Abstract
A versão beta do fator de crescimento transformador (TGF-β) via de sinalização é uma via de supressor de tumor que é comumente inativado no cancro colorectal (CRC). A inactivação de TGFBR2 é o acontecimento genético mais comum que afecta a via de sinalização de TGF-β. No entanto, o mecanismo pelo qual as células cancerosas regular negativamente TGFBR2 não é clara. Neste estudo, verificou-se que os níveis de proteína foram consistentemente TGFBR2 regulada positivamente em tecidos de CRC, ao passo que os seus níveis de ARNm variou nestes tecidos, sugerindo que um mecanismo pós-transcricional está envolvido na regulação da TGFBR2. Porque microRNAs (miRNAs) são potentes reguladores pós-transcricional da expressão do gene, foi realizada bioinformática análises de pesquisa para miRNAs que potencialmente visam TGFBR2. Identificamos o site segmentação específica de miR-135b na região 3′-não traduzida (3′-UTR) do TGFBR2. Nós ainda identificada uma correlação inversa entre os níveis de miR-135b e proteína TGFBR2, mas não ARNm, em amostras de tecido de CRC. Por sobre-expressam ou silenciamento de miR-135b em células de CRC, que validada experimentalmente que o miR-135b liga-se directamente para a 3′-UTR do transcrito TGFBR2 e regula a expressão TGFBR2. Além disso, as consequências biológicas da segmentação de TGFBR2 por miR-135b foram examinados usando em ensaios de proliferação celular e apoptose in vitro. Nós demonstramos que o miR-135b exerceu um efeito indutor de tumores por induzir a proliferação e inibir a apoptose de células de CRC através da regulação negativa da expressão TGFBR2. Tomados em conjunto, os nossos resultados fornecem a primeira evidência apoiando o papel de miR-135b como um oncogene em CRC através da inibição da tradução TGFBR2
Citation:. Li J, Liang H, Bai M, Ning T, Wang C , Fan Q, et al. (2015) miR-135b promove o câncer Progressão por Segmentação Fator Transformador de Crescimento Beta Receptor II (TGFBR2) em câncer colorretal. PLoS ONE 10 (6): e0130194. doi: 10.1371 /journal.pone.0130194
Editor do Academic: Shrikant Anant, Universidade de Kansas School of Medicine, Estados Unidos
Recebido: 09 de fevereiro de 2015; Aceito: 16 de maio de 2015; Publicação: 10 de junho de 2015
Direitos de autor: © 2015 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation Natural da China (No. 81201946, 81372394, 81250044, 81401257), o Ministério da Educação Fundo de Investigação do doutoramento programa (nº 2012202120013), a Fundação de Ciências da Universidade de Medicina de Tianjin (No.2011KY15), a Plataforma Nacional de Pesquisa de Tecnologia Clínica de Avaliação de Novos Anticancer Drugs (No. 2013ZX09303001). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer colorretal (CRC) é atualmente o terceiro tumor maligno mais comum ea segunda principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo [1]. A acumulação de alterações genéticas e epigenéticas medeia a formação de CRC e progressão através da desregulamentação principais vias de sinalização em células cancerosas [2,3]. Em CRC, uma das vias de sinalização mais comumente inactivada é o factor de crescimento transformador beta (TGF-β) via de sinalização, que tem sido associada com o estabelecimento e a progressão de tumores intestinais [4].
O TGF- β via de sinalização desempenha um papel importante em muitos processos celulares, incluindo a regulação do ciclo celular, a migração celular, a apoptose, e modulação imune por meio de duas relacionadas serina transmembranar /receptores treonina-cinase, tipo I e tipo II de serina /treonina-cinase de receptores [5]. sinalização de TGF-β é iniciada quando o ligando se liga ao receptor de tipo II, a qual é seguida pela dimerização do receptor de tipo II com o receptor de tipo I. Dentro deste complexo heteromérica, os fosforila receptores do tipo II e ativa o receptor de tipo I quinase, que propaga o sinal, visando componentes a jusante desta via [6]. A via de sinalização de TGF-β actua como um supressor de tumor durante a fase inicial de CRC, que é frequentemente inactivado através da regulação negativa de TGFBR2 [7]. Uma diminuição nos níveis de expressão TGFBR2 tem sido associado com o aumento da tumorigenicidade de um número de tumores humanos, incluindo CRC [8]. A inactivação de TGBR2 devido à alteração genética ou promotor metilação tem sido relatada em cancros do esófago, gástrico e da próstata [9-11]. A inativação do TGFBR2 devido a uma mutação genética ou metilação foi relatado para ocorrer principalmente no CRC microsatélite instável por causa de defeitos de reparo de DNA incompatibilidade [12-14]. No entanto, os tumores que apresentam instabilidade de microssatélites representam apenas 10-15% de todos os casos de CRC [15]. O mecanismo subjacente não incompatibilidade reparação deficiente CRC permanece obscuro. Estas observações sugerem que outros mecanismos moleculares podem estar envolvidos na regulação negativa da TGFBR2; esta hipótese requer uma investigação mais aprofundada.
Os microRNAs (miRNAs) são uma classe de pequenos não codificante, RNAs de fita simples que desempenham um papel importante na regulação da expressão do gene ao nível pós-transcricional [16-18 ]. Evidências recentes indicaram que miRNAs pode funcionar como oncogenes ou supressores tumorais por genes relacionados com o cancro reprimindo [19]. Alterações da expressão de miARN foram observados numa variedade de tumores humanos, incluindo CRC [20,21]. Alguns destes miRNAs têm atraído atenção especial devido ao seu envolvimento na iniciação, progressão e metástase de cancros humanos [22,23]. Por exemplo, o miR-143 e miR-145 (miR-143/145) são regulados negativamente em muitos tipos de cancro, incluindo CRC [24,25]. Além disso, foi relatado que o miR-143/145 actuam como supressores de tumores através da inibição da tradução KRAS em CRC humano [26-28]. Estes resultados sublinham a necessidade de uma pesquisa em profundidade para miRNAs que são expressas de forma aberrante durante a carcinogênese colorretal ea necessidade de uma investigação intensiva do seu papel na biologia do tumor.
Embora a desregulamentação dos TGFBR2 e miRNAs está associada com tumorigênese no CRC humana, pouco se sabe sobre o que miRNAs agir em TGFBR2. Neste estudo, a hipótese de que TGFBR2 é alvo de miR-135b. Após a medição dos níveis de miR-135b e TGFBR2 expressão em tecidos CRC e emparelhado tecidos não cancerosos, detectamos uma correlação inversa entre o miR-135b e expressão TGFBR2 no CRC. Além disso, neste estudo, foi confirmada experimentalmente a regulação direta de TGFBR2 por miR-135b e o papel biológico do regulamento miR-135b-mediada de expressão TGFBR2 no CRC humano.
Materiais e Métodos
tecido
Human
tecidos CRC e emparelhados tecidos não cancerosos adjacentes foram obtidas de pacientes submetidos a procedimentos cirúrgicos no Hospital Gulou Affiliated da Universidade de Nanjing (Nanjing, China). Tanto o tumor e os tecidos não cancerosos foram submetidos à análise histológica para confirmação diagnóstica. O tipo patológico de cada câncer foi identificado como adenocarcinoma. consentimento por escrito foi fornecido por todos os pacientes ou seus responsáveis, e Comité das Primeiro Hospital Filiado de Anhui Medical University de Ética aprovou todos os aspectos deste estudo. Os fragmentos de tecido foram imediatamente congeladas em azoto líquido no momento da cirurgia e foram armazenadas a -80 ° C. As características clínicas dos pacientes estão listadas na Tabela S1.
cultura celular
As linhas celulares de CRC humanos HT-29 e SW-480 foram comprados do Instituto Xangai de Biologia Celular do chinês Academy of Sciences (Xangai, China). As células HT-29 e SW-480 foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Gibco, Carlsbad, CA, EUA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Gibco) numa incubadora humidificada a 37 ° C em 5% de CO
2.
isolamento de ARN e RT-PCR quantitativo
o ARN total foi extraído a partir das células cultivadas e tecidos, utilizando o reagente Trizol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Ensaios para quantificar miARNs maduros foram realizados usando sondas TaqMan miARN (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, 1 jag de RNA total foi transcrito reverso-em ADNc utilizando transcriptase inversa de AMV (Takara, Dalian, China) e um iniciador de haste-laçada RT (Applied Biosystems). As condições de reacção foram as seguintes: 16 ° C durante 30 min, 42 ° C durante 30 min e 85 ° C durante 5 min. PCR em tempo real foi realizado utilizando um kit de PCR TaqMan e um Biosystems 7500 Sequence Detection System (Applied Applied Biosystems). As reacções foram incubadas numa placa óptica de 96 poços a 95 ° C durante 5 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 1 min. Todas as reacções foram realizadas em triplicado. Após as reações foram completo, o limite de ciclo (C
T) dados foram coletados por meio de configurações de limites fixos, ea média C
T foi determinada a partir PCRs em triplicado. Um método C
T comparativa foi utilizado para comparar cada transcrito para os controlos. U6 snRNA foi usada como um controlo interno, e a quantidade relativa de miARN normalizadas para os níveis de snRNA U6 foi calculada usando a fórmula 2
-ΔΔCT, em que ΔΔC
T = (C
T miARN – C
T U6)
– alvo (C
T miRNA – C
T U6)
controle
Para quantificar os níveis TGFBR2 e GAPDH mRNA, 1 ug do total. O ARN foi transcrito reverso-em ADNc utilizando oligo d (T) 18 primers (Takara) e transcriptase inversa ThermoScript (Invitrogen). As condições de reacção foram as seguintes: 42 ° C durante 60 min e 70 ° C durante 10 min. PCR em tempo real foi realizada em seguida, o produto de RT, corante SYBR Green (Invitrogen) e iniciadores específicos para TGFBR2 ou GAPDH. As sequências dos iniciadores eram as seguintes: TGFBR2 sentido: 5′-GTAGCTCTGATGAGTGCAATGAC-3 ‘; TGFBR2 anti-sentido: 5’-CAGATATGGCAACTCCCAGTG-3 ‘; GAPDH sentido: 5’-GATATTGTTGCCATCAATGAC-3 ‘; e GAPDH anti-sentido: 5’-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3 ‘. As reacções foram incubadas a 95 ° C durante 5 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 30 s e 72 ° C durante 1 min. Após as reacções foram concluídas, o C
T valores foram determinados de acordo com um limiar fixo. A quantidade relativa de ARNm TGFBR2 foi normalizada para o nível de ARNm de GAPDH.
miARN superexpressão
miARN sobre-expressão foi alcançada através da transfecção de células com um miARN mímico, que é um duplex ARN oligonucleótido sintético imitando o miARN sequência precursora. moléculas de RNA sintéticas, incluindo pré-miR-135b e uma RNA controle negativo mexidos (pré-miR-controle), foram adquiridos de GenePharma (Xangai, China). As células HT-29 e SW-480 foram semeadas em placas de 6 poços e foram transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) no dia seguinte, quando as células foram de aproximadamente 70% confluentes. Para as experiências sobre-expressão de miARN, foram utilizados 100 pmol de pré-miR-135b. Após 6 h, a forma das células HT-29 e SW-480 foi mudado para meio RPMI-1640 suplementado com soro fetal bovino a 2%. As células foram colhidas às 24 h ou 48 h após a transfecção para o isolamento de ARN total ou proteína, respectivamente.
construção do plasmídeo e a eficiência siARN ensaio
Um plasmídeo de expressão de mamífero (pReceiver-M98 -TGFBR2) especificamente concebido para expressar o quadro completo de leitura aberta (ORF) de TGFBR2 humana sem o miR-135b-responsivo 3′-UTR foi comprado de FulenGen (Cantão, China). Um plasmídeo vazio serviram como um controlo negativo. A sequência de siRNA (5′-GATTCAAGAGTATTCTCACTT-3 ‘) visando TGFBR2 humano foi desenhado e sintetizado por Ribobio (Guangzhou, China). Um siARN mexidos (Ribobio) foi utilizado como um controlo negativo. A sobre-expressão ou plasmídeo foi transfectado em siRNA HT-29, utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. ARN ou proteína total foi isolado de 24 h ou 48 h após a transfecção. Os níveis de mRNA TGFBR2 e expressão de proteínas foram avaliados através de RT-PCR quantitativo e Western blot, respectivamente.
repórter luciferase ensaio
Todo o 3′-UTR de TGFBR2 humana foi amplificado através de PCR utilizando humana ADN genómico como molde. Os produtos de PCR foram, em seguida, inserido no plasmídeo PMIR-REPORT (Ambion, Austin, TX, EUA). A inserção bem-sucedida dessa sequência foi confirmada através de sequenciação de ADN. Para avaliar a especificidade de ligação, as sequências que interagem com a região de semente de miR-135b foram mutados (a partir de AGCUAUG UCGAUAC para o miR-135b local de ligação), e o mutante TGFBR2 3′-UTR foi inserido num plasmídeo repórter de luciferase equivalente. Para os ensaios de repórter de luciferase, HT-29 e SW-480 células foram semeadas em placas de 24 poços e co-transfectadas com 0,8 ug do plasmídeo repórter de luciferase de pirilampo, 0,8 ug do β-galactosidase (β-gal) plasmídeo de expressão (Ambion ), e quantidades iguais (20 pmol) do miR-135b mímica ou de um RNA de controlo negativo misturados usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). O plasmídeo β-gal foi utilizado como controlo da eficiência de transfecção. As células foram colhidas 24 h após a transfecção e foram submetidos ao ensaio da actividade da luciferase utilizando um kit de ensaio de luciferase (Promega, Madison, WI, EUA).
isolamento de proteínas e Western blot
ou células os tecidos foram lisadas em tampão de lise RIPA (Tris-HCl a 50, 150 mM de NaCl, 0,1% de SDS, 1% de NP-40, 0,25% de desoxicolato de sódio e 1 mM de EDTA, pH 8,0) contendo recentemente adicionado cocktail de inibidor de protease (Roche) para 30 min em gelo e em seguida foram centrifugados a 16000 x g a 4 ° C durante 10 min. O sobrenadante foi recolhido e a concentração de proteína foi calculada usando um kit de ensaio de proteína BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA). As proteínas foram separadas por meio de SDS-PAGE (Bio-Rad). Após a electroforese, as proteínas foram electrotransferidas para membranas de PVDF (Bio-Rad) e depois bloqueadas com leite desnatado a 5% durante 1 h. As membranas foram depois incubadas em anticorpos primários a 4 ° C durante 12 h. Após três lavagens em TBST, as membranas foram incubadas em anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano durante 1 h à temperatura ambiente. Após três lavagens, as membranas foram incubadas em substrato de quimioluminescência SuperSignal West Pico (Pierce). A mesma membrana foi sondada com um anticorpo GAPDH para servir como um controlo de carga. Os anticorpos contra TGFBR2 e GAPDH foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (SC-400 e SC-365062, respectivamente; Santa Cruz, CA, EUA).
proliferação celular ensaio
HT-29 células foram semeadas a 5 x 10
4 culas por po em placas de 96 poços e em seguida incubadas durante a noite em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de FBS. As células foram colhidas às 12, 24, 36, 48 ou 60 h pós-transfecção. Após a transfecção, 10 uL de contagem celular Kit-8 solução (CK04-500, Dojindo) foi adicionado aos poços correspondentes testado e incubado durante 1 h. A absorvância foi medida a um comprimento de onda de 450 nm. Todas as experiências foram realizadas em triplicado.
ensaios de apoptose
A apoptose de células HT-29 foi avaliada utilizando um iodeto de anexina V-FITC /propídio (PI) a coloração ensaio. As células HT-29 foram cultivadas em placas de 12 poços e transfectaram-se com pré-miR-135b, anti-miR-135b, TGFBR2 ARNsi, ou a sobre-expressão do plasmídeo TGFBR2 para induzir apoptose. Pré-miR-controlo, anti-miR-controlo, ARNsi de controlo, e um plasmídeo de controlo serviram como controlos negativos. As células foram cultivadas durante 24 h em meio empobrecido em soro; então, o anexo e células flutuantes foram colhidas. A análise de citometria de fluxo das células apoptóticas foi realizada utilizando um kit de anexina V-FITC /PI coloração (BD Biosciences, CA, EUA). Após lavagem com PBS frio, as células foram ressuspensas em tampão de ligação (HEPES 100 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM e CaCl 25 mM
2), seguido por coloração com anexina V-FITC /PI, à temperatura ambiente na escuro durante 15 min. As células apoptóticas foram então avaliadas por gating as células V-positivos a IP e anexina utilizando um activada por fluorescência (FACS) de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) e separação de células. Todas as experiências foram realizadas em triplicado.
Além disso, os núcleos foram coradas com DAPI para avaliar as alterações morfológicas em células apoptóticas. Resumidamente, após a transfecção e cultura durante 24 h em meio empobrecido em soro, células HT-29 foram coradas com DAPI durante 15 min a 37 ° C sob 5% (v /v) de CO2. Após lavagem com PBS frio e fixa em 4% (v /v) de formalina, as células foram examinadas utilizando um microscópio Olympus IX81 (200 ×) equipado com X-CITE fluorescência iluminação (Série 120Q; azul de fluorescência). A extensão da apoptose foi quantificada por cálculo da razão do condensado de núcleos totais. Os resultados foram mostrados a partir dos dados de três experiências independentes com 3 campos microscópicos acaso de cada amostra. núcleos condensado no campo microscópico foram contadas.
A análise estatística
Todas as imagens de Western blot e Ensaio de proliferação são representativos de pelo menos três experiências independentes. Os ensaios de RT-PCR quantitativo e repórter de luciferase foram realizados em triplicado, e cada experimento indivíduo foi repetido várias vezes. Os resultados são apresentados como a média ± SE de pelo menos três experiências independentes. As diferenças observadas foram consideradas significativas a p 0.05 com base em teste t de Student.
Resultados
A sobre-regulação da proteína TGFBR2, mas não mRNA, em tecidos CRC
Em primeiro lugar, determinaram os padrões de TGFBR2 expressão em humanos tecidos CRC. Depois de medir os níveis de proteína de TGFBR2 em cinco CRC e tecidos normais adjacentes emparelhados, verificou-se que os níveis de proteína TGFBR2 foram dramaticamente reduzidos nos tecidos CRC em comparação com os tecidos adjacentes normais (Figura 1A e 1B). No entanto, embora a proteína TGFBR2 foi consistentemente regulada negativamente no tecido CRC, os níveis de ARNm TGFBR2 não diferiram significativamente entre os tecidos cancerosos e cancerosos (Fig 1C). Esta disparidade entre a expressão da proteína e mRNA de TGFBR2 no CRC sugere fortemente que um mecanismo pós-transcricional está envolvido na regulação da TGFBR2.
(A e B) Análise de Western blot dos níveis de proteína TGFBR2 em cada cinco emparelhado CRC e amostras de tecido normal adjacente (NAT). A: imagem representativa; B: análise quantitativa. (C) RT-PCR quantitativo de análise dos níveis de ARNm TGFBR2 em cinco amostras de tecido de CRC e NAT emparelhados. * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001.
Identificação dos locais alvo miR-135b conservadas dentro da 3’UTR do TGFBR2
Três algoritmos computacionais, TargetScan [29], Miranda [30] e PicTar [31 ], foram utilizados em combinação para identificar potenciais miARNs que alvejam TGFBR2. Todos os três algoritmos previram miR-135b como um regulador de TGFBR2. As interacções previstos entre os locais alvo dentro da 3’UTR do TGFBR2 miR-135b e são ilustrados na Fig 2A. foi observada uma hibridação entre previu miR-135b e a 3′-UTR de TGFBR2. Houve complementaridade perfeita entre a região da semente (a sequência de núcleo que abrange os primeiros 2-8 bases da miARN maduro) e a sequência alvo putativo. O valor mínimo de energia livre da hibridação entre o miR-135b e TGFBR2 era -20,7 kcal /mol, o que está bem dentro da gama de pares de miARN alvo genuínos. Além disso, as sequências de ligação de miR-135B na TGFBR2 3′-UTR foram altamente conservado entre as espécies. Assim, o miR-135b foi seleccionado para um controlo mais experimental da sua ligação a TGFBR2.
(A) Representação esquemática dos duplexes hipotéticos formado pela interacção entre os locais de ligação no TGFBR2 3′-UTR (topo) e miR-135b (em baixo). O valor de energia livre previu dessa interação é indicado. Os locais de reconhecimento de sementes são indicados, e em todos os nucleótidos estas regiões são altamente conservadas através de várias espécies, incluindo a humana, de ratinho e de rato. (B) Análise de RT-PCR quantitativa dos níveis de miR-135B em cinco amostras de tecido de CRC e NAT emparelhados. (C) curva de correlação de Pearson de dispersão da mudança dobra de miR-135b e proteína TGFBR2 em tecidos CRC humanos. (D) curva de correlação de Pearson de dispersão da mudança dobra de miR-135b e mRNA TGFBR2 em tecidos CRC humanos. * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001.
Identificação de uma correlação inversa entre os níveis de miR-135b e os níveis de proteína TGFBR2 em tecidos CRC
miRNAs são geralmente pensados para exibir padrões de expressão que são opostos aos do seus alvos [16-18]. O interesse na relação entre miR-135b e TGFBR2 também foi apoiado pela recente identificação desse miRNA como um oncogene candidato e de TGFBR2 como um supressor tumoral em CRC [2,32]. A seguir, investigou se os níveis de miR-135b inversamente correlacionada com os níveis de expressão de proteína TGFBR2 em tecidos CRC. Depois de determinar os níveis de miR-135b em cinco pares de CRC e tecidos normais adjacentes, verificou-se que o nível de miR-135b expressão foi significativamente aumentada em tecidos de CRC (Fig 2B). A correlação inversa entre os níveis de proteína TGFBR2 miR-135b e (Fig 2C) e a disparidade entre os níveis de miR-135b e TGFBR2 mRNA (Fig 2D) foram ainda ilustrado usando parcelas de correlação de Pearson de dispersão. Estes resultados indicaram que o nível de expressão de miR-135b inversamente correlacionado com o nível de expressão de proteínas em tecidos TGFBR2 CRC humanos. Assim, TGFBR2 foi determinada como sendo um alvo de miR-135b baseado em ambas as previsões computacionais e a correlação inversa entre os níveis de miR-135b e proteína TGFBR2, mas não ARNm, em CRC.
Validação de TGFBR2 como um alvo directo de
miR-135b
a correlação entre o miR-135b e expressão TGFBR2 foi ainda analisada por avaliação da expressão TGFBR2 nas linhas celulares de CRC humanos HT-29 e SW-480 após a sobre-expressão e knockdown de miR-135b . Nestas experiências, a sobre-expressão de miR-135b foi conseguida por transfecção de HT-29 e células SW-480 com pré-miR-135b, que é um oligonucleótido de ARN sintética que imita o precursor de miR-135b; Considerando knockdown miR-135b foi conseguida por células com anti-miR-135b (oligonucleótidos anti-sentido modificados concebidos para direccionar especificamente amadurecer o miR-135b) transfecção. A sobre-expressão eficiente ou knockdown de miR-135b é demonstrado na Figura 3A. Claramente, os níveis de miR-135b celulares foram significativamente aumentada quando as células HT29 e SW480 foram transfectadas com pré-miR-135b e caiu dramaticamente quando as células HT29 e SW480 foram tratados com anti-miR-135b. A expressão da proteína TGFBR2 foi significativamente inibida pela introdução de pré-miR-135b em HT29 (Fig 3B) e SW480 (Fig 3C) células, enquanto que o anti-miR-135b aumentou significativamente o nível de proteína TGFBR2 em HT29 (Fig 3B) e células SW480 (Fig 3C). Para determinar o nível em que o miR-135b regula a expressão TGFBR2, repetiu-se as experiências acima e examinaram a expressão de ARNm TGFBR2 após a transfecção. A sobre-expressão ou knockdown de miR-135b não afectar a estabilidade do mRNA de TGFBR2 (Fig 3D). Estes resultados demonstraram que o miR-135b regula especificamente a expressão TGFBR2 ao nível pós-transcricional, o qual é o mecanismo mais comum de acção animais miARN.
(A) análise de RT-PCR quantitativa dos níveis de miR-135B em células HT-29 e SW-480 tratados com pré-miR-control mexidos, pré-miR-135b, anti-miR-controlo ou anti-miR-135b. (B e C), análise de transferência de Western dos níveis de proteínas TGFBR2 em HT-29 e SW-480 células tratadas com pré-miR-controlo, pré-miR-135b, anti-miR-controlo ou anti-miR-135b. B: Imagem representativa; C: análise quantitativa. (D) Análise de RT-PCR quantitativa dos níveis de mRNA TGFBR2 em HT-29 e SW-480 células tratadas com pré-miR-controlo, pré-miR-135b, anti-miR-controlo ou anti-miR-135b. (E) a ligação directa do TGFBR2 3′-UTR de miR-135b. As células HT-29 e SW-480 foram co-transfectadas com um repórter de luciferase de pirilampo contendo quer de tipo selvagem (WT) ou os locais de ligação mutante (Mut) miR-135b na TGFBR2 3′-UTR e quer pré-miR-controlo ou pré-miR-135b. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram avaliadas utilizando um kit de ensaio de luciferase. Os resultados são apresentados como a razão entre a actividade da luciferase do pirilampo nas células transfectadas com o miR-135B para que nas células de controlo. * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001.
Para determinar se os efeitos reguladores negativos de miR-135b sobre a expressão TGFBR2 foram mediados pela ligação de miR-135b para os locais alvo previstos na 3′-UTR do mRNA TGFBR2, o comprimento total 3’UTR do TGFBR2 contendo o sítio de ligação de miR-135b previsto foi inserido a jusante do gene da luciferase de pirilampo num plasmídeo repórter. O plasmídeo resultante foi co-transfectado em HT-29 e células SW-480 com um plasmídeo de controlo da transfecção (β-gal) e ou pré-miR-135b ou um ARN de controlo negativo mexidos. Como esperado, a actividade de luciferase foi marcadamente reduzida nas células transfectadas com pré-miR-135b. Além disso, introduzimos mutações pontuais nos locais complementares correspondentes no 3′-UTR de TGFBR2 para perturbar os locais de ligação de miR-135b previstos. Este repórter de luciferase mutante não foi afectada pela sobre-expressão de miR-135b (Figura 3E). Esse achado sugere que o miRNA putativo de ligação locais de TGFBR2 contribuir fortemente para essa interação miRNA-mRNA, que medeia a repressão pós-transcricional da expressão TGFBR2. Em conclusão, os nossos resultados demonstraram que o miR-135b liga-se directamente para a 3′-UTR do mRNA TGFBR2 para suprimir a expressão em células de CRC TGFBR2.
miR-135b promove a proliferação e inibe a apoptose de células de CRC alvejando TGFBR2
a seguir, analisadas as consequências biológicas da repressão miR-135b-driven de expressão TGFBR2 em células CRC. Em primeiro lugar, investigou se a sobre-expressão ou silenciamento de TGFBR2 afeta a proliferação de células HT-29 e apoptose. Para derrubar expressão TGFBR2, a sequência de siRNA segmentação diferentes locais de cDNA TGFBR2 humano foi projetado e transfectado em células HT-29. Para sobrexpressar TGFBR2, um plasmídeo que expressa o TGFBR2 ORF foi transfectado em células HT-29. A sobre-expressão eficiente de TGFBR2 é demonstrado na Figura 4A e 4B. Consistente com estudos anteriores que mostraram que TGFBR2 inibe a proliferação de células [3], células HT-29 em que a expressão TGFBR2 foi derrubado utilizando siRNA proliferaram a uma taxa significativamente mais elevada, ao passo que as células transfectadas com o plasmídeo superexpressão TGFBR2 exibiu proliferação significativamente reduzida (Figura 4C e 4D). Do mesmo modo, células HT-29 em que a expressão TGFBR2 foi derrubado utilizando siRNA exibiram um aumento significativo da apoptose, enquanto que as transfectadas com o plasmídeo superexpressão TGFBR2 exibiram reduzida apoptose (Figura 4E).
(A e B) Análise de transferência de Western dos níveis de proteína TGFBR2 em HT-29 células tratadas com controle mexidos siRNA, TGFBR2 siRNA, controle de vetores ou TGFBR2 vetor. A: imagem representativa; B: análise quantitativa. Os ensaios (C) CCK8 de viabilidade celular foram realizadas 12, 24, 36, 48 e 60 h após a transfecção de células HT-29 com ARNsi de controlo, quer mexidos ou TGFBR2 siARN. (D) os ensaios de viabilidade celular CCK8 foram realizadas 12, 24, 36, 48 e 60 h após a transfecção de células HT-29 com qualquer vector de controlo ou TGFBR2 vector. Os ensaios de (E) Apoptose foram realizados após a transfecção de células HT-29 com ARNsi de controlo scrambled, TGFBR2 siRNA, vector de controlo ou TGFBR2 vector. Painel esquerdo: imagem representativa; painel direito: análise quantitativa. * P 0,05; ** P 0,01.
A seguir, analisadas as consequências biológicas da supressão de miR-135b-mediada de expressão TGFBR2 em células CRC. Em apoio à noção de que as funções miR-135b como um miRNA proto-oncogénico principais [32], células HT-29 transfectadas com pré-miR-135b exibiu aumento da proliferação; Em contraste, o knockdown de miR-135b teve o efeito oposto sobre a proliferação celular (Fig 5A). Além disso, em comparação com as células transfectadas com o pré-miR-135b, as células co-transfectadas com pré-miR-135b e o plasmídeo superexpressão TGFBR2 exibiram uma taxa de proliferação celular significativamente reduzida (Figura 5F), sugerindo expressão TGFBR2 que resistente a miR-135b resgatou a supressão da expressão TGFBR2 por miR-135b e atenuou o efeito pró-proliferativa de miR-135b.
CCK-8 ensaios de viabilidade celular (a) foram realizadas 12, 24, 36, 48 e 60 h após a transfecção de células HT-29 com pré-miR-controlo, pré-miR-135b, anti-miR-controlo ou anti-miR-135b. (B-E) ensaios de apoptose foram efectuados 24 horas após a transfecção de células HT-29 com pré-miR-controlo, pré-miR-135b, anti-miR-controlo ou anti-miR-135b. B: percentagem representativa das apoptóticas células HT-29, utilizando análise de citometria de fluxo; C: percentagem representativa das apoptóticas células HT-29, utilizando coloração com DAPI; D: Imagem representativa, utilizando análise por citometria de fluxo; C: Imagem representativa de apoptóticos células HT-29, utilizando a coloração DAPI. * P 0,05; ** P 0,01. 8-CCK ensaios de viabilidade celular (F) foram realizadas 12, 24, 36, 48 e 60 h após a transfecção de células HT-29 com o controlo scrambled miARN e o vector de controlo, o controlo scrambled miARN e o vector TGFBR2, pré- miR-135b e o vector de controlo, ou pré-miR-135b e o vector TGFBR2. Os ensaios (GJ) Apoptose foram realizadas 24 horas após a transfecção de células HT-29 com o controlo scrambled miARN e o vector de controlo, o controlo scrambled miARN e o vector TGFBR2, pré-miR-135b e o vector de controlo, ou pré-miR -135b e o vector TGFBR2. L: percentagem representativa das apoptóticas células HT-29, utilizando análise de citometria de fluxo; H: percentagem representativa das apoptóticas células HT-29, utilizando coloração com DAPI; I: imagem representativa, utilizando análise por citometria de fluxo; J: Imagem representativa de apoptóticos células HT-29, utilizando a coloração DAPI. * P 0,05; ** P 0,01.
Foram investigados os efeitos de miR-135b na apoptose de células CRC através de análise de citometria de fluxo e coloração DAPI. Os resultados mostraram que a percentagem de células apoptóticas foi significativamente menor entre as células HT-29 transfectadas com pré-miR-135b, mas foi mais elevada entre as células HT-29 transfectadas com anti-miR-135b (Fig 5B, 5C, 5D e 5E ). Além disso, quando as células HT-29 foram simultaneamente transfectadas com o pré-miR-135b e o plasmídeo superexpressão TGFBR2, o efeito anti-apoptótico de miR-135b foi drasticamente atenuado (Fig 5G, 5H, 5I e 5J). Estes resultados indicaram que o miR-135b pode modular a apoptose de células por regulação negativa TGFBR2 em células de CRC.
Discussão
A via de sinalização de TGF-β desempenha um papel complexo na progressão maligna dos tumores, e os seus efeitos, tais como inibição do crescimento, apoptose, diferenciação e outros regulada-TGF-p processos, parece ser dependente do contexto [33]. TGFBR2 expressão é necessária para a sinalização de TGF-β para regular a especificidade da sua activação da via de sinalização e os seus efeitos biológicos [34].