Abstract
Fundo
3′-desoxi-3 ‘- [
18F] fluorotimidina (
18F-FLT) é um marcador usado para avaliar a proliferação de células
in vivo
. O objectivo do estudo era usar
18F-FLT tomografia por emissão de positrões (PET) para estudar as respostas ao tratamento a um novo composto anti-câncer. Para isso, foram estudados os efeitos anti-proliferativa iniciais da quimioterapia experimental Top216 não-invasiva por PET.
Metodologia /Principais Achados
In vivo captação
de
18F-FLT em xenoenxertos de cancro de ovário humano em ratinhos (A2780) foi estudada em vários pontos de tempo após o tratamento Top216 (50 mg /kg IV, a 0 e 48 horas) foi iniciado. varreduras basal
18F-FLT foram feitas antes de qualquer Top216 (n = 7-10) ou de veículo (n = 5-7) foi injectado e repetido após 2 e 6 horas e 1 e 5 dias de tratamento. Um estudo paralelo foi feita com 2′-desoxi-2 ‘- [
18F] fluoro-D-glucose (
18F-FDG) (n = 8). captação do traçador foi quantificada utilizando pequenos animais PET /CT. Os exames foram validados por alterações do volume do tumor e gene-expressão de Ki67 e TK1. Top216 (50 mg /kg de 0 e 48 horas) inibiu o crescimento do tumor A2780 em comparação com o grupo de controlo (P 0,001).
captação de 18F-FLT diminuiu significativamente em 2 horas (-52%, P 0,001), 6 horas (-49%, P = 0,002) e Dia 1 (-47%, P 0,001) após o tratamento Top216. No dia 5 captação
18F-FLT foi comparável à captação no grupo de controle. A absorção de
18F-FLT permaneceu inalterada no grupo controle durante o experimento. No grupo de tratamento, absorção de
18F-FDG foi significativamente diminuído em 6 horas (-21%, P = 0,003), Dia 1 (-29%, P 0,001) e no dia 5 (-19%, P = 0,05) em relação à linha de base.
Conclusões /Significado
uma injecção com Top216 iniciou uma diminuição rápida e significativa na célula proliferação avaliável por
18F-FLT após 2 horas. As reduções iniciais na proliferação de células de tumor precedido alterações no tamanho do tumor. Nossos dados indicam que
18F-FLT PET é promissor para a avaliação não invasiva precoce dos efeitos da quimioterapia, tanto em desenvolvimento de medicamentos e para adaptar a terapia em pacientes
Citation:. Munk Jensen M, Erichsen KD, Björkling F, Madsen J, Jensen PB, Højgaard L, et ai. (2010) Detecção Precoce da Resposta ao Experimental quimioterápico Top216 com [
18F] FLT e [
18F] FDG PET no câncer de ovário humano xenoenxertos em ratinhos. PLoS ONE 5 (9): e12965. doi: 10.1371 /journal.pone.0012965
editor: Andrew Boswell, Genentech, Estados Unidos da América
Recebido: 08 de julho de 2010; Aceite: 28 de agosto de 2010; Publicação: 24 de setembro de 2010
Direitos de autor: © 2010 Munk Jensen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. AP Moller Foundation, Fundação Nacional Dinamarquês de Tecnologia avançada, Svend Andersens Foundation, Novo Nordisk Foundation, Fundação Lundbeck, Birthe e John Meyer Foundation, Danish Cancer Society, Rigshospitalet Research Foundation, Capital Region of Denmark e TopoTarget A /S. Os co-autores empregados por TopoTarget teve um papel no desenho do estudo e coleta de dados e análise. Os outros financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
interesses concorrentes:. As seguintes co-autores têm conflito de interesses: Peter Buhl Jensen: Interesses propriedade e Emprego em TopoTarget a /S. Maxwell Sehested: Proprietário de Interesses e Emprego em TopoTarget A /S. Fredrik Björkling: Emprego na TopoTarget A /S. Kamille Dumong Erichsen: Emprego na TopoTarget A /S. Todos os outros autores não têm qualquer conflito de interesses. Que alguns dos co-autores são empregados por TopoTarget A /S não altera a adesão dos autores para os PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
Para a avaliação do efeito em estudos animais pré-clínicos durante o desenvolvimento de novos agentes anti-cancro, a redução no volume do tumor é o critério mais comumente utilizado para a eficácia. No entanto, o tempo até que o encolhimento do tumor pode ser longo e que exige medidas repetidas volume tumoral várias vezes por semana para mostrar efeito. imagiologia molecular não-invasiva, tais como a tomografia por emissão de positrões (PET) permite a processos biológicos para ser visualizada e quantificada de forma não invasiva ao longo do tempo. Um método não invasivo para detectar a resposta biológica cedo após o tratamento anti-cancro seria valioso no desenvolvimento de medicamentos anti-cancro para distinguir eficaz de drogas não eficazes antes das alterações no volume do tumor se tornar evidente.
O aumento da proliferação de células é um dos principais características de câncer [1]. Muita investigação centra-se sobre a visualização não invasiva de proliferação celular, o que pode ser utilizado para definir uma resposta biológica para o tratamento precoce durante o curso da terapia. 3′-desoxi-3 ‘- [
18F] fluorotimidina (
18F-FLT) é utilizado como um marcador de PET para a visualização da proliferação celular [2].
18F-FLT é um análogo da timidina e, consequentemente, um substrato da via de síntese do ADN [3]. Quando retomado em células
18F-FLT é fosforilado pela timidina-quinase-1 (TK1), que conduz ao aprisionamento intracelular. TK1 actividade está fortemente regulados do ciclo celular, e é expressa, principalmente, durante a fase S do ciclo celular; Por conseguinte, assume-se a reflectir a quantidade de células em proliferação [4], [5]. captação
18F-FLT está positivamente correlacionada com o crescimento celular e atividade TK1 [5] – [7]. Diversos estudos mostraram uma correlação entre
proliferação absorção e tumor de células 18F-FLT tanto em xenoenxertos de cancro em ratos [8] – [11] e amostras de tumores humanos [12] – [14].
Vários estudos pré-clínicos avaliaram proliferação medida por
18F-FLT PET em resposta a diferentes terapias de quimioterapia e radiação em diferentes modelos animais de cancro [8] – [11], [15] – [19]. Os resultados destes estudos variam; a primeira mudança na
absorção 18F-FLT se encontra no intervalo de 24 horas a uma semana após o início do tratamento. No entanto, nem todos os estudos encontraram uma correlação entre a resposta do tumor e uma mudança na
captação de 18F-FLT após o início do tratamento [20], [21]. Aparentemente, o período de tempo para avaliar as alterações na proliferação é muito variável de acordo com diferentes regimes de tratamento.
detecção não invasiva precoce da atividade anti-proliferativa com
18F-FLT PET também pode ser útil em uma clínica configuração para determinar se os pacientes respondem ao tratamento convencional e durante a fase I, II e III estudos ao avaliar respostas a novas drogas anti-câncer. Hoje, os métodos mais utilizados para avaliar as respostas de tumor clinicamente está com técnicas de imagem anatômicos, como a tomografia computadorizada (TC) e ressonância magnética (MRI), utilizando os Critérios de Avaliação de resposta em tumores sólidos (RECIST). No entanto, isso muitas vezes requer várias semanas ou meses antes de uma resposta possível torna-se evidente [22], [23]. Recentemente, as orientações para analisar as respostas tumorais usando PET e 2′-desoxi-2 ‘- [
18F] fluoro-D-glucose (
18F-FDG) têm sido sugeridos indicando a necessidade de métodos adicionais para a medição das respostas tumorais [24]. Novos agentes anti-cancro são frequentemente tumorstatic em vez de tumoricida e mudanças no tamanho do tumor pode ser mínima, apesar do tratamento eficaz gerando, assim, uma necessidade de novos métodos para avaliar a resposta clínica além de encolhimento do volume do tumor.
18F-FDG é actualmente o radiofármaco mais amplamente utilizado para imagiologia in Oncology e é muito útil para a detecção e caracterização de cancros. Vários estudos analisaram as mudanças em
captação de 18F-FDG após o tratamento anti-câncer, mas com resultados variáveis [25].
18F-FDG sofre com a limitação de que ele pode não detectar efeitos numa fase muito precoce e uma resposta inflamatória após o tratamento do câncer pode, até certo ponto obscuro na detecção de efeito anti-câncer [26], [27].
Top216 é um derivado mais potente e metabolicamente estáveis do Top001, que foi descoberto por BioImage ter efeito de eliminação potente e selectivo em linhas celulares de cancro da mama [28]. Top001 inibe a via mTOR de uma maneira selectiva de células-após incubação prolongada (~24 horas). A correlação entre a inibição do mTOR e linha de células de sensibilidade é bom, mas não perfeito.
Top216 inibe a proteína, RNA e síntese de DNA em linhas de células sensíveis após 1-2 horas de incubação e induz a apoptose. A indução de apoptose tal como medido por actividade da caspase 3/7 é detectável após 6 horas em linhas de células mais sensíveis. Top001 e Top216 não inibem significativamente quinases (painel Upstate quinase) ou receptores (painel Cerep) em concentrações relevantes e, actualmente, o alvo exato ou modo de acção continua a ser identificado. Top216 mostra potente
in vivo
eficácia em modelos de rato de xenotransplante de mama humano, próstata, ovário e cancro do pâncreas, tanto intravenosa quando administrado e po. Top216 está atualmente passando por regulamentar de segurança e exame de toxicologia com o objectivo de mover o composto para a clínica.
O objectivo do estudo era usar
18F-FLT PET para estudar as respostas ao tratamento a um novo composto anti-câncer não-invasiva. Para isso, fotografada proliferação de células
in vivo
com
18F-FLT PET em um modelo de tumor do rato câncer humano após o início do tratamento com Top216. A absorção de
18F-FLT foi comparada com a absorção de
18F-FDG e Ki67 e expressão gênica TK1.
Materiais e Métodos
modelo de tumor
Animal cuidados e todos os procedimentos experimentais foram realizados sob a aprovação do animal Welfare Council Dinamarquês (2006 /561-1124). Fêmea NMRI (Naval Medical Research Institute) ratinhos nude (8-11 semanas de idade) foram adquiridos a partir de Taconic Europa (Lille Skensved, Dinamarca) e deixou-se aclimatar durante uma semana na instalação para animais antes de qualquer intervenção foi iniciado. Foi utilizada a linha de ovário humano de células de carcinoma A2780 (um presente de R. Ozols, Fox Chase Cancer Center Philadelphia, PA, Janeiro de 2004). 10
7 células em 100 ul do meio misturado com 100 mL Matrixgel ™ Basement Membrane Matrix (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) foram injectados subcutaneamente no flanco esquerdo e direito, respectivamente, durante a anestesia com /mistura 01:01 v v de Hypnorm® (Janssen Pharmaceutica, Beerse, Bélgica) e Dormicum® (Roche, Basileia, Suíça). A linha celular foi testado livre de micoplasma; no entanto, não tem sido autenticado. As células foram cultivadas em meio RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640+ forma GlutaMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (Biological Industries, Israel) e 1% de penicilina-estreptomicina (Invitrogen) em 5% de CO
2 a 37 ° C.
O delineamento experimental
Seis grupos de ratos foram seguidos (n = 5-10 tumores por grupo). O tratamento foi iniciado no dia 12-24 após a implantação de células tumorais, quando os volumes dos tumores foram, em média, 225 mm
3. Os ratinhos receberam tratamento Top216 50 mg /kg i.v. ou veículo (2% de DMSO, 20% de HP-b-CD em solução salina), a 0 e 48 horas (Figura 1). Esta dose de Top216 foi em análises anteriores mostraram inibir o crescimento do tumor de xenoenxerto A2780 (dados não mostrados). Antes do tratamento foi iniciado, os ratos foram escaneados com
18F-FLT ou
18F-FDG, a fim de determinar o nível basal de captação do traçador.
18F-FLT ou scans
18F-FDG foram repetidas em 6, 30 (Dia 1) e 126 (Dia 5) horas após a injecção de Top216 ou veículo (figura 2) Além disso, um grupo de ratos foi digitalizada com
18F-FLT no início e 2 horas após o início do tratamento (Top216 ou veículo). O volume do tumor foi seguida por tomografia computadorizada durante os experimentos [29]. Os volumes tumorais foram calculados em relação ao volume no início do estudo.
A expressão de Ki67 e TK1 foi analisada
in vitro
em um grupo paralelo de ratos, que foram tratados com Top216 ou veículo e biópsia antes e no 6, 30 (Dia 1) e 126 (Dia 5) horas após o início do tratamento. As biópsias foram removidos com uma agulha de 18G e colocado imediatamente no RNA Later® (Ambion (Europe) Limited, Cambridge, Reino Unido). Todas as amostras foram armazenadas a 4 ° C e, no dia seguinte RNAlater® foi removida e as amostras transferidas para -80 ° C até posterior processamento qPCR.
Síntese de
18F-FLT e
18F-FDG
[18F] FLT foi sintetizado usando 3-N-Boc-1- [5-O- (4,4′-dimetoxitritil) -3-O-nosilo-2-desoxi-BD lyxofuranosyl] timina como precursor e sintetizados num GE TracerLab MX Synthesizer. Todos os reagentes e cassetes FLT foram adquiridos a partir de ABX (Radeberg, Alemanha). A pureza radioquímica foi determinada após a medição do teor de flúor-18 e outras impurezas radioactivas na solução medido com FLT TLC e HPLC, respectivamente. O teor de etanol e acetonitrilo foi determinada por análise de GC. O pH foi medido com um medidor de pH. Em preparações separadas, a estabilidade das preparações foi examinada após 8 horas. A HPLC foi realizada num sistema de HPLC Gilson (Biolab A /S, Dinamarca) equipada com um detector-UV Dionex (Dionex Denmark A /S, Dinamarca) e um detector de radioactividade em-linha. A coluna de HPLC era uma Luna C18 5 μ (2) 100A, 150 x 4,6 mm (Phenomenex, Dinamarca). O eluente era água /acetonitrilo 90/10 e uma taxa de fluxo de 1 ml /min. detecção de UV a 267 nm. placas de TLC foram obtidos a partir de Merck e água /acetonitrilo 5/95 foi usado como eluente. Os solventes residuais foram determinados num Shimatzu GC 2014 (Holm Halby, A /S, Dinamarca) equipada com um Chromosorb 101, 100-120 mesh, coluna 1/8 “x 10”, detector FID e de gás de arraste de hélio. A temperatura da coluna foi de 210 ° C. A pureza radioquímica de
18F-FLT era 98% com uma radioactividade específica variando 150-270 GBq /umol em EOS. O teor de etanol estava na gama de 7-8% e a quantidade de acetonitrilo foi abaixo do limite de detecção. O pH era de 7,5-7,8. A pureza radioquímica, teor de etanol e pH não se alterou após 8 horas de armazenamento à temperatura ambiente.
18F-FDG foi adquirida a partir produções diárias para uso clínico (Rigshospitalet, Copenhagen, Dinamarca).
microPET e microCT
Os ratos foram injectados iv com 10,0 ± 1,5 (média ± SD) MBq
18F-FDG ou 6,9 ± 2,4 (média ± SD) MBq
18F-FLT. Os ratos foram alimentados durante a noite antes de cada
18F-FDG digitalizar [30]. Uma hora depois os ratos injecção traçadores foram anestesiados com 3% de sevoflurano (Abbott Scandinavia AB, Solna, Suécia) misturado com 35% de O
2 em N
2 e fixo sobre um leito em presença de três marcadores fiduciais permitindo a fusão de PET e CT imagens. A PET scan 20 min foi adquirido usando um MicroPET Foco 120 (Siemens Medical Solutions, Malvern, PA, EUA). Após a aquisição de dados, os dados PET foram organizados em sinograms e subsequentemente reconstruída com o algoritmo de reconstrução máxima a posteriori (MAP). O tamanho do pixel foi 0,866 × 0,866 × 0,796 mm e no campo Centro de vista a resolução foi de 1,4 mm de largura total-at-meia-máxima.
Após a varredura microPET, uma varredura microCT foi adquirida com uma sistema MicroCAT® II (Siemens Medical Solutions). A 7 minutos e 10 segundos tomografia computadorizada foi realizada com definições de parâmetros: passos 360 rotação, tensão de tubo de 60 kV, tubo atuais 500 mA, Binning 4 e tempo de exposição de 310 ms. O tamanho do pixel foi de 0,091 × 0,091 × 0,091 mm.
Imagens
PET e microCT foram fundidos no software Inveon (Siemens Medical Solutions). Antes região fusão de interesses (ROIs) foram elaboradas nas imagens CT manualmente através de uma avaliação qualitativa que abrange os tumores integrais e posteriormente absorção de volume tumoral e tracer, avaliados por valores padrão de captação (SUV) média e máxima, foram gerados pelo somatório dos voxels dentro do aviões tomográfica.
quantitativo em tempo real da reacção em cadeia da polimerase (qPCR)
o ARN total foi isolado a partir das biópsias com TRI reagent® seguindo as instruções do fabricante (Molecular Research Center Inc., OH, USA ) e, subsequentemente, a integridade de ARN foi medida num Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA). qualidade de ARN é indicado como o número de integridade do RNA (NIR) [31]. A concentração de ARN foi determinada por NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, EUA). O ARN total (0,3 mg) foi revertida transcrito utilizando o kit Affinityscript ™ QPCR de síntese de ADNc (Stratagene, La Jolla, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. As amostras foram arrefecidas e armazenadas a -20 ° C até à sua utilização.
A expressão de genes foi quantificada no tempo real do sistema de PCR de Stratagene Mx3000P®. Ki67 e TK1 foram quantificados em cada um duplex com proteína de ligação à caixa TATÁ (TBP). Foi utilizado o Kit Brilliant® QPCR núcleo Reagente (Stratagene). Optimização dos ensaios resultou em aumento de 50% em dNTPs e Taq polimerase. Uma concentração de MgCl 5,5 mM foi usada para todas as experiências. O perfil térmico seguinte foi utilizado em todas as experiências:. 10 minutos de desnaturação a 95 ° C, seguido de 45 ciclos com desnaturação durante 30 segundos a 95 ° C e emparelhamento /alongamento a 60 ° C durante 1 minuto
Relativa foi utilizada a quantificação pelo método comparativo (2
-ΔΔCt) [32]. Os resultados foram corrigidos para a eficácia da reacção de PCR calculada por curvas de diluição de 5 vezes substituindo assim 2 na fórmula com (E + 1) [33]. correções de eficiência foram feitas para cada gene em cada ensaio. Tecido a partir de amostras de linha de base serviu como calibrador. TBP foi utilizado como gene de referência. Este gene foi previamente testado para ser estável no tumor contra o tecido normal e, posteriormente encontrado para ser estável nesta configuração experimental.
Primers e sondas TaqMan duplamente marcadas foram projetados usando Beacon Designer (PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA EUA). Os iniciadores e sondas estão apresentados na (Tabela 1). Para cada gene do iniciador e sonda concentração óptima foi encontrada. Todas as amostras foram realizadas em triplicado utilizando um uL de ADNc. Para cada amostra de um controle de transcrição não-reverse (Nort) foi incluído, e em cada prato um controle sem modelo (NTC) foi incluído.
A análise estatística
Comparação de tumor volume entre Top216 grupos tratados e controle foram calculados utilizando um teste t de Student não pareado. Teste t pareado foi utilizado para comparações intra-grupo. correção de Bonferroni da P-valores para comparações múltiplas foi aplicado. Todos os dados foram testados para ser normal distribuídas por meio de teste de Kolmogorov-Smirnov. Os cálculos foram feitos em SPSS 16.0. Os dados são apresentados como média ± SEM e P . 0,05 foi considerado estatisticamente significativo
Resultados
Efeito do Top216 no tamanho do tumor
Top216 (50 mg /kg a 0 e 48 horas) inibiu o crescimento de xenoenxertos de cancro de ovário humano A2780 em ratinhos
in vivo
em comparação com o grupo de controlo (P 0,001) (Figura 3). Os tamanhos dos tumores não tratados aumentou em aproximadamente um factor de 3, durante o estudo e os volumes dos tumores tratados foram inalterados.
A) Os efeitos de Top216 sobre o crescimento de xenoenxertos de tumor A2780. O volume do tumor foi determinado por microCT. Os ratinhos foram tratados com Top216 (50 mg /kg) ou veículo a 0 e 48 horas. *) P 0,05, **) P 0,01 vs. linha de base e
# # #) P 0,001 vs. controlo. n = 15 tumores por grupo. B) As alterações no volume do tumor avaliada por dia proporção de 5 /linha de base no grupo de controle em função da absorção de FLT linha de base. n = 7 tumores. R
2 = 0,61, P = 0,04.
18F-FLT e
18F-FDG
captação tumoral da linha de base de
18F FLT no modelo de tumor A2780 foi relativamente elevada (1,05 ± 0,03 SUVmean), tornando-se fácil diferenciar tumor a partir de tecidos não tumorais que, para
18F-FDG foi observada apenas uma absorção tumoral modesta (SUVmean 0,48 ± 0,02). No grupo controle, linha de base captação
18F-FLT previsto aumento do volume tumoral ao longo de 5 dias (regressão linear de SUVmean linha de base vs. volume do tumor rácio Dia 5 /linha de base: r
2 = 0,61, P = 0,04) (figura 3). Nenhuma correlação entre a linha de base foi observada
18F-FDG e volume do tumor aumento.
A absorção de
18F-FLT avaliada por SUVmean diminuiu significativamente de 1,09 ± 0,03 no início do estudo para 0,53 ± 0,02 (-52 %; P 0,001) em 2 horas, e 0,56 ± 0,06 (-49%; P 0,001) em 6 horas e para 0,58 ± 0,03 (-47%; P 0,001) no dia 1 após Top216 o início do tratamento (Figura 4 +5).
a) As oito imagens na esquerda são representativos imagens PET /CT da coroa fundidas de dois ratos digitalizados com
18F-FLT no início e em 6 horas e 1 e 5 dias após o início do tratamento . As imagens no topo show de um rato tratado com Top216 e as imagens na parte inferior mostram um ratinho de controlo que recebeu veículo. As quatro imagens na mostra direita fundido PET /CT imagens de dois ratos representativos tratados com Top216 ou veículo e digitalizados no início do estudo e 2 horas após o início do tratamento. As setas apontam para os tumores. B) fundidos representativos imagens coronais PET /CT de dois ratos digitalizados com
18F-FDG no início do estudo e 6 horas e 1 e 5 dias após o início do tratamento. As imagens no topo show de um rato tratado com Top216 e as imagens na parte inferior mostram um ratinho de controlo que recebeu veículo. As setas apontam para os tumores.
tratamento /veículo Top216 foi iniciada a 0 horas e repetida em 48 horas após a primeira injecção. N = 5-10 tumores por grupo. *) P 0,05, **) P 0,01, ***) P 0,001 comparado à linha de base. Os dois gráficos em dados mostram à esquerda do
18F-FLT as experiências e os dois gráficos em dados mostram desde o
18F-FDG experimentos.
Depois de 5 dias
18F captação -FLT (1,33 ± 0,08) foi comparável à captação de linha de base. SUVmean permaneceu inalterada no grupo controle durante o experimento. valores SUVmax diminuiu significativamente de 2,01 ± 0,09 na linha de base para 0,89 ± 0,05 a 2 horas (-55%, p 0,001), e 0,94 ± 0,08 em 6 horas (-53%; P = 0,002) e 0,84 ± 0,03 no dia 1 (-58%; P 0,001). valores SUVmax aumentou para 2,26 ± 0,12 no dia 5 após o início do tratamento (13%, P = 0,04). SUVmax permaneceu inalterada no grupo controle, no entanto aumentou ligeiramente no dia 5 após o início do tratamento em relação ao basal (13%, P = 0,03).
A absorção de
18F-FDG avaliada por SUVmean diminuição significativa de 0,49 ± 0,03 no início do estudo para 0,39 ± 0,02 (-21%, P = 0,003) às 6 horas, a 0,35 ± 0,01 (-29%, P 0,001), no Dia 1 e 0,40 ± 0,02 (-19%, P = 0,05 ) no dia 5 (figura 4 + 5). A absorção de
18F-FDG no grupo controle foi significativamente aumentada no dia 5 em comparação com a captação de linha de base (27%, P = 0,05). valores SUVmax diminuiu significativamente de 0,92 ± 0,06 na linha de base para 0,64 ± 0,04 em 6 horas após a injecção (-31%, p 0,001), 0,53 ± 0,02, no Dia 1 (-42%; P 0,001) e 0,66 ± 0,03 no dia 5 (-29%, P = 0,01). SUVmax permaneceu inalterada no grupo controle durante o experimento.
A expressão de Ki67 e TK1
A expressão do gene TBP referência foi constante durante todo o experimento. Diferenças no CT-valores entre amostras normais e amostras Nort foram 13 (mediana). números integridade do RNA (RIN-valores) foram de 9,1 ± 0,1 (média ± SD) para todas as amostras.
Gene níveis de Ki67 e TK1 expressão são mostrados na figura 6. Na expressão de Ki67 grupo de tratamento foi significativamente mais baixa às 6 horas após a injecção (-31%, P = 0,01) e dia 1 (-71%, P 0,001) após o início do tratamento em relação à linha de base. Expressão de Ki67 foi de 21% de aumento no Dia 5 (P = 0,04) em relação à linha de base. Expressão de Ki67 no grupo controle foi significativamente menor em 6 horas (-17%, P = 0,01). Comparação com o valor basal
Os dados são apresentados como alterações vezes após o tratamento com Top216 /veículo em relação aos níveis basais (n = 7 tumores por grupo). Top216 tratamento foi iniciado às 0 horas e repetida em 48 horas após a primeira injecção. *) P 0,05, **) P 0,01, ***) P 0,001 em relação ao basal
Na expressão grupo de tratamento de TK1 foi significativamente diminuído no Dia 1 (-56%. , P 0,001) em relação à linha de base. No Dia 5 a expressão de TK1 foi aumentada (30%, P = 0,013), em comparação com o valor basal. No grupo controle expressão de TK1 manteve-se inalterada durante o experimento.
Discussão
Uma injecção com Top216 iniciou uma diminuição rápida e significativa na proliferação celular de 52% avaliável por
18F-FLT PET tão cedo quanto 2 horas após a injecção. Esta diminuição durou pelo menos um dia, mas no dia 5 (3 dias após o
nd tratamento 2) absorção de
18F-FLT foi comparável à captação no grupo controle, sugerindo que as células do tumor tinha recuperado a sua proliferação capacidade. A absorção de
18F-FLT no grupo controle não sofreu alteração durante o experimento validando assim o efeito anti-proliferativa dos Top216. Em contraste com a diminuição acentuada no
captação de 18F-FLT seguir o início do tratamento, uma pequena, mas significativa, diminuição da
captação de 18F-FDG foi observado em 6 horas e no dia 1 após o início do tratamento Top216, e este diminuição durou até o dia 5. mudanças na
captação de 18F-FLT (max queda: 52%; 2 h) foram mais pronunciadas do que as mudanças em
captação de 18F-FDG (max queda: 29%; Dia 1). No entanto, no final da experiência,
captação de 18F-FDG manteve-se menor do que na linha de base no grupo Top216, ao passo que foi aumentada no grupo de controlo.
A diminuição na
18F-FLT absorção de pós-injecção precoce não foi acompanhada por uma diminuição no volume do tumor, como volume dos tumores não se alterou durante o curso da terapia. Isto ilustra que a utilização de imagiologia não invasivo para avaliar a resposta do tumor é importante, pois Avaliar a redução do volume do tumor como um ponto final teria gerado um resultado negativo falso. Efeito anti-volume de Top216 foi, no entanto, ainda visto em comparação com o grupo controle. Mudanças na disponibilidade marcador por exemplo como consequência de alterações de perfusão do tumor após o tratamento, poderia ser responsável por alguns dos efeitos na redução da captação
18F-FLT. No entanto, o fato de que
captação de 18F-FDG não diminuiu da mesma forma que
18F-FLT leva à suposição de que a diminuição da
captação de 18F-FLT não é apenas devido a uma alteração na perfusão do tumor, mas também a uma alteração fisiológica em proliferação de células tumorais. Este foi ainda validado por uma diminuição semelhante na expressão do gene de Ki67.
As medições de captação do traçador no dia 5 pode ser interpretado tanto como uma medida da proliferação de células, 5 dias após o início do tratamento e, como estado proliferação de 3 dias após o segunda injecção de Top216. Por conseguinte, uma injecção de Top216 inibiu a proliferação em algum ponto entre 1 e 3 dias, depois as células de tumor recuperadas a sua capacidade de proliferação. Esta informação pode ser útil ao planejar esquemas de tratamento durante as investigações pré-clínicas e em futuros protocolos clínicos, a fim de encontrar o esquema de tratamento ideal.
No dia 5 após o início do tratamento
18F-FDG foi de 19% menor em relação à linha de base, ao passo que a absorção de
18F-FLT foi comparável à linha de base. A absorção de
18F-FDG foi, consequentemente, afectada por um tempo maior do que
captação de 18F-FLT. Isto indica que, mesmo que a proliferação de células após 5 dias (3 dias após a 2
ND tratamento) foi comparável à linha de base, os efeitos biológicos do tratamento ainda existia e foram visualizadas por
18F-FDG. A absorção de
18F-FDG foi significativamente menor em 6 horas após o início do tratamento em comparação com a captação de linha de base. No entanto, a redução de 21% a partir de uma absorção já baixa não é facilmente visualizado nas imagens PET /CT (Figura 4).
Nossas descobertas que
18F-FLT foi superior ao
18F-FDG para avaliar as respostas precoces após o tratamento anti-câncer estão de acordo com outros estudos [8], [11], [21]. níveis basais de
captação de 18F-FDG no modelo de tumor foram baixas e apenas cerca de metade dos níveis basais de
captação de 18F-FLT que está de acordo com os achados de outros [11], [17]. No entanto, outros estudos têm encontrado uma
18F-FDG superior em vários modelos de xenotransplante em comparação com
18F-FLT captação [16], [19], [21]. Foi previamente demonstrado que é mais difícil de medir a resposta ao tratamento em tumores com captação do traçador baixo da linha de base, o qual está em concordância com os resultados obtidos neste estudo [11], [21], [34].
Os resultados de outros estudos utilizando
18F-FLT PET para avaliar as respostas iniciais ao tratamento anti-câncer têm sido muito variável, onde se observou resposta a um inibidor da histona deacetilase após 4 dias [10], a resposta à cisplatina é visto depois 1 dia [9], resposta a ciclofosfamida e a inibição de mTOR é evidente após 2 dias [16] e o inibidor de ErbB quinase iniciada uma diminuição na
absorção 18F-FLT 2 dias após o início do tratamento enquanto que nenhuma resposta foi observada em 6 e 24 horas [11]. No entanto comparação dos estudos é difícil devido ao tratamento e digitalização diferentes horários e modelos de tumor variáveis. Em comparação com outros estudos que encontraram uma diminuição acentuada no
captação de 18F-FLT avaliada por PET e esta diminuição foi observada muito mais cedo (2 e 6 horas). Ele continua a ser estabelecida se esta resposta precoce é composto específico ou simplesmente devido ao nosso protocolo ser o primeiro a avaliar a resposta tão cedo após o tratamento.
Quer ou não a mudança no início
18F-FLT e
18F-FDG pode ser um preditor de desfecho clínico é são necessários ainda estudos desconhecidos e aprofundar a investigação de alterações precoces e sobrevida global, a fim de responder a essa pergunta.
Comparação de
captação de 18F-FLT e Ki67 expressão gênica mostrou uma mudança semelhante após o tratamento com Top216. No entanto, os níveis de ARNm de Ki67 não diminuiu tanto quanto
18F-FLT absorção de 6 horas após o início do tratamento. Uma possível explicação pode ser que as alterações na actividade enzimática ocorrem antes das alterações nos níveis de ARNm. A correlação entre a expressão do gene Ki67 e
18F-FLT captação em nosso estudo está de acordo com outros estudos encontrando forte correlação entre o Ki67 no nível de proteínas e absorção
18F-FLT [8] – [11]. Nós encontramos uma diminuição significativa na
captação de 18F-FLT tão cedo quanto 2 e 6 horas após o início do tratamento; No entanto, apesar de um
absorção significativamente inferior 18F-FLT em 6 horas, uma diminuição na expressão do gene TK1 foi primeiro evidentes no dia 1 após o início do tratamento. actividade da enzima TK1 está positivamente correlacionada com
absorção 18F-FLT [6], [7] e demonstrou-se que os mecanismos transcricionais podem participar na regulação da actividade de TK1 onde ambas as proteínas TK1 e os níveis de ARNm foram relacionadas com uma diminuição na
absorção 18F-FLT após o tratamento com um inibidor da histona desacetilase [10]. precocemente alterações em
captação de 18F-FLT sem alterações nos níveis de mRNA TK1 são provavelmente devido a mudanças nos níveis de proteínas, modificações pós-traducionais de proteínas ou mudanças nos níveis de ATP [7], [10], [35].