGT2B expressão seguinte epirubicina (100 nM) ou vemurafenib tratamento (1 uM) foi examinada a 0, 8, 16 e 24 horas. * Indica escala diferente para o eixo y. ND = não detectado.

aumento da glucuronidação em células de melanoma a seguir ao tratamento com um agente anti-cancro

Depois de demonstrar que UGTs pode ser re-expressos em células de melanoma a seguir ao tratamento com anti- agentes de câncer, a pergunta óbvia é se a atividade UGT foi restaurado também. Portanto, a glucuronidação foi examinada utilizando a UGT-Glo Ensaio em linhas celulares de melanoma que não possuem expressão UGT e em comparação com as mesmas linhas celulares após tratamento com epirrubicina. Este ensaio utiliza um substrato UGT Multienzimáticos que reage com o reagente de detecção luciferina para dar luz que pode ser quantificada num luminómetro. No entanto, se o substrato é glucoronisado então deixará de reagir com o reagente de detecção luciferina para dar luz. Assim, duas reacções são configurados por exemplo, um a com UDPGA co-substrato e o outro sem. Apenas a reacção com o substrato UDPGA produzirá glucuronado se UGTs estão presentes e activas. Deste modo, a actividade UGT total para a amostra pode ser quantificada pela diferença na luz emitida entre as duas reacções.

Primeiro, as células de melanoma primário WM3211 foram examinados para a actividade UGT. As células foram quer deixados sem tratamento (ONU) ou tratados com epirrubicina nas concentrações indicadas. As células foram colhidas 24 horas mais tarde e ensaiadas para a actividade UGT. Como mostrado na Figura 4A, a actividade UGT foi aumentada em resposta a um tratamento epirubicina, em comparação com células não tratadas. Curiosamente, havia alguma actividade basal glucuronidação nas células não tratadas, indicando que WM3211 UGTs são expressos nesta linha de células, mas a níveis inferiores ao de detecção do nosso ensaio de RT-PCR (Figura 1D). microssomas de fígado humano foram utilizadas como um controlo positivo que eles têm concentrações muito elevadas de UGTs e não foi homogeneizado presente no controlo negativo para a conta de qualquer sinal de fundo. Resultados semelhantes foram observados quando esta experiência foi repetida em duas células de melanoma metastático de linhas, SKmel28 (Figura 4B) e A375 (Figura 4C). Em ambas as linhas celulares da actividade da UGT foi dramaticamente aumentado após o tratamento com epirrubicina. Em contraste com as células WM3211, nem linha celular metastático UGT exibiram actividade na ausência de tratamento. Mais uma vez, microssomas de fígado humano foram utilizadas como um controlo positivo e o controlo negativo faltava homogenato celular

A glucuronidação actividade foi examinada pela UGT-Glo ensaio utilizando 50 ug de homogeneizado por reacção em três linhas de células de melanoma.; (A) WM3211 (B) SKmel28 e (C) A375 sem tratamento e comparado com o tratamento com epirrubicina (EPI) com as concentrações indicadas, durante 24 horas. (-) Indica um controlo negativo no qual não estava presente homogeneizado. (+) Indica o uso de microssomas de fígado humano (conhecido por ter altas concentrações de quase todos os membros da família UGT) como um controlo positivo.

UGT2B7 Knockdown sensibiliza células WM115 melanoma de drogas anti-câncer

para determinar a contribuição funcional da glucuronidação à resistência melanoma, UGT2B7 foi derrubado na WM115 células. shRNA dirigido contra UGT2B7 foi estavelmente transfectado para células WM115. Esta linha celular foi nomeado WM115-2B7KD. PCR em tempo real foi realizada em seguida, para confirmar que os níveis de mRNA UGT2B7 tinha sido reduzida. A Figura 5A mostra claramente que os níveis de mRNA UGT2B7 na linha celular WM115-2B7KD foi ~ 60% menos do que a WM115 células estavelmente transfectadas com vector vazio (WM115-PRS). Em seguida, as concentrações máximas de inibição a metade (IC

50) tal como determinado por ensaios de MTT, foram realizados para examinar se knockdown de UGT2B7 sensibilizados WM115 células para tratamento anti-cancro. IC

50 valores para WM115-2B7KD foram determinados e comparados com WM115 ao PRS (linha estável de células feita com vector vazio como controle) e a linha celular parental contra temozolomida, adriamicina e epirubicina. Consistente com um papel para a glucuronidação na resistência melanoma, WM115-2B7KD verificou-se ter uma significativamente menor (p 0,01) IC

50 valor de adriamicina e tratamento epirubicina, em comparação com ambos WM115 e WM115-pRS (Figura 5B) indicando que, de facto, de knockdown UGT2B7 sensibiliza as células de melanoma a estes fármacos anti-cancro. Nenhum efeito sobre IC

50 valores foi observado para a temozolomida ou tratamento vemurafenib na linha celular WM115-2B7KD em comparação com as duas linhas de células de controlo (Figura 5B).

(A) PCR em tempo real de UGT2B7 níveis de mRNA comparando linhas de células de melanoma expressando estavelmente shRNA contra UGT2B7 (WM115-2B7KD) ou vector vazio (WM115-pRS). (B) IC

50 valores determinados a partir de ensaios de MTT avaliando a contribuição de UGT2B7 à resistência melanoma após o tratamento de temozolomida, adriamicina, epirubicina ou vemurafeninb. (C) CI

50 valores determinados a partir de ensaios MTT avaliar a sensibilidade de linhas de células de melanoma com (WM115) e sem (WM3211) UGT expressão para fármacos anti-cancro conhecidos por serem metabolizados por UGTs. Todos os gráficos de dados são a média de pelo menos três experiências independentes analisadas por GraphPad Prism. As barras de erro representam o desvio padrão e * indica significância p . 0,01, em comparação com tanto controle

Se derrubar um UGT por células de melanoma sensibilizados -60% a adriamicina e epirubicina, em seguida, é lógico que o IC

50 para células de melanoma WM3211 (que não têm expressão UGT) seria significativamente menor do que as células parentais WM115 (que têm expressão UGT). Assim, comparou-se a IC

50s para WM115 e WM3211 diretamente para estes medicamentos. Como previsto, as células foram WM3211 de 7 vezes e 9 vezes mais sensível a adriamicina e epirubicina, respectivamente (Figura 5C).

Discussão

O papel da UGTs em etiologia melanoma não tinha sido investigado anteriormente, apesar das UGTs sendo um mecanismo de depuração importante para os agentes anti-câncer. No presente estudo UGT2B7, UGT2B10 e UGT2B15 foram identificados como sendo normalmente expressa em melanócitos humanos. As mesmas três UGTs foram encontrados para ser expressa na linha celular de melanoma primário WM115. No entanto, não foi detectada expressão UGT em uma outra linha de células de melanoma primário, WM3211, ou em qualquer uma das três linhas de células metastáticas de melanoma examinadas indicando que a expressão UGT é perdida durante a progressão do melanoma. É interessante notar que demonstram que UGT2B7, UGT2B10 UGT2B15 e pode ser re-expressos em células de melanoma em resposta aos agentes anti-cancro. O aumento correspondente na actividade UGT também foi demonstrada após o tratamento. Assim, re-expressão das UGTs presumivelmente proteger as células cancerosas contra as drogas anti-câncer através de uma melhor metabolismo e apuramento posterior. Mais importante, estas observações são consistentes tanto em células de tipo selvagem de melanoma B-Raf (WM3211) e B-Raf linhas celulares mutantes (A375 e SKmel28).

Infelizmente, foi mostrado anticorpo não disponíveis comercialmente para detectar UGT2B endógena proteína e, consequentemente, as nossas tentativas para visualizar UGT2B proteína endógena foram infrutíferas. Este é provavelmente devido ao fato de que UGTs estão ligadas à membrana, proteínas insolúveis. Por conseguinte, não UGT humana de comprimento completo foi purificado e /ou cristalizadas. Na verdade, a estrutura cristalina única relatada para um UGT humano é a metade C-terminal de UGT2B7 desde a metade N-terminal tinha que ser cortada para solubilizar a proteína [32]. A grande maioria dos Westerns UGT publicados são linhas de células de insectos (em geral) que são sobre-expressam UGTs recombinantes. Além disso, um recente relatório demonstra claramente que uma grande percentagem destes UGTs sobre-expressos, recombinantes estão inactivas [33]. Pode-se facilmente imaginar que as proteínas recombinantes UGT que são visíveis na westerns não estão totalmente maduros enzimas, ativos. Por outro lado, totalmente maduras UGTs, ativos podem não ser visíveis em westerns mesmo quando overexpressed. Assim, de acordo com várias publicações anteriores no campo UGT, o presente estudo incidiu sobre a expressão do mRNA dos membros da família UGT2B juntamente com a análise da actividade UGT. Utilizamos interferência e glucuronização ensaios de RNA para examinar o papel de UGT2B7 na sobrevivência de células de melanoma [1], [3], [24], [34], [35], [36], [37].

Para testar o papel da glucuronidação no melanoma resistência aos medicamentos diretamente, UGT2B7 foi derrubado na WM115 células, a única linha de células de melanoma nós identificamos com expressão UGT até agora. Knockdown de células de melanoma UGT2B7 sensibilizados com a epirrubicina e tratamento adriamicina, mas não teve efeito sobre a temozolomida ou tratamento vemurafenib. Estes resultados fornecem uma prova de princípio de que glucuronidação está envolvido na resistência melanoma droga

in vitro

. A suposição mais lógica é que UGT2B7 glucoronidatos epirubicina e metabólitos adriamicina diretamente, resultando em sua depuração antes que estes medicamentos podem exercer a sua toxicidade. Isto é consistente com relatórios prévios de que epirrubicina é metabolizado principalmente por UGT2B7 [31] e glucuronidação que também está envolvida na depuração adriamicina [30]. A observação de que a toxicidade da temozolomida e vemurafenib foi inalterada após UGT2B7 knockdown não foi completamente inesperado uma vez que UGTs nunca foram implicados no metabolismo destas drogas.

É importante notar que estas experiências foram realizadas usando uma UGT2B7 knock down linha de células, assim, ainda havia alguma UGT2B7 presente. Além disso, UGT2B10 e UGT2B15 ainda estão presentes.