Abstract

Aqui, nós apresentamos uma plataforma de imagem inovadora para estudar os efeitos biológicos da radiofrequência não-invasiva ( RF) hipertermia cancro do campo eléctrico. Este sistema permite a

em tempo real in vivo

microscopia intravital (IVM) imageamento de alterações biológicas induzidas por radiofreqüência tais como mudanças na estrutura da embarcação e perfusão de drogas. Os nossos resultados indicam que o sistema de IVM é capaz de lidar com a exposição a alta-eléctricas de campos, sem indução significativa de danos ou de hardware de imagem artefactos. Além disso, períodos curtos de baixa potência ( 200 W) a exposição de radiofrequência aumento do transporte e da perfusão dos marcadores fluorescentes para os tumores em temperaturas abaixo de 41 ° C. deformações do navio e coagulação do sangue foram vistos para temperaturas tumorais cerca de 44 ° C. Estes resultados indicam que a utilização da nossa plataforma integrada de imagem IVM-RF como uma nova ferramenta poderosa para visualizar a dinâmica e interacção entre energia de radiofreqüência e tecidos biológicos, órgãos e tumores

Citation:. Corr SJ, Shamsudeen S, Vergara LA, Ho JC-S, Ware MJ, Keshishian V, et al. (2015) uma nova plataforma de imagem para a visualização de efeitos biológicos dos não-invasiva radiofrequência de campo elétrico Cancer hipertermia. PLoS ONE 10 (8): e0136382. doi: 10.1371 /journal.pone.0136382

editor: Arrate Muñoz-Barrutia, Universidad Carlos III de Madrid; Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañon, ESPANHA

Recebido: 03 de junho de 2014; Aceito: 03 de agosto de 2015; Publicação: 26 de agosto de 2015

Direitos de autor: © 2015 Corr et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Research informou nesta publicação foi apoiada pelo NIH Ciência Física no Programa de Oncologia (U54CA143837), os NIH MD Anderson Cancer Center Subsídios de assistência (CA016672), The Fundação Welch (C-0627, 616 LJW), uma bolsa de pesquisa irrestrito da Kanzius 617 Research Foundation (SAC, Erie, PA), e do Centro Nacional para a Promoção da Ciência Translational dos Institutos Nacionais de Saúde em Números Prêmio TL1TR000369 e UL1TR000371. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Interações de ondas de rádio de alta frequência (13,56 MHz), com tecidos e nanomateriais em tecidos biológicos estão actualmente a ser investigado como uma plataforma terapêutico para a terapia de hipertermia câncer não-invasivo. As propriedades dielétricas únicas de tecidos cancerosos favorecer radiofrequência (RF) de absorção de energia e conversão ao calor e é a hipótese de ser acelerado através do uso de RF-absorção de energia nanomateriais, como as nanopartículas de ouro e nanotubos de carbono de parede única. aquecimento do tumor melhorada é devida a perdas dieléctricas maiores dentro do tecido de tumor em comparação com tecidos normais [1], e tem encontrado aplicações em hipertermia clínica [2]. Muito trabalho foi focado em medir e interpretar a distribuição de temperatura [3] e propriedades dielétricas dos vários tecidos animais saudáveis ​​e cancerosas em todo frequências radiocomunicações e micro-ondas [4-6]. Em comparação com outros hipertermia fototérmico à base de nano abordagens de terapia de RF proporciona a vantagem de uma maior profundidade de penetração do tecido (~ 5-30 cm), o que é devido aos comprimentos de onda relativamente longos de RF (~ 22 m a 13,56 MHz), quando comparado com o subsolo profundidades de penetração milímetro de infravermelho (IR) e do infravermelho próximo (NIR) de luz.

Em uma tentativa de aumentar ainda mais as taxas de diferencial de aquecimento e citotoxicidade câncer induzido por RF, vários estudos têm demonstrado as características de aquecimento [7- 12]; toxicidade biológica [13-20]; interacções eléctricas [11, 21-24]; ea viabilidade de interações nanomaterial com energia de RF e seu uso como um potencial adjuvante hipertermia médica. Apesar da evolução contínua dos vários papéis que os nanomateriais desempenham na geração de calor localizado e citotoxicidade, tanto dentro soluções aquosas simplificados e materiais biológicos, muito trabalho foi alcançado no sentido de compreender a ciência básica por trás interações RF com tecidos biológicos com potencial de sinergia de existir com agentes de quimioterapia clinicamente aprovadas, tais como Abraxane, cetuximab, e gemcitabina [25]. Os artigos de revisão referenciada por Collins

et al

. e Liu

et al

. oferecer uma visão abrangente e concisa do campo [26, 27].

Um meio de visualizar diretamente a interação entre os tecidos biológicos e eléctricos campos de RF, permitindo uma visão sobre os processos fundamentais e ciência básica por trás dessa terapia, tem sido ausente. Até o momento não houve nenhum projeto para captura desses eventos dinâmicos, especialmente devido à dificuldade em integrar um gerador de campo elétrico de alta potência em diversas modalidades de imagem. Aqui, apresentamos um sistema integrador que combina a exposição RF com microscopia intravital de alta resolução (IVM) (RF-IVM) para permitir

em tempo real in vivo

imagem fluorescente de efeitos biológicos induzidos por RF. IVM, usando confocal e ou tecnologia de excitação multiphoton, é uma técnica poderosa para animais vivos de imagem em alta resolução com a capacidade de atingir profundidades de tecido de várias centenas de micrômetros. Com esta técnica, os investigadores são capazes de avaliar o tecido e as respostas celulares ao longo do tempo e no espaço tridimensional em tecido vivo sob condições fisiológicas naturais [28]. Os dados apresentados neste estudo demonstram que (i) um sistema gerador de RF de alta potência (200 W, ~ 15 kV /m) pode ser com sucesso retro-instalados em um sistema Nikon A1R IVM sem danos de hardware ou de imagem artefatos; e (ii) o sistema de MIV-RF integrada permite a imagiologia de eventos dinâmicos induzido por hipertermia suaves ( 41 ° C), tais como o aumento da perfusão do tumor de traçadores fluorescentes administrados sistemicamente (albumina e FITC-dextrano), bem como a deformação vaso e coagulação observado através da gama de temperaturas 44-49 ° C. Tendo em conta estes resultados, podemos antecipar que o sistema IVM-RF nos permitirá imagem eventos biológicos induzida por RF, tais como alterações na permeabilidade vascular, alterações na integridade do tecido, influência sobre nanopartículas e acumulação do fármaco, penetração nos tecidos, e eventos de migração celular.

Materiais e Métodos

portátil-RF sistema

uma fotografia do sistema portátil de RF (p-RF) sistema ao lado de uma representação esquemática da instalação experimental p-RF é ilustrado na Fig 1A e 1B. dimensão completa pode ser encontrada em S1 Fig O dispositivo é alimentado por uma fonte de alimentação de 200 W-frequência fixa (13,56 MHz) refrigerado a água (Seren, RX01 /LX01 Series, Sistemas de Energia Industriais, Inc.), que é ligado através de um alto capacidade de carga -current 50 cabo Ω co-axial. A amostra a ser expostos a RF é colocado entre os transmissão e recepção de cabeças (TX e RX, respectivamente). Os aumentos de temperatura são registados usando ou um 1 mm de diâmetro exterior de Teflon fibra óptica revestida sondas térmicas (Controle Photon, Canadá), com uma exactidão de temperatura de ± 0,5 ° C, ou de uma ligação por infravermelhos (IR) da câmara (FLIR SC 6000, FLIR Systems, Inc., Boston, MA), com uma exactidão de temperatura de ± 2 ° C (640 × 512 InSb resolução do detector com um comprimento de onda médio-gama do espectro IV de 3,0-5,0 uM). Dados da sonda térmica é capturado usando um personalizado construído LabVIEW Instrument Virtual (National Instruments, Austin, TX). O campo de RF-eléctrico gerado foi caracterizado utilizando uma sonda de campo eléctrico de Teflon revestido (TherMed, LLC, Erie, PA) ligado a um ajustável x, y, z fase (Thorlabs, Inc.) para o posicionamento ajustável, como mostrado na Fig 1C e 1D. Detalhes completos para medições de campo elétrico pode ser encontrado em S2 Fig Como pode ser visto na Figura 1D, a área “activa” de RF a exposição do campo elétrico está centrada ~ 6 cm em torno do ponto médio da cabeça de TX e estende ~ 1 -2 cm ao longo do eixo-X, fazendo com que um perfil de aquecimento que é gradualmente reduzida que a amostra fica mais longe da cabeça TX.

(a) sistema de RF portátil consiste em que a unidade transmissora (TX) e recebendo cabeça (RX) que gera um campo elétrico de alta potência em toda a amostra (por exemplo, mouse). O sistema é accionado por um amplificador de RF de potência variável fixo (0-200 W, 13,56 MHz) que é arrefecida durante a operação por um refrigerador de água. A produção de calor é monitorizada utilizando uma câmara de infravermelhos (IR) ou de inserção directa de sondas de fibras ópticas. representação (B) do circuito do sistema de RF portátil. (C) de instalação para extrair intensidades de campo elétrico. Uma sonda de campo elétrico (PFE) é colocado em pontos específicos ao longo dos eixos X e Z-eixo entre as cabeças de TX e de RX e mede a tensão em cada ponto de 20 W de energia de RF. (D) O campo eléctrico é derivado a partir dos dados de tensão e está representada graficamente como uma trama intensidade contorno.

O sistema de p-RF em si é relativamente pequeno (comprimento ~ 60 cm), quando comparado com a maior modelos RF [1, 7, 14]. Similar aos nossos geradores RF anteriores, o projeto oferece uma alternada forte (13,56 MHz) campo elétrico através das cabeças TX e RX [29] usando uma rede cascata LC. No entanto, ao contrário dos nossos sistemas anteriores, este sistema não é capacitivamente acoplado e não modela uma configuração de condensador de placas paralelas ideal onde o campo eléctrico seria de aproximadamente uniforme entre as cabeças de TX e RX. Em vez disso, este sistema transmite um campo elétrico que diminui gradualmente através das cabeças TX-RX e é, portanto, classificada como.

IVM-RF sistema

Uma imagem de uma “configuração de ponta disparou transmissão” do sistema p-RF adaptado para uma Nikon A1R

+ IVM é mostrado na Figura 2A. A Nikon A1R

+ é um microscópio confocal de varredura a laser equipado com dois mecanismos de varredura, um sistema orientado galvanometer convencional e um scanner de ressonância. O A1R

+ está equipado com 4 lasers de estado sólido (405, 488, 561 e 640 nm) e 4 detectores de fluorescência, incluindo dois PMT Gaasp. O A1R

+ também é equipado com um palco grande plataforma motorizada (Prior ZDeck Scientific) e uma coleção de objetivos distância longa de trabalho que variam de baixa ampliação, amplo campo de visão (4x 0.2NA e 10x 0,4 NA), até de alta resolução, imersão em água (16x 0,8 NA e 25x 1.2NA) lentes. operação do sistema e aquisição de imagem são controlados por software Nikon NIS Elements (v 4.0). Uma vez que o instrumento RF foi montado no IVM, a nossa avaliação inicial do sistema integrado envolvidos gradualmente aumentar o poder de p-RF (sem amostra), enquanto monitorando a tensão induzida em todo o chassis IVM, ligando uma sonda de osciloscópio para os pinos de terra eletrodo localizados por trás da lente objetiva no sistema IVM. Em todos os níveis de energia, incluindo a mais elevada potência de 200 W de RF, a tensão induzida no chassis era inferior a 500 mV, a qual é considerada negligenciável e não foi previsto para interferir com o hardware. Este procedimento teste foi realizado para garantir que a energia de RF não se acoplar diretamente ao microscópio IVM, que provavelmente causaria danos irreversíveis eletrônica e estrutural ao sistema IVM. Interferências menores incluídos mau funcionamento do software na forma de janelas do navegador abertas aleatoriamente e texto aparências-se denominou esse efeito ‘ghost writer’ e descobriu a origem deste efeito seja devido a campos de RF acoplamento com o teclado do computador. Envolvendo o cabo do teclado em torno de um balun núcleo de ferrite para reduzir a interferência RF resolvido este problema. Observamos, também, a interferência com o estágio motorizado, que foi resolvido por isolante da caixa para o controlador de joystick com folha de alumínio.

(A) O sistema de RF integrado no microscópio intravital (IVM) para geração de imagens em tempo real sob a exposição RF . (B) Rato manipulação para imagiologia-é feita uma incisão para expor gentilmente e manipular o tumor 4T1 para imagiologia de IVM. (C) 4T1 tumor sob IVM iluminação com uma lente objetiva x4.

Os modelos animais

camundongos Nude (4-6 semanas de idade) foram obtidos a partir de Charles River Laboratories, Inc. ( Wilmington, MA). tumores de mama foram estabelecidos utilizando fluorescente 4T1 td-tomate Bioware rato Red células mamárias cancerosas Ultra adquiridos de Caliper Life Sciences (Hopkinton, MA). Os murganhos foram tratados e fotografada quando os tumores atingiram um tamanho ~ 8 a 10 mm de diâmetro. Ao término da sessão de imagem, os animais foram sacrificados através de CO

2 exposição seguido por deslocamento cervical. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal em Houston Instituto de Pesquisa metodista e de acordo com o Guia NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

RF-IVM manipulações animais

ratos portadores de tumores de 4T1 foram expostas por uma pequena incisão na linha média através do qual o fáscia entre a pele e o músculo foi interrompida utilizando um cotonete. Um retalho de pele invertido foi elevada usando gaze de algodão enrolado. As imagens dos ratos serem manipulados por RF-MIV são mostrados na Fig 2B e 2C. Os ratinhos foram anestesiados utilizando 2-3% de isoflurano (Aerrane; Baxter Healthcare, Deerfield, IL, EUA) administrado através de um sistema de vaporizador de isoflurano (E-Z Systems, Palmer, PA, EUA). Os ratos foram mantidos em uma almofada de aquecimento durante a preparação e formação de imagens experimentos cirúrgicos para manter a temperatura corporal. Durante as gravações da imagem do tumor foi continuamente humedecido com solução salina e a temperatura foi monitorada utilizando sondas de fibra óptica revestida de teflon e /ou uma câmara de infravermelhos. Para imagem com lentes de imersão em água, uma lamela foi cuidadosamente posicionado no topo da área de imagem humedecido utilizando um micromanipulador manual (Kite, WPI). gravações de lapso de tempo foram capturadas em campos selecionados de vista com taxas de quadro de 10-30 fps.

marcadores fluorescentes

Os marcadores fluorescentes utilizadas neste experimentos foram Albumina-Alexa Fluor 647 (MW ~ 66 kDa) e isotiocianato de f luoresceina-dextrano (FITC-dextrano, PM ~ 70 kDa). Ambos foram obtidos a partir de Life Technologies, Grand Island, NY. Os ratinhos receberam 50 injecções de retro-orbital ul de quer Alexa 647 ou FITC-dextrano (ou ambos) em concentrações de 10 mg /kg (suspenso em solução salina tamponada com fosfato, PBS). Os ratos foram então submetidos a exposição à RF com ou sem imagem IVM simultânea. marcadores fluorescentes foram utilizados neste estudo, para contrastar os vasos sanguíneos do tumor e para investigar o extravasamento, devido ao aumento da permeabilidade vascular, e a difusão dos marcadores para os tumores. As células cancerígenas foram identificados pela sua expressão de proteína tdTomato-fluorescente. sinais de fluorescência FITC-dextrano, Td-tomate e albumina-647 foram detectados sequencialmente usando linhas de excitação de laser a 488, 561 e 640 nm, enquanto que a emissão foi gravado utilizando filtros de passagem de banda estreita (30-50 nm de largura de banda) em 520, 600 e mais do que 640 nm, respectivamente. Três imagens dos canais foram capturados uma 512×512 tamanhos de quadros com diâmetros pinhole fixado em 1 unidade Airy (AU) calculada em 561 nm.

imaging imunofluorescência

A completa macro-perfusão e captação de traçadores fluorescentes em toda o tumor em RF e camundongos não tratados RF foi analisada

ex vivo

usando imagens de imunofluorescência. vasos sanguíneos do tumor foram visualizadas utilizando anticorpos para CD31 para avaliar a penetração do tecido por albumina extravasada ou FITC-dextrano. secções de tumor congeladas foram fixadas com 4% de paraformaldeído, bloqueadas com soro normal de cavalo a 5% e soro de cabra normal a 1% em PBS, e coradas imunofluorescência utilizando anticorpos para CD31 (BD Biosciences, San Jose, CA). As secções foram então incubadas com anticorpo de cabra anti-IgG de rato Alexa Fluor 488 anticorpo (Jackson ImmunoResearch, West sulco, PA) [30]. As imagens foram capturadas usando o nosso A1R Nikon

+ microscópio confocal e analisados ​​utilizando software Nikon NIS-Elements AR (v3.2). A proporção de pixels em toda a imagem que tem uma maior intensidade de fluorescência do que o limiar (fundo) foi demonstrado como fracção de área positiva [31, 32]. Os dados foram apresentados como a média ± SD de secções representativas de mais de 5 imagens de tumores.

Algoritmos para quantificar a perfusão marcador fluorescente

Para quantificar o acúmulo marcador fluorescente no tumor e o extravasamento dos vasos sanguíneos, foi utilizado um simples algoritmo baseado na segmentação limite global e técnicas de mascaramento binários aplicados às imagens adquiridas em animais vivos. Por thresholding o componente de fluorescência Td-tomate, primeiro criar uma imagem binária, a qual é utilizada para gerar uma máscara para o tumor. Dilatam e corroem as operações são utilizados para remover buracos e alisar as bordas deste máscara. Um método semelhante é usada para criar uma máscara de vasculatura com base nos valores de intensidade elevadas do FITC-dextrano ou albumina-647 sinais. As duas máscaras são então combinadas para encontrar o componente extravascular da área do tumor e esta máscara resultante é utilizado para quantificar a quantidade de corante marcador, que tenha migrado para dentro do tumor.

Resultados e Discussão

modulação da temperatura tumor

os testes iniciais do sistema RF-IVM incluiu exposição de um rato 4T1 tumor-rolamento à energia de RF, sem imagens, para confirmar o aquecimento tumor. Figura 3A mostra a instalação experimental. O rato foi colocado numa fase de Teflon especialmente concebidos coberta com uma película fina de fita de cobre à terra electricamente o animal: acumulação de carga eléctrica prevenção de superfície que poderia causar lesão térmica. A fase de animais carregado foi colocado entre os chefes do sistema de p-RF TX e RX. Três sondas térmicas de fibra óptica foram inseridos directamente o mouse em diferentes posições em torno do tumor e em distâncias únicas a partir da cabeça TX. Sonda # 1 (o mais próximo da cabeça TX) foi inserido sob a pele, mas acima da massa tumoral; sonda # 2 foi inserido sob a pele entre a área em que o tumor é projectado a partir do corpo principal do rato; e sonda # 3 foi inserida acima da cavidade intraperitoneal exposta. Dado que o tecido localizado perto sonda # 1 provavelmente aquecer o maior, devido à sua proximidade com a cabeça TX, usamos isso como uma referência em ligar e desligar o sistema de RF em diferentes pontos de temperatura: 45 ° C, 43 ° C e 41 ° C. A temperatura do tecido foi arrefecida para cerca de ~ 30 ° C (devido ao ar condicionado da sala de operações a) entre cada exposição à RF. A energia total necessária para gerar estes perfis de aquecimento foi de 90 W. Como pode ser visto na Fig 3B, a temperatura do tumor aumentou inicialmente de 30 ° C a 45 ° C em ~ 250 s, 375 s ~ tendo-se arrefecer para trás para baixo a 30 ° C. Neste ponto, o RF foi ligado novamente e o tumor foi aquecida a 43 ° C antes de ser desligado novamente. Isto foi repetido até uma temperatura final do tumor de 41 ° C. Os dados de temperatura de sondas # 1- # 3 demonstraram uma redução no aquecimento dos tecidos devido à queda off na intensidade do campo elétrico a partir da cabeça TX. Se o campo eléctrico eram para ser constante em toda as cabeças TX e RX, como a que se aproxima da condição de um modelo ideal condensador de placas paralelas, em seguida, quaisquer flutuações e variações da temperatura iria provavelmente ser atribuídas a diferenças na permissividade e condutividade entre os tecidos , órgãos e tumores do rato, como será discutido.

(a) térmica colocação sonda de fibra óptica. Sondas # 1-3 são posicionados (i) sob a pele, mas acima do tumor; (Ii) sob a pele entre o tumor e o corpo principal; e (III) sob a pele ao lado da cavidade intraperitoneal. (B) Extraído dados da sonda térmica. A temperatura registrada das sondas foi modulada por ligar e desligar o sistema de RF (+ RF e-RF). O sistema foi desligado quando a temperatura do tumor (sonda # 1) atingiu 45 ° C, 43 ° C, e 41 ° C, respectivamente, e foi ligado quando todas as sondas tinham valores no intervalo de ~ 29-31 ° C. (C) A câmara de infravermelhos medidos simultaneamente a temperatura de superfície dos pontos onde as sondas térmicas foram localizados.

A intensidade do campo eléctrico em torno do tumor, bem como propriedades dieléctricas dos tumores são talvez os dois mais parâmetros físicos importantes que regem as taxas de aquecimento de tumores individuais. Dielétrica, neste caso, refere-se à quantidade de energia elétrica de um material irá absorver e converter ao calor, e é dependente da frequência. Uma publicação recente demonstrou efeitos anti-tumorais resultantes de RF não-invasivo [1]. Em seu estudo, Raoof

et al

. camundongos submetidos rolamento hepatocelular humano ortotópico-implantado e xenotransplantes pancreáticas para exposições à RF semanais. Os seus resultados indicaram que a RF-era suficiente para provocar um efeito anti-tumoral em carcinomas hepatocelulares e pode ser unicamente no princípio das propriedades dieléctricas dos tumores, sendo maior do que os tecidos saudáveis ​​normais. A capacidade de um material para armazenar e dissipar a energia elétrica como o calor pode ser descrita pela real (

ε ‘

) e imaginária (

ε “

) partes da função permissividade complexa (ε * ). Esta relação é dada pela equação 1: (1) em que

ω

é a frequência radial (

2πf

). O termo real da Equação 1 dá informações como a quantidade de energia eléctrica pode ser armazenado em um material enquanto o termo imaginário indica quanto desta energia é convertida em calor.

Numa situação clínica puramente ideal, o imaginário os valores para tecidos de tumor seria significativamente mais elevada do que a de, tecidos saudáveis ​​normais, em que o tumor se aquecem rapidamente até temperaturas que induzem quer hipertermia (conduzindo a mecanismos de morte celular programada naturais) ou ablação completa e necrose. As propriedades dielétricas de tecidos tanto cancerosas e normais foram medidos por Raoof

et al

. (Usando um analisador de permissividade), e foram mostradas para ser maior para os tumores do que as células normais. A relação entre a permissividade de um material e seu efeito sobre a produção de calor quando exposto a um tempo que varia de campo elétrico é dado pela seguinte equação: (2) onde

ε

0

é a permissividade do vácuo,

ε “

é a parte imaginária da permissividade complexa,

e

é a intensidade do campo elétrico na amostra,

ρ

é a densidade, e

c

p

a capacidade de calor específico. Nesta equação fundamental que regula, todas as variáveis ​​físicas pertinentes estão contidas que descrevem como uma amostra irá responder à exposição a um campo elétrico. Esta equação, especialmente a forte dependência da intensidade do campo elétrico, pode ajudar ainda mais a explicar a diminuição na produção de calor:. As sondas de temperatura estão localizados mais longe da cabeça TX com a intensidade do campo elétrico, diminuindo gradualmente

Neste estudar, a temperatura da superfície dos locais em que as sondas térmicas estão localizados também foram capturadas usando uma câmara de infravermelhos, tal como mostrado na Figura 3C. Como pode ser visto, há semelhanças e diferenças significativas quando comparados com os dados das sondas térmicas. Os dados de IV indica uma diminuição da temperatura final de tecido em comparação com a medição da sonda # 1 de ~ 5 ° C, e uma diminuição na temperatura de ~ 3 ° C durante sonda # 2. As temperaturas são semelhantes para a sonda # 3. Para testar ainda mais as diferenças e margem de erro entre a câmara de infravermelhos e dados sonda térmica, todas as três sondas foram imersos em 1,3 ml de PBS contidos numa cuvete de quartzo e expostos ao campo de RF. Os dados de temperatura é mostrada na Figura 4. Há uma correspondência próxima entre a câmara de infravermelhos e dados gravados sonda térmica com uma margem de erro entre 0,2-0,5 ° C. Esta semelhança era esperado como o cadinho de quartzo é quase opticamente transparentes em toda a gama de comprimentos de onda IR 3,0-5,0 mm. Dadas as semelhanças entre a câmera IR e dados da sonda térmica, aquecimento mostrado as diferenças em camundongos na figura 3 é mais provável devido à incompatibilidade entre a colocação da sonda e IR local do cursor. Por exemplo, a posição da sonda # 1 é na verdade mais profunda sob a pele do rato de sonda # 3 (bem como estando mais perto do tumor), de modo susceptível irá mostrar a produção de calor maior, devido ao aquecimento do tumor quando comparado com o medições da câmera IR de superfície. Além disso, as medições de superfície são geralmente susceptíveis de ser inferior à temperatura de inter-tecido, devido ao efeito de arrefecimento a partir do ambiente de temperatura ambiente. Finalmente, as perdas ópticas e a absorção de energia de propagação IV através da pele muito provavelmente irão reduzir a intensidade dos fotões IR na superfície do rato, que estão a ser detectados utilizando a câmara de infravermelhos.

(A), três térmica As sondas foram lugares numa cuvete de quartzo cheios com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e expostas a 200 W de RF. A câmera IR capturado a temperatura da superfície dos pontos de cursor localizado ao lado das sondas térmicas para o tempo de exposição RF 0 s-380 s (B e C, respectivamente). (D) Comparação de sonda térmica e IR dados de aquecimento da câmara.

Multi-channel imagens IVM-RF e degradação embarcação de alta temperatura

Figura 5 mostra em tempo real multi-canal imagiologia MIV-RF em um tumor 4T1 exposta. Três canais separados foram fotografadas: FITC (embarcações com dextrano), Texas Red (4T1 transfectadas tumor) e Cy5 (glóbulos vermelhos, glóbulos vermelhos). Figura 5A mostra os canais incorporadas, enquanto que os canais individuais são apresentados na Fig 5B-5D. Fig 5E-5H mostra mudanças na arquitetura navio para os quatro momentos diferentes, ilustrados como ponto de 1 hora a 5 na Fig 5I (NB: tempo o ponto número 1 corresponde à imagem latente antes da adição de exposição RF). Também mostrado na Fig 5I é o gráfico da temperatura do tumor e de potência de RF em função do tempo. temperatura tumor neste caso foi monitorizada utilizando uma sonda de temperatura colocada no tumor. Um filme comprimido em tempo desses canais incorporadas e individuais podem ser encontrados no filme S1.

(A) Sobreposição dos canais IVM independentes (FITC, Texas Red, e Cy5). vasos (B) Tumor são destacadas utilizando traçadores fluorescentes de FITC-dextrano, (C) de emissão fluorescente a partir da linha celular de tumor 4T1 transfectadas, de emissão (D) Cy5 de células vermelhas do sangue fez-coradas. Figura (A) – (D) foram tomadas no tempo = 78 s. Figura (E) – (H) representar o canal FITC (vasos) em diferentes pontos de tempo: 762, 1650, 2382, e 2742 s, respectivamente. Figura I ilustram a temperatura tumor em relação ao tempo e aplicada potência de RF. Os números 1-5 mostradas no lado inferior esquerdo de cada figura 5 correspondem aos pontos de tempo diferentes destacadas na Figura I.

Como pode ser visto a partir destes resultados, os vasos tumorais para iniciar estreita e se contraem quando a temperatura do tumor é aumentada acima de 41 ° C. A uma temperatura final do tumor de 44 ° C, as células são completamente intravasculares estagnada e as embarcações têm deixado de funcionar. Isto também pode ser visto no filme S1 em relação ao fluxo de glóbulos vermelhos. Uma vez que a temperatura é elevada acima de 41 ° C, o fluxo de eritrócitos torna-se irregular e existem alguns compartimentos dos navios, onde o fluxo sanguíneo cessou totalmente. Note-se, no que diz respeito aos pontos de tempo em que a energia RF foi intermitentemente terminados, de modo a evitar o sobreaquecimento do tumor. A utilização de um perfil de aquecimento em rampa permite adaptar desligar a energia quando a temperatura designada é alcançado de forma que uma temperatura conjunto preciso pode ser mantida. Isto pode ser visto a partir dos pontos de tempo 2 e 3, onde a potência diminui rapidamente depois aumentada gradualmente para permitir um perfil de aquecimento mais suave.

Uma repetição desta experiência (mas sem a coloração dos glóbulos vermelhos) é mostrado na Fig 6. O efeito da degradação do navio é mais pronunciada nessas imagens. Ao olhar para os quatro momentos diferentes pode ser visto que alguns baixo nível de degradação do navio é evidente para temperaturas entre 41,5-41,8 ° C (realizamos essa faixa de temperatura de ~ 10 minutos). Após isso, aquando da aplicação de mais energia de RF, o aumento na produção de calor do tumor (até ~ 49 ° C) resultou na degradação severa e desligamento completo dos vasos tumorais. Um filme completo desses efeitos podem ser vistos em S2 filme. Os resultados mostrados nas Figuras 5 e 6 ilustram o efeito das temperaturas elevadas na arquitectura navio e dinâmica de fluxo de RBC. Embora seja bem conhecido que o dano do vaso pode ocorrer para temperaturas superiores a 41 ° C, demonstrou-se que a permeabilidade dos vasos aumentada e perfusão de circulação de macromoléculas, agentes quimioterapêuticos, e as drogas podem ser esperados para as temperaturas ao longo do intervalo 39 ° C-41 ° C (o artigo de revisão referenciada por Roussakow oferece uma visão abrangente e concisa do campo [33])

(a) – (D) Impacto da exposição à RF na arquitetura navio em quatro momentos diferentes:. 0 : 22, 6:53, 16:18, e 20:31 minutos, respectivamente. As temperaturas tumorais e potência de RF nesses pontos de tempo são mostradas nas seções laterais mão média-alta e superior direito, respectivamente. Figura (E) ilustra a mudança na temperatura e de energia em relação ao tempo. Veículo degradação pode ser visto para a temperaturas 41 ° C. A desagregação completa da arquitetura navio pode ser visto por temperaturas 47 ° C.

induzida por RF transporte marcador fluorescente e perfusão em 4T1 tumores

Os ratos com tumores 4T1 foram cirurgicamente preparado para RF-IVM, como descrito na secção de métodos. Os ratinhos receberam injecções intravenosas de 50 uL para a albumina-Alexa Fluor 647 corante (10 mg /kg) via injecção retro-orbital e fotografada com e sem RF (como um controlo). Para todas as experiências, o RF foi desligado quando a temperatura do tumor atingiu 41 ° C (a menos que indicado de outra forma), tal como indicado pela câmara de infravermelhos. Figura 7A-7D ilustram a perfusão do marcador de albumina para fora dos vasos sanguíneos e no interior do tumor durante uma duração de tratamento de RF de 4,5 minutos. perfusão tumor reforçada é particularmente evidente quando se comparam Fig 7A e 7B para o início e pontos finais (0 e 4,5 minutos, respectivamente) para o único (azul) canal de albumina. Os arquivos de vídeo completas (editado para remover jitter imagem devido à respiração do mouse) estão em S3 e S4 Filmes. Para um controlo, a mesma experiência foi representada por imagem sem exposição a RF (Figura 7E) durante 30 minutos. Uma barreira de perfusão prejudicada é evidente como albumina não penetrar no interior do tumor durante a sessão de imagem (30 min, a Fig 7E). Esta característica é prejudicada perfusão de tumores devido à alta pressão, vasculatura caótica, e a compressão resultante vaso tumoral [34, 35]. perfusão vascular Limited foi observada em vários mouses durante o exame sessões com duração de até uma hora.

exposição RF mostra transporte de albumina ligada fluorescente através da barreira de perfusão na região do tumor. Figura (A) e (B) representam o canal de imagem azul (albumina) antes e depois (4,5 min) a exposição RF. Esta informação é mostrado sobreposto com o canal do tumor (vermelho) na figura (C) e (D). Figura rato (E) Controlo (sem RF) foi representada por imagem durante 30 minutos em ambos os canais. Não há transporte de albumina para o tumor através da barreira de perfusão. (F) O tempo decorrido imagens dos dados mostrados na Figura (A) e (B). O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.