Abstract

HRAS

é um proto-oncogene envolvido na tumorigênese do câncer de bexiga . Na

promotor HRAS

foram identificados dois elementos G-ricos,

HRAs

-1 e

HRAs

-2, que vezes, respectivamente, em um antiparallel e um quádruplo paralela (

qhras

-1,

qhras

-2). Quando introduzimos em sequência

HRAs

-1 ou

HRAs

-2 duas mutações pontuais que bloqueiam a formação quádruplo, transcrição aumento de 5 vezes, mas quando estabilizado o G-quadruplexes por ftalocianinas de guanidina, transcrição diminuiu para 20% do controlo. Pelo chip encontramos essa sequência

HRAs

-1 é vinculado apenas pela MAZ, enquanto

HRAs

-2 está vinculado por MAZ e SP1: dois factores de transcrição que reconhecem caixas de guanina. Nós também descoberto pela EMSA que recombinante MAZ-GST liga-se tanto

HRAS

quadruplexes, enquanto SP1-GST única liga-se ao

qhras

-1. A expressão excessiva de MAZ e Sp1 sinergicamente activa

HRAS

transcrição, ao mesmo tempo silencia cada gene por resultados de RNAi em uma forte diminuição da regulação da transcrição. Todos estes dados indicam que os

HRAS

G-quadruplexes comportar como repressores de transcrição. Finalmente, nós projetamos oligonucleotídeos chamariz imitando o

HRAS

quadruplexes, tendo -1-O- [4- (1-pireniletinil) fenil] glicerol e LNA modificações (R) para aumentar a sua estabilidade e resistência nuclease (G4- chamarizes). As G4-chamarizes reprimida

HRAS

transcrição e causou um forte efeito anti-proliferativo, mediada por apoptose, em células de cancro da bexiga T24 onde

HRAS

é mutado

Citation:. Membrino A , Cogoi S, Pedersen EB, Xodo LE (2011) Formação-DNA G4 no

HRAS

Promotor e desenho racional de Decoy oligonucleótidos para terapia do câncer. PLoS ONE 6 (9): e24421. doi: 10.1371 /journal.pone.0024421

Autor: Mark Isalan, Centro de Regulação Genômica, Espanha |

Recebido: 03 de junho de 2011; Aceito: 09 de agosto de 2011; Publicação: 08 de setembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Membrino et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. AIRC 2010 “Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro”. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscruipt

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

A família de genes ras consiste em três proto-oncogenes funcionais (

HRAS

,

ARN

e

KRAS

) que codificam para proteínas de ligação de guanina que compartilham uma alta homologia (p21

RAS) [1]. Estas proteínas, localizados na membrana celular interna através de um grupo farnesilo [2], são activos quando eles são obrigados a GTP e inactiva quando GTP é hidrolisado para o PIB [3]. proteínas Ras regulam as respostas celulares a vários estímulos extracelulares, incluindo mitogénios e factores de [4] diferenciação. Os genes ras são expressas de uma forma específica de tecido:

HRAS

é altamente expresso na pele e músculos esqueléticos,

KRAS

no cólon e timo e

ARN

em germinal masculina tecidos [1]. Os genes ras têm estruturas semelhantes e sequências com cinco exões, o primeiro dos quais é não-codificante, e locais de splicing conservadas. Os íntrons, em vez disso, têm diferentes comprimentos e sequências [1]. Os proto-oncogenes ras são convertidos em oncogenes por mutações pontuais que diminuem a capacidade da proteína codificada para hidrolisar GTP em GDP, com o resultado de que a p21

RAS permanece constitutivamente activa. proteínas ras hyperactivated estimular cascatas de fosforilação, incluindo a via /ERK Raf /MEK, que leva à proliferação descontrolada de células [5], [6]. Mutações nos genes ras são frequentemente encontradas em muitos tumores humanos [7], [8].

HRAS

mutações são menos comuns, mas eles têm uma prevalência elevada em papilomas da pele e tumores da bexiga [9]. Como 80% dos tumores de bexiga abrigar

HRAS

mutações [10] e mais de metade dos tumores de bexiga sobre-expressar

HRAS

[11], tanto mutação e superexpressão são fatores importantes na tumorigênese do câncer de bexiga [12]. Na verdade, ele tem sido mostrado recentemente que as expressões de baixo nível de constitutivamente activa

HRAS

induziu hiperplasia urotelial simples, enquanto a duplicação do ativada

HRAS

oncogene desencadeada em rápido crescimento e penetrantes tumores em todo o urinária trato. Dado o papel crucial do

HRAS

superexpressão e mutações no tumorigênese de cancro da bexiga, uma estratégia terapêutica atractiva poderia ser para inibir

HRAS

transcrição com moléculas que são capazes de prejudicar a atividade do gene promotor. Para este objectivo pedimos como

HRAS

transcrição é regulada. Observou-se que o promotor de

HRAS

contém inúmeras cópias do elemento GGGCGGG ou o seu complemento. Este L-caixa tem sido mostrado para interagir com o factor de transcrição Sp1 [13], [14]. A montante do local de início da transcrição (TSS) existem pistas de guaninas abrangendo mais de três locais de Sp1, que são sítios potenciais para a formação de L-quádruplo. Nós, assim, a hipótese de que os elementos rico em G pode desempenhar um papel na regulação da transcrição. G4-ADN são estruturas invulgares estabilizados por meio de matrizes planas de quatro guaninas (G-quarteto) ligadas uma à outra por ligações de hidrogénio de Hoogsteen [15]. As extremidades do terminal G-quartetos estão ligadas por laços que podem variar tanto em comprimento e topologia, dando origem a uma variedade de conformações diferentes [16]. Genome-wide análises revelaram que corre de guaninas são abundantes em regiões promotoras de genes circundantes TSS [17] – [20]. Tem sido teorizado que, por conseguinte, G4-ADN pode estar envolvido na regulação da transcrição [21] – [25]. Nosso estudo fornece evidências convincentes de que

HRAS

transcrição é regulada pela interação entre o SP1, MAZ e G4-DNA, que atua como um repressor da transcrição. Com base desta descoberta criamos oligonucleotídeos rico em G específicos para

HRAS

que têm um forte efeito anti-proliferativo em células cancerosas urinárias contendo um mutante

HRAS

. Embora a citotoxicidade de certos oligonucleotídeos rico em G tem sido relatado anteriormente, o seu mecanismo de ação ainda não é totalmente compreendido [26], [27]. Nosso estudo mostra que os oligonucleotídeos formando-quadruplex projetados podem agir sequestrando MAZ e, assim, prejudicando

HRAS

transcrição. Por seu efeito antiproliferativo potente em células cancerosas T24 bexiga urinária, G4-chamarizes parecem ser as drogas efetoras muito promissor para a terapia do cancro da bexiga urinária.

Resultados

O

HRAS

promotor é estruturalmente polimórfica

o promotor do humano

HRAS

gene carece de caixas típicos TATA e CAAT, contém um alto teor de G + C (80%) e várias cópias de GGGCGGG (G-box) , reconhecido pelo factor de transcrição Sp1 [13], [14]. Os três G-caixas mais próximos aos locais de RNA de início sobrepõem seqüências formadoras de quadruplex, ou seja,

HRAs

-1 (435-462, número de acesso J00277) e

HRAs

-2 (506-530 , J00277) (Figura 1). De acordo com um estudo recente, quadruplex-formando sequências abrangendo elementos de ligação SP1 são presente em vários genes [28]. Temos obtido um primeiro indício de que o

HRAS

promotor é estruturalmente polimórfica enquanto sequenciamento dos vetores de expressão especialmente construídos para este estudo. Quando reações primer de extensão de sequenciação foram realizadas com iniciadores complementares à cadeia G-rico, Taq polimerase inesperadamente preso em

HRAs

-2 ou

elementos HRAs

-1 G-ricos. Em contraste, com primers complementares à cadeia rica em C, não observamos qualquer impedimento. Isto sugere que ambos

HRAs

-1 e

HRAs

-2 sequências formaram estruturas incomuns. Nossa hipótese foi confirmada por ensaios de polimerase-stop. Nós projetamos dois modelos do tipo selvagem linear contendo

HRAs

-1 ou

HRAs

-2 e um modelo de mutante em que quatro mutações G → T foram introduzidos no

HRAs viajantes – 2 para evitar a formação quádruplo. reações Primer-extensão mostrou que Taq polimerase na presença de potássio preso na extremidade 3 ‘de

HRAs

-2 ou

HRAs

-1, pouco antes da primeira execução do guaninas, de acordo com a formação de uma estrutura G-quadruplex por cada elemento de G-ricos (figura S1)

Dois elementos G-ricos (

HRAs

-1 e

HRAs

. – 2) localizada a montante do sítio do início da transcrição pode potencialmente dobrar-se em estruturas de G-quadruplex. Os ricos em G elementos formadores de quadruplex conter os sítios de ligação para fatores de transcrição MAZ e SP1.

Sequências

Promotor

HRAs

-1 e

HRAs

-2 formar estruturas de DNA G4 estáveis ​​in vitro

Uma visão sobre o G-quadruplexes formados pela

HRAS

elementos G-ricos foi obtido por DMS-pegada, dicroísmo circular (CD) e de ressonância de fluorescência transferência de energia (FRET) experimentos. A Figura 2 mostra os resultados obtidos com a sequência

HRAs

-1. Os DMS-pegadas de 27-mer

HRAs

-1 em água ou tampão contendo 100 mM Li

+ ou Cs

+ (pistas 1, 4, 5) mostram que todos os guaninas reagir com DMS . Em vez disso, na presença de 50, 100 ou 140 mM de KCl (pistas 2, 3, 9), os guaninas do G-corre A-D são progressivamente protegidos, enquanto guaninas G8 e G14 na intervir “TTGC” e “CGCA “sequências não são. Este padrão de clivagem sugere que

HRAs

-1 dobra em um G-quadruplex (

qhras

-1). Na presença de 50 nM TMPyP4,

HRAs

-1 dá uma pegada forte, quer em baixa (1 mM) ou alta (100 mM) concentração de KCl (pistas 7, 8) [29]. Como esperado, a sequência mutante

h1-mut

, tendo

HRAs

-1 com quatro mutações G → T que abolir a dobrar, não dá qualquer pegada. Para determinar a orientação fio de

qhras

-1 usamos CD (Figura 2c, d). O espectro de CD de

qhras

-1 em KCl 100 mM é caracterizada por ellipticities positivos e negativos em 287 e 260 nm, respectivamente, típico de uma conformação antiparalelo [30]. Aquecer a amostra foi obtida uma curva de fusão (287 nm elipticidade

relação

temperatura) que não foi perfeitamente sobrepostas com a curva de arrefecimento, como o primeiro era ligeiramente bifásico enquanto o segundo foi monofásica. Um método mais sensível de análise foi obtida através de experiências de FRET fusão com a sequência

HRAs

-1 com FAM e TAMRA na extremidade 5 e 3 ‘, respectivamente, marcado na extremidade. Obtivemos uma curva de fusão bifásica bem resolvida com

T

M de a 53 e 67 ° C indicando que

HRAs

-1 dobras em pelo menos dois quadruplexes (Figura 2E). Quando a concentração de

HRAs

-1 foi aumentada uma ordem de grandeza de 200 nM a 2? M, a

T

M de não se alterou: um comportamento típico de uma estrutura intramolecular ( não mostrado). Em conjunto, estes dados sugerem que

HRAs

-1 adopta uma quadruplex antiparalela que pode assumir diferentes topologias: um com loops laterais é mostrado na Figura 2-F [16]. Embora sabemos por footprinting dados e os CD guaninas que estão envolvidos na formação de antiparalelo

qhras

-1, uma visão sobre a estrutura deste quádruplo só serão obtidos por RMN. A Figura 3 mostra os resultados obtidos com a sequência

HRAs

-2. Os DMS-pegadas de 24-mer

HRAs

-2 mostra que em KCl 10, 50, 100 e 140 mM (pistas 2-5), a L-A-D é executado são protegidos contra DMS, enquanto G10 , G12, G13, G21 e G22 reagir com DMS. Isso indica que as tríades de guanina formam o quádruplo deve ser G3-G4-G5, G7-G8-G9, G14-G15-G16, G18-G19-G20. O fato de que G16 mostra alguma reactividade para DMS sugere que o trecho G12-G16 pentaguanine podem participar ao quádruplo ou com G14-G15-G16 ou G13 com-G14-G15. O mutante

h2-mut sequência Comprar e tipo selvagem

HRAs

-2 em Li 100 mM

+ ou Cs

+ não deu qualquer pegada (pistas 6-8). A pegada na presença de 50 nM TMPyP4 é muito forte (pistas 9, 10). O espectro de CD de

HRAs

-2 mostra uma forte elipticidade a 260 nm, indicativo de um G-quadruplex com uma conformação paralelo (Figura 3c) [30]. Esta estrutura é tão estável que o CD a 85 ° C ainda mostra uma intensa elipticidade 260 nm. A estabilidade em várias concentrações de KCl foi determinada com a sequência de

HRAs

-2 marcado com FAM e TAMRA. Realizamos experimentos FRET ponto de fusão a 20, 40, 60, 100 e 140 mM de KCl e obteve

T

M valores de 78 a 82, 85, 90 e 92 ° C, respectivamente (Figura 3D). Neste caso, também, o

T

M de não se alterou quando a concentração foi aumentada uma ordem de magnitude (a partir de 200 nM a 2? M) (não mostrado). No geral, nossos dados demonstram que o

HRAs

-2 forma um paralelo G-quadruplex (

qhras

-2) cuja estrutura putativa inferida pela DMS-pegada e CD deve ter ou 1/1/4 ou 1/2/3 alças (Figura 3e). Uma atribuição de estrutura definitiva só será possível com base em dados de RMN.

(a) do tipo selvagem (

HRAs

-1) e mutada (

h1-mut

) sequências analisadas por DMS-pegada. praças cheias indicam DMS-reativa guaninas, quadrados abertos indicam guaninas DMS-não reactivos; (B) DMS-pegada de

HRAs

-1 em água (pista 1);

HRAs

-1 em 50 e KCl 100 mM (pistas 2 e 3);

HRAs

-1 em 100 CsCl mM ou LiCl (pistas 4 e 5);

h1-mut

em KCl 100 mM (pista 6);

HRAs

-1 em TMPyP4 50 mM, KCl 1 mM (pista 7);

HRAs

-1 em TMPyP4 50 mM, KCl 100 mM (pista 8);

HRAs

-1 em KCl 140 mM (pista 9);

h1-mut

em KCl 100 mM (pista 10); (C) os espectros de CD a 25 e 90 ° C mostram que

HRAs

-1 dobra em um G-quadruplex antiparallel; (D) as curvas de fusão para quádruplo

HRAs

-1 obtidos traçando a elipticidade 287 nm contra T. A

T

M de cerca de 63 ° C foi obtido por curvas de aquecimento e refrigeração ; (E) as curvas de FRET-fusão de quadruplex

HRAs

-1 marcado com FAM e TAMRA mostram que ela se dobra em dois G-quadruplexes com

T

M de 53 e 67 ° C (.. Ex 475 nm, Em 520 nm); (F) possíveis conformações de

HRAs

-1, com base na pegada e dados de CD, são quadruplexes antiparallel com loops laterais e laterais /diagonal. O quádruplo com laços laterais é mostrado na figura.

(a) do tipo selvagem e mutante

HRAs

-2 sequências analisadas por DMS-pegada. praças cheias indicam DMS-reativa guaninas, quadrados abertos indicam guaninas DMS-não reactivos; (B) DMS-pegada de

HRAs

-2 em água (pista 1);

HRAs

-2 em 1, 10, 50, KCl 100 mM (pistas 2-5);

HRAs

-2 em 100 LiCl mM ou CsCl (pistas 6,7);

h2-mut

em KCl 100 mM (pista 8);

HRAs

-2 em 50 nM TMPyP4, KCl 1 mM (pista 9);

HRAs

-2 em 50 nM TMPyP4, KCl 100 mM (pista 10). Guaninas G10, G12, G13 e G21, G22 são cortados enquanto que as outras guaninas não são (exceto G16 mostrando uma baixa reatividade). Mutant

h2-mut

não mostra nenhuma pegada em KCl 100 mM; (C) Os espectros de CD de quadruplex

HRAs

-2 a várias temperaturas entre 25 e 90 ° C, sugerem a formação de um G-quadruplex antiparalela; (D) fusão de FRET-quadruplex

HRAs

-2 a 20, 40, 60, 100 e 140 mM de KCl mostra apenas uma transição com T

M de 78, 82, 85, 90, 92 ° C; (E) estrutura G-quadruplex possível para

HRAs

-2, uma conformação paralelo com 1/1/4 ou 1/2/3 loops, com base em dados footprinting e CD.

G4-DNA mutações pontuais desestabilizador em

HRAs

-1 e

HRAs

-2 fortemente upregulate

HRAS

transcrição

Como sequências

HRAs

-1 e

HRAs

-2 estão localizados imediatamente a montante do local de início da transcrição e forma

in vitro

estáveis ​​G-quadruplexes, pedimos o que acontece com

HRAS

transcrição quando a capacidade de formação de quádruplo por sequências

HRAs

-1 e

HRAs

-2 é abolida. Para fazer face a este ponto, construído um plasmídeo, Phras-luc, tendo luciferase de vaga-lume impulsionado pelo

promotor HRAS

. De Phras-Luc foram obtidas por mutagénese dirigida ao local dois plasmídeos mutantes: Phras-Mut1 e Phras-Mut2, onde dois guaninas nos segundo e terceiro G-tétradas dos quadruplexes putativas foram substituídos com timina /citosina ou timinas (Figura 4a) . Estas mutações revogada a capacidade de sequências

HRAs

-1 e

HRAs

-2 a dobrar em um quádruplo (Figura S2). A de tipo selvagem e mutantes plasmídeos foram co-transfectados em células HeLa com pRL-CMV, um vector que codifica para a

Renilla luciferase

. Quarenta e oito horas após a transfecção, medimos pirilampo e

Renilla

luciferases actividade nos lisados ​​de células não tratadas e tratadas. Os resultados apresentados na Figura 4b mostram que o bloqueio da formação quádruplo provoca um aumento dramático da expressão de luciferase de pirilampo, até 5 vezes em comparação com o controlo. Isto indica fortemente que o G-quadruplexes formados por seqüências

HRAs

-1 e

HRAs

-2 são elementos estruturais do

HRAS

promotor que se comportam como repressores, como observado para o

cMyc

gene [21]

(a) Dois-DNA G4 mutações pontuais desestabilizador no

HRAs

-1 ou

HRAs

. – 2 elemento ter sido introduzida. Plasmídeo Phras-Mut1 contém uma mutação

HRAs

-1 elemento, enquanto plasmídeo Phras-Mut2 contém uma mutação

HRAs

-2 elemento; (B) Ensaio duplo luciferase mostrando que as mutações pontuais causar um aumento de até 5 vezes no

HRAS

atividade do promotor (ver Figura 5 legenda).

estabilizar G4-DNA de guanidina ftalocianinas reprimir

HRAS

transcrição

Dado que o DNA quadruplex comporta-se como um elemento repressor para

HRAS

, examinamos o efeito na transcrição de G4-DNA estabilização ligantes. Devido à sua especificidade para a ADN-G4, nas nossas experiências utilizou-se como ligandos modificados ftalocianinas: ftalocianina de tetraquis (di-isopropil-guanidina) (DIGP) e o seu derivado de Zn contendo Zn-DIGP (Figura 5a) [31] – [33] . As células HeLa foram tratados primeiro com 1 ou 5 uM DIGP ou Zn-DIGP durante 24 h e, em seguida, co-transfectadas com uma mistura de Phras-Luc e pRL-CMV. Após a transfecção, as células foram deixadas a crescer durante 48 h antes de pirilampo e

Renilla

luciferases de actividade foram medidos com um luminómetro. Como um controlo (i) que as células tratadas com TMPyP2, uma porfirina que não se liga a G4-ADN [34]; (Ii) foi utilizado como um vector repórter Phras-Mut1 ou Phras-Mut2 tendo uma L-elemento mutado incapaz de formar uma estrutura quádruplo. A Figura 5b, c, d, mostra que DIGP e Zn-DIGP inibem fortemente a luciferase a partir do tipo selvagem Phras-Luc, enquanto TMPyP2 não. Além disso, as ftalocianinas não inibem a luciferase nas células tratadas com os plasmídeos mutantes Phras-Mut1 ou Phras-Mut2, de acordo com o facto de que o G-quadruplexes não podem ser formados por estes vectores. Estes dados fornecem evidências adicionais de que quadruplexes

qhras

-1 e

qhras

-2 atuam como repressores de transcrição.

(a) Estrutura de tetraquis- (diisopropil-guanidina) ftalocianina (DIGP) utilizado, com o seu análogo de Zn contendo Zn-DIGP, para experiências de luciferase; (B) ensaios de luciferase dupla mostrando que guanidina ftalocianinas DIGP e Zn-DIGP, estabilizando

HRAs

-1 e

HRAs

-2 quadruplexes, reprimir

HRAS

atividade do promotor. Este efeito não é observado com os plasmídeos mutantes e Mut1 Phras-Phras-Mut2 (controlo) (painéis C e D). luciferase relativa é dada por R

T /R

NT × 100, em que R

T e R

NT são (firefly luciferase) /(

Renilla

luciferase) em células T24 tratada com ftalocianinas e células não tratadas. Diferenças em relação ao controle são suportados por Student

t

teste, P 0,05 (um asterisco), P . 0,01 (dois asteriscos)

Fatores de Transcrição Sp1 e MAZ ligam a quadruplex sequências que formam (QFS)

HRAs

-1 e

HRAs

-2

Como nossos dados transcrição sugerem que ambas as sequências

HRAs

-1 e

HRAs

-2 são críticos para a transcrição, perguntamos se eles são reconhecidos por proteínas nucleares. Uma resposta a esta pergunta foi obtida por ensaios de mobilidade de deslocamento com um extracto nuclear de HeLa. Figura 6a mostra que tanto o

HRAS

duplexes forma com complexos DNA-proteína distintos extrato nuclear HeLa, apontando, assim, a relevância destas sequências para

HRAS

transcrição. Ishii

et al.

Mostrou que a seqüência

HRAs

-2, que contém duas cópias de GGGCGGG, é obrigado pelo SP1 [13], [14]. No entanto, as sequências

HRAs

-1 e

HRAs

-2 também deve interagir com o fator myc associado zinc-finger transcrição (MAZ), seu local de ligação sendo (G /C) GG (C /A) GGG [35], [36]. Na verdade, tem sido relatado que MAZ e Sp1 frequentemente regular a transcrição de uma forma cooperativa [37], [38].

(a) EMSA que mostra a formação de complexos de ADN-proteína entre duplexes

HRAs

-1 e

HRAs

-2 e extracto nuclear de HeLa; quantidades de extrato utilizados (mg) são indicados, radiomarcada DNA foi cerca de 4 nM. Letras A, B e C indicam os complexos DNA-proteína; (B) análise de imunoprecipitação da cromatina, mostrando a interação de MAZ e SP1 com sequências

HRAs

-1 e

HRAs

-2. A interação entre MAZ e SP1 com a

HRAS

seqüências foi analisada por uma amplificação de PCR de 190 pb (

HRAs

-1) e 161 pb (

HRAs

-2) fragmentos. As duas bandas para MAZ:hras 1-complexos foram obtidos na presença e ausência de Mg

2+ na mistura (C) EMSA que mostra a ligação de MAZ-GST e GST-Sp1 para quadruplexes

qhras

-1 e

qhras

-2.

para provar que SP1 e MAZ se ligam a sequências

HRAs

-1 e

HRAs

-2 sob

in vivo

condições, realizamos cromatina imunoprecipitação (chip) experimentos. Vivo células HeLa foram tratadas com formaldeído para reticular os complexos DNA-proteína, cromatina foi cortado em fragmentos e, em seguida, imunoprecipitado com anticorpos anti-anti-MAZ Sp1 e (Abs). A abundância de

HRAS

sequências promotoras nos imunoprecipitados foi medida por PCR utilizando iniciadores específicos para as sequências

HRAs

-1 e

HRAs

-2. Os resultados apresentados na Figura 6b mostram que: IgG Ab não imunoprecipitar complexos DNA-proteína contendo a sequência

HRAs

-1 ou

HRAs

-2 (controle negativo); anti-MAZ Ab fez immunoprecipitate um complexo DNA-proteína contendo

HRAs

-1 e

HRAs

-2; anti-SP1 Ab puxado para baixo um complexo com

HRAs

-2. Ao medir a intensidade das bandas, descobrimos que o

HRAS

sequências foram mais abundantes nos imunoprecipitados com anti-MAZ e-SP1 anti Abs do que no immunoprecipitate IgG Ab. Concluímos, portanto, que, sob

in vivo

condições MAZ está associado a sequências

HRAs

-1 e

HRAs

-2, enquanto o SP1 está associado a sequência

HRAs

-2. Isto foi confirmado por EMSA com MAZ recombinante e Sp1 (Figura S3). Como estudos prévios mostraram que MAZ se liga a G4-ADN de murino

KRAS

[24] e

C-myb

[39] promotores, exploramos se que também se liga ao

HRAS

quadruplexes. Foi realizada EMSA com MAZ recombinante e SP1, que foram expressos em

E. proteínas de fusão coli

como GST (Figura S4). A Figura 6c mostra que a pH 7,4, KCl 50 mM,

qhras

-1 e

qhras

-2 com quantidades crescentes de forma MAZ-GST – na presença de 100 vezes o excesso de poli nonradiolabelled d (IC) – duas bandas retardadas devido à formação de dois complexos de ADN-proteína, mais provável com 01:01 e 01:02 estequiometria. É importante notar que em CsCl 50 mM, onde o

HRAS

sequências são não estruturado (ver DMS footprinting), ambos os complexos são desestabilizadas indicando que a interacção ADN-proteína é mediada pela estrutura quádruplo. Num tampão a pH 9, onde MAZ provavelmente altera a sua própria dobragem, a interacção ADN-proteína também é inibida. Nós também testamos a ligação de Sp1-GST para o

HRAS

quadruplexes e descobriu que Sp1-GST interage com o antiparallel

qhras

-1 quádruplo, mas de uma forma mais fraca em comparação com MAZ.

MAZ e Sp1 sinergicamente ativar

HRAS

transcrição

Para provar que MAZ eo SP1 estão envolvidos em

HRAS

plasmídeo de transcrição, que co-transfectadas Phras-luc em células HeLa, quer com pMAZ (que codifica para MAZ) ou pSp1 (que codifica para o SP1) ou com uma mistura de ambos os plasmídeos (Figura 7a). Quando pMAZ ou pSp1 foi co-transfectado com o vector repórter, o nível de expressão de luciferase aumentada em 50% em comparação com o controlo. Quando ambos pMAZ pSp1 e foram co-transfectadas com o vector repórter, transcrição aumentou quase três vezes ao longo de controlo, indicando que ambas as proteínas sinergicamente activada

promotor HRAS

. A sinergia foi mais forte (de 7 vezes em relação ao controle) quando pMAZ e pSp1 foram cotransfectadas com o mutante vector Phras-Mut1 ou Phras-Mut2, ostentando mutado

HRAs

-1 ou

HRAs viajantes – 2 sequências que não são capazes de formar estruturas quádruplos. Isto sugere que a transcrição é activado quando as sequências

HRAs

-1 e

HRAs

-2 estão na conformação duplex desdobrado. Além disso, como uma prova de que a transcrição requer tanto MAZ eo SP1, nós derrubado com Validado shRNA cada um dos dois fatores de transcrição em separado (Figura S5). As células HeLa foram tratados com shRNA específico para MAZ ou SP1 e os níveis de

HRAS

transcritos foram medidos por PCR em tempo real, a 48 e 72 h após o tratamento. Pode ser observado que

HRAS

transcrição foi reduzida para 30 e 20% do controlo, 48 horas após o tratamento com anti MAZ e anti Sp1 shRNA, respectivamente (Figura 7b). Tomados em conjunto os nossos dados demonstram que o

HRAS

transcrição é activado sinergicamente por MAZ e SP1.

(a) células HeLa transfectadas com Phras-luc /PRL-CMV, Phras-luc /PRL-CMV /pMAZ; Phras-Luc /pRL-CMV /pSp1; Phras-Luc /pRL-CMV /pMAZ /pSp1. Os ensaios de luciferase dupla foram realizadas 24 horas após a transfecção. luminiscence relativa é dada por R

T /R

NT × 100, em que R

NT é (firefly luciferase) /(

Renilla

luciferase) em células T24 tratada com apenas Phras-luc e pRL-CMV, enquanto que R

T é (firefly luciferase) /(

Renilla

luciferase) em células T24 tratados com Phras-luc + pMAZ e /ou pSp1 + pRL-CMV. Diferenças em relação ao controle são suportados pelo estudante de

t

teste, P 0,05 (um asterisco), P 0,01 (dois asteriscos); (B) Nível de

HRAS

transcrição em células HeLa em que MAZ ou Sp1 foi derrubado por validado shRNAs.

MAZ desestabiliza os

HRAS

G-quadruplexes

Tendo em conta que MAZ é essencial para a

HRAS

transcrição e reconhece

qhras

-1 e

qhras

-2, pedimos se estes quadruplexes são desdobradas por MAZ. Para responder a esta questão, realizamos experimentos FRET-fusão com recombinante MAZ-GST. Quadruplex

qhras

-1 com FAM e TAMRA foi incubada em 50 mM de KCl, durante 30 min na presença de quantidades crescentes de MAZ-GST ou a proteína de controlo (BSA ou tripsinogénio) marcado na extremidade. As curvas de fusão (-DF /dT) mostrou que

qhras

-1 sozinho derrete com o seu perfil típico bifásico com

T

M a 53 e 67 ° C curva (Figura 8a 1 ). Mas quando

qhras

-1 foi incubado com MAZ-GST no (moles de proteína) /(moles de DNA) relação de r = 2,5, 5, 10 (curvas 4, 5 e 6), o perfil de fusão alterados significativamente como o

T

M de caiu para ~46 ° C. Isso indica que ambos

qhras

-1 quadruplexes está desestabilizado por MAZ-GST. Como esperado, proteínas inespecíficos como BSA ou tripsinogênio em r = 10 não afetou o derretimento do

qhras

-1 (curvas de 2,3). Devido à sua alta estabilidade em potássio (

T

M = 78 ° C em KCl 10 mM),

qhras

-2 foi analisada em NaCl 100 mM, onde o

T

M foi de 65 ° C. Incubadas com MAZ-GST em r = 2,5, 5, 10, o quádruplo fundiu a 42 ° C, indicando que também in

qhras

-2 foi desestabilizada por MAZ-GST, mas não pela ASB ou tripsinogénio. Também verificou que GST não tinha influência sobre o derretimento das

HRAS

quadruplexes (Figura S6B). Um controle adicional que realizada para descartar que as proteínas bacterianas não contribuiu para quadruplex desestabilização era misturar resina de glutationa Sepharose 4B com um extracto obtido a partir de bactérias não transformadas BL21 DE3 pLysS. Uma análise de SDS-PAGE do eluato com 10 mM de glutationa reduzida mostrou que não há proteínas bacterianas não especificamente ligada à resina (Figura S6A).

Experimento

FRET fusão mostrando que em KCl a 50 mM, MAZ-GST em r = 2,5, 5 e 10 (r = [MAZ] /[G4-DNA]) (curvas 4, 5 e 6) desestabiliza quadruplex

qhras

-1 em KCl 50 mM, 50 mM Zn-acetato [1 curva (painel a)] e quadruplex

qhras

-2 em 100 mM de NaCl, 50 uM de Zn-etilo [curva 1, (painel b)]. BSA e TR (tripsinogênio) em r = 10 não têm qualquer efeito sobre

qhras

-1 e

qhras

-2 quadruplexes) (curvas 2 e 3, painéis a e b); (C) Representação esquemática do

HRAS

regulação da transcrição proposto por este estudo. Quando os elementos promotores críticos

HRAs

-1 e

HRAs

-2 são dobrados, eles se comportam como repressores de transcrição. Isto é sugerido pelo fato de que quadruplex-desestabilizar mutações pontuais no

HRAs

-1 e

HRAs

-2 resultado em um aumento significativo da transcrição, enquanto ftalocianinas de estabilização quadruplex são encontrados para reprimir a transcrição . MAZ, através da sua capacidade para reconhecer as estruturas quadruplex, devem ser recrutadas para a região crítica promotor. A interação MAZ-DNA desestabiliza o G-quadruplexes, a crítica

HRAs

-1 e

HRAs

-2 elementos assumir uma conformação duplex que favorece a ligação do SP1 e outras proteínas da maquinaria de transcrição . Estes eventos resultar na ativação de transcrição.

Nós ficamos surpresos sobre a atividade desdobramento de MAZ, como informou recentemente que MAZ estabilizou a murina

KRAS

quádruplo [24]. No entanto, deve-se ter em mente que MAZ tendo seis dedos de zinco podem interagir com o ADN de uma forma complexa, como observado com qTBP42 e CBF-A [40], [41]. Estas proteínas perturbar o quádruplo dimérica formada pela FMR1 d (CGG)

n repeat mas também estabilizar o telomérica quádruplo d (TTAGGG)

n. CBF-4 e qTBP42 tem quatro domínios RNP mas apenas dois estão envolvidos no G4-DNA vinculativo. Demonstrou-se que diferentes combinações de RNP são responsáveis ​​por, quer a estabilizar ou a actividade de desestabilização.

-ADN G4 ODNs de engodo imitando

HRAS

quadruplexes inibir a transcrição e crescimento celular

considerando-se que

HRAS

transcrição é ativado por uma ação combinada de MAZ e SP1 e que

qhras

-1 e

qhras

-2 ligam a MAZ (

qhras

-1 também se liga ao SP1), nós projetamos uma estratégia de engodo contra o

HRAS

oncogene. Nós fundamentado que estes oligonucleotídeos imitando quadruplexes

qhras

-1 ou

qhras

-2 (G4-chamarizes) deve sequestrar MAZ e inibir

HRAS

transcrição, bem como o crescimento celular ( Figura 8c).