Abstract

Aumento do estresse oxidativo em condições de hiperglicémia, através da interacção de AGEs com receptores de raiva e através da ativação da sinalização da transcrição de interleucina mediada, tem sido relatada em câncer. Proteínas modificações estão sendo exploradas por seus papéis no desenvolvimento e progressão do câncer e de auto-anticorpos resposta contra eles está ganhando interesse como uma sonda para a detecção precoce da doença. Este estudo analisou as mudanças na histona H1 mediante modificação por metilglioxal (MG) e suas implicações na auto-imunopatogênese de câncer. histonas modificadas mostraram modificações nos resíduos aromáticos, mudou microambiente tirosina, reticulação intermolecular e geração de AGEs. Ele mostrou mascaramento de manchas hidrofóbicas e uma mudança hipsocrômico na na ANS fluorescência específica. MG oxidado agressivamente histona H1 levando à acumulação de carbonilas reativas. Far medições de CD no UV mostrou di-carbonil induzida realce da estrutura alfa e a folha beta de indução de conformação; e desnaturação térmica (Tm) estudos confirmaram a estabilidade térmica da histona modificado. A análise FTIR revelou amida I de desvio de bandas, a geração de um grupo carboxietilo e vibrações N-Ca na histona modificado. análise LCMS confirmou a formação de Nε- (carboxietil) lisina e estudos de microscopia eletrônica revelou a formação de agregados amorfo. A histona modificado mostrou alterada de ligação cooperativa com o ADN. H1 modificada induz anticorpos de alta titulação em coelhos e do IgG isolado forma soros de coelhos imunizados com a ligação H1 exibiu modificado específico com o seu imunógeno em análise de Western Blot. IgG isolada do soro de pacientes com câncer de pulmão, câncer de próstata, câncer de mama e da região de cabeça e pescoço mostrou um melhor reconhecimento de neo-epitopos no histonas modificadas, refletindo a presença de auto-anticorpos circulantes no câncer. Desde relatórios sugerem uma ligação entre o eixo AGE-RAGE e carcinogênese, glicoxidação de histona H1 e sua imunogenicidade abre caminhos para compreender o papel das proteínas nucleares glycoxidatively danificadas no cancro

Citation:. Mir AR, Uddin M, Khan F, Alam K, Ali a (2015) Dicarbonil induzida Perturbations estruturais Faça histona H1 altamente imunogênica e gerar uma resposta auto-imune em Câncer. PLoS ONE 10 (8): e0136197. doi: 10.1371 /journal.pone.0136197

editor: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Center Ciência, CHINA

Recebido: 18 de abril de 2015; Aceito: 31 de julho de 2015; Publicação: 28 de agosto de 2015

Direitos de autor: © 2015 Mir et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

financiamento:.. os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro é uma das doenças mais mortais responsáveis ​​por um grande número de mortes em todo o mundo e sua detecção precoce ocupa o centro do palco na redução do seu impacto global do público [1-2]. A este respeito, a identificação e avaliação de auto-anticorpos para as proteínas modificadas em doentes com cancro sustenta destaque no desenvolvimento biomarcador para a detecção precoce da doença. são assumidas várias modificações pós-traducionais de proteínas (PTMS) que ocorrem durante o desenvolvimento de cânceres de ser significativo para a sua relevância de diagnóstico [3-4].

Detalhes de PTMs, como a formação de produtos de glicação avançada (AGEs ) com papel no desenvolvimento e progressão de cancros também estão emergindo [5]. Tem sido relatado que um cancerscreate favorável ao ambiente para a produção de produtos FGA por causa da sua maior captação de glicose para satisfazer as suas necessidades de energia [6-8]. Os produtos de glicação formados têm o potencial para se ligarem os macrófagos através do receptor de macrófagos limpador e, às grassa e, assim, contribuir para o desenvolvimento do cancro através das suas capacidades de pró-inflamatórias e explorando o requisito para a activação de interleucina 6 (IL-6) mediada mitocondriais transdutores de sinal e activadores de transcrição 3 (STAT3) [9-11]. Evidências epidemiológicas sobre a heterogeneidade molecular dos cancros revelam efeitos genotóxicos do estresse carbonilo aguda, tornando pacientes com diabetes propenso a várias formas de câncer [12]. AGEs genotoxicidade induzida em células tubulares com possíveis implicações no desenvolvimento do câncer reforçada em doenças renais avançadas, também aponta para a mesma correlação [13].

A detecção de auto-anticorpos gerados contra proteínas aberrante processados ​​no cancro que são imunogênica e estimulam celular e resposta imune humoral conduziram a uma série de pesquisas que visam a detecção de auto-antigénios do cancro no teste padrão de artrite reumatóide, em que os anticorpos anti-IgG têm sido relatados como biomarcador de diagnóstico [14]. Entre as proteínas, modificações pós-traducionais de histonas, em particular, têm um papel importante na expressão do gene e, por conseguinte, no desenvolvimento e progressão do cancro, e as suas modificações também estão a ser explorados como potenciais marcadores da progressão da doença e o prognóstico [15-16].

Além disso, entre os agentes glycating metilglioxal (MG), um composto dicarbonilo gerado por várias vias metabólicas tem sido identificada como um grande precursor na modificação de várias proteínas, com 50.000 vezes morereactivity do que a de glicose, com tanto intracelular e proteínas extracelulares, em concentração fisiológica [17], bem como em concentrações mais elevadas [18] e foi associada com um papel numa multiplicidade de doenças [9, 19]. Metilglioxal mediada perturbações podem induzir mudanças estruturais e funcionais no histona H1 proteína nuclear com possíveis implicações na imuno-biologia de vários tipos de cânceres.

Neste estudo, histona H1 foi incubado com concentrações crescentes de metilglioxal para gerar as idades. mudanças estruturais induzidas MG na histona H1 foram analisadas por UV, fluorescência e CD espectroscopia, eletroforese em gel de acrilamida poli, transformada de Fourier análise de infravermelho espectroscópica (FTIR), determinação do teor de carbonilo, hidrofobicidade superficial (H

0) estimativa, a massa de cromatografia líquida espectroscopia (análise m /z), microscopia eletrônica de varredura, e pelo estudo das interacções alteradas na ligação com o DNA. A possível imunogenicidade do nativo e as histonas modificadas foi verificada em coelhos. Circulando auto-anticorpos presentes em pacientes tipos withvarious de cânceres foram avaliados quanto à sua ligação ao nativo e modificado MG histona H1 através de estudos de inibição da ligação e competitivos directos em ELISA e pelo ensaio de retardamento em gel.

Materiais e Métodos

Histona H1, 2,4-dinitrofenil-hidrazina (DNPH), ácido 1-anilino-8-sulf único (ANS), sulfato dodecilo de sódio (SDS), metilglioxal, cloridrato de aminoguanidina, ácido dietilenotriaminapenta-acético (DTPA), de sódio azida, brometo de etídio, proteína A-agarose (coluna de 2,5 ml pré-embalado), agarose, azida de sódio, a IgG de Tween-20, tubos de diálise, anti-humano e anti-coelho, conjugado de fosfatase alcalina, fosfato de para-nitrofenilo, completo de Freund e adjuvantes incompletos foram adquiridos a partir de Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, EUA. Acrilamida, bisacrilamida, persulfato de amónio (APS) e N, N, N ‘, N’-tetrametiletilenodiamina (TEMED) foi de Bio-Rad Laboratories, EUA hidróxido de sódio, ácido etilenodiaminotetra-acético (sal dissódico), metanol, ácido acético glacial, iso- propanol, cloreto de sódio, carbonato de sódio, nitrito de sódio, nitrato de prata, o xileno, o hidróxido de sódio, formaldeído, bicarbonato de sódio, etanol, sulfato de amónio e persulfato de amónio foram obtidos a partir de Qualigens, Índia. Poliestireno de microtitulação de fundo plano Placas e módulos de ELISA foram adquiridos a partir de Nunc, Dinamarca. Todos os outros produtos químicos /reagentes foram da mais alta qualidade analítica disponível.

Determinação da concentração de proteínas de histona H1

coeficiente de extinção molar de timo de bezerro histona H1 (1280 M

-1cm

-1) foi usada para determinar a concentração de proteína através da medição da absorvância das soluções de proteína a 280 nm. Timo de bezerro histona H1 peso molecular utilizado para os cálculos foi 21500 Dalton.

Modificação da histona H1 por metilglioxal

O procedimento dado por Roberts

et al

. [20] foi seguido. modificação da histona H1 foi realizado em solução salina de fosfato tampão (tampão de fosfato de sódio 10 mM, pH 7,4 contendo NaCl 150 mM). amostras de histona H1 (42 uM) foram modificadas pela incubação com concentrações variáveis ​​de metilglioxal (2,5, 5, 7,5 e 10 mM) durante 24 horas a 37 ° C. Todas as amostras foram dialisadas extensivamente após incubação.

espectroscopia de absorção

O perfil de absorção de histonas nativos e modificados metilglioxal-H1 foi gravado em Shimadzu espectrofotómetro (UV 1700 modelo) na gama de comprimento de onda de 250 -500 nm usando cuvete de quartzo de comprimento do percurso de 1 cm a temperatura constante.

estudos de fluorescência

fluorescência espectros foram registrados na Shimadzu (RF-5301-PC) spectrofluorophotometer a 25 ± 0,1 ° C em uma célula de comprimento de percurso de 1 cm a largura da fenda 3 nm.

Nós medimos fluorescência intrínseca excitando as amostras de proteína em 275 nm e gravar os espectros de emissão na faixa de 300-400 nm.

Perda de a intensidade de fluorescência (FI) foi calculado usando a seguinte equação:

electroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio-

modificações Methylglyoxal mediadas em histona H1 foram analisados ​​usando não desnaturante não redutoras de sulfato de dodecilo e sódio verticais electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) como descrito por

Laemilli

, com ligeiras modificações [21]. 25 ug de histona amostras nativas e modificadas foram misturadas com um quarto do volume de tampão de amostra (glicerol a 50%, e 0,002% de azul de bromofenol em Tris HCl a 1, pH 6,8) e aplicada nas cavidades de 10% de gel de poliacrilamida SDS. O gel foi operado a 80 V durante 4 h à temperatura ambiente e em seguida coradas com nitrato de prata e fotografado por sistema Molecular Imager Gel Doc XR.

Os estudos foram realizados em histona H1 modificado por metilglioxal 7,5 mM com nativa histona H1 servindo como controle

AGE Ensaio

fluorescência específica-AGE foi medida a 440 nm após excitação a 370 nm e o aumento na intensidade de fluorescência (FI) foi calculado pela seguinte equação.:

Determinação da hidrofobicidade da superfície (H

0)

a hidrofobicidade da superfície foi determinada com a sonda fluorescente do ácido 8-sulfónico 1-anilinonapthalene- (ANS) por espectroscopia de fluorescência de acordo com uma estabelecida Protocolo [22]. A razão molar entre a histona H1 e ANS foi feita como 01:10 e espectros de emissão foram registados entre 400-600 nm. variação percentual na intensidade de fluorescência (FI) foi calculado pela seguinte equação:

Determinação do teor de carbonilo reactivo

A avaliação crítica do conteúdo de carbonil proteína serve como biomarcadores de dano oxidativo proteína. Analisamos o conteúdo de carbonil de nativo e metilglioxal histona H1 modificada (MG-H1) de acordo com o protocolo publicado com ligeiras modificações [23]. amostras de histona H1 nativos e metilglioxal (7,5 mM) foram adicionados modificado com quantidades iguais de DNPH 10 mM em ácido clorídrico 2,5 M. As amostras foram agitadas em intervalos regulares e incubadas no escuro durante 15 minutos à temperatura ambiente. Estes foram incubados com TCA a 10% durante 15 minutos a -20 ° C e centrifugou-se a 4 ° C durante 15 minutos a 9000 g. Os sedimentos de proteína foram lavadas três vezes com etanol arrefecido em gelo /acetato de etilo (1: 1) depois de descartar o sobrenadante e centrifugou-se durante 2 min a 9000 g entre todas as lavagens. Após a última lavagem, o sedimento foi suspenso em 1 ml de guanidina-HCl 6 e misturado adequadamente. As amostras de proteína foram então completamente dissolvido, deixando a 37 ° C durante 15-30 min. Uma vez que os grânulos de proteína estavam totalmente dissolvidos, a concentração de DNPH foi determinada por medição da absorvância a 360 nm contra o cloreto de guanidínio (como branco), utilizando o coeficiente de extinção molar de 22.000 M

-1cm

-1. A absorção das amostras foi feita a 276 nm conteúdo e carbonil proteína foi expressa em nmol mg

-1 de proteína.

Dicroísmo Circular Determinação

Dicroísmo Circular avalia as mudanças em proteínas secundário estrutura, de dobragem e as suas propriedades de ligação. Realizou-se a análise espectral Far-UV CD de histona H1 nativa e sua MG modificado homólogo usando J-815 JASCO espectropolarímetro. O instrumento foi relacionada com um microcomputador com um suporte de célula termostatizada controlada ligado ao banho de água de Neslab RTE 110 com uma exactidão de temperatura de ± 0,1 ° C. Os exames foram tomadas em intervalos de comprimento de onda de 1 nm a 25 ° C. Todos os exames foram registrados em intervalos de comprimento de onda de 1 nm. Os espectros foram recolhidos em 50 min nm

-1 varredura velocidades, campo de dados de 0,1 nm e um tempo de resposta de 2s. Os espectros foram registados na região de UV distante entre comprimentos de onda de 190 a 250 nm e a concentração de proteína foi de 0,2 mg /ml. Os resultados foram obtidos em elipticidade molar residual (θ) (° C /cm

2 /dmol) a um comprimento de onda λ, com base na equação dada abaixo [24] .Where θ

obs é a elipticidade observada em graus,

C

p é a fração molar e

l

é o comprimento do caminho da luz em centímetros. O conteúdo α-helicoidal de diferentes amostras de histona H1 foram calculados a partir de valores de q a 222 nm (MRE

222) usando a seguinte equação.

A desnaturação térmica Estudos (TM) por CD de UV distante-

o termo-estabilidade da estrutura secundária de histona H1 e a sua MG forma modificada foi analisada por espectroscopia de CD Far-UV a 222 nm de 20 ° C a 90 ° C utilizando um declive de temperatura de 1 ° C /min.

Fourier Transform Infrared espectroscópica Análise-refletância total atenuada (FTIR-ATR)

transformada de Fourier no infravermelho (FTIR) espectroscopia foi realizado para analisar a estrutura secundária da histona H1 e MG modificado histona usando Perkin Elmer espectrofotómetro de IV-TF. leituras espectrais infravermelhas foram registrados entre 1000 cm

-1 a 4000 centímetros

-1. FTIR estudos foram realizados a 10 mg /ml de concentração de proteína.

A cromatografia líquida espectrometria de massa (a análise m /z)

O sistema HPLC foi ligado a um espectrómetro de massa de tempo-de-voo (LCMS-TI-TOF, Shimadzu) equipado com uma interface de electropulverização operado num modo de iões positivos com tensão fixada em 4,5 kV. A temperatura do gás de turbo de iões era de 250 ° C. A análise por MS de verificação completa foi realizada no intervalo de relação /z 0-240 m. Os resultados obtidos para MS proteínas histonas foram comparados ao do padrão CEL [25].

Foram observados

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) estudos

Os detalhes micro-arquitetura de nativo e MG modificados histonas usando eletrônica de varredura. Ar amostras secas foram adsorvidos numa membrana de ultrafiltração de celulose. As amostras foram revestidas com ouro e montada em uma fita de carbono grades de aço inoxidável revestido operam em uma voltagem de aceleração de 15 kV e com pouca condição de vácuo. As imagens foram tiradas usando uma JSM-6510LV (JEOL JAPAN) microscópio eletrônico de varredura em execução [26]

Alterações na interação com DNA:. Dicroísmo Circular (CD) Análise

Interação de nativo e MG a histona H1 modificados com DNA foi analisado por espectroscopia de CD. 50 ug /ml de DNA foi incubada durante 1 hora com 0,2 mg /ml de H1 nativa e MG modificado H1, respectivamente, em tampão Tris 0,05 M, pH 7,4. As amostras foram submetidas a centrifugação a 14.000 rpm durante 8 minutos e espectros CD foram registados para o sobrenadante. ADN nativo da mesma concentração foi tomado como controlo. Para evitar qualquer interferência de proteínas, todas as medidas foram tomadas no mais longos comprimentos de onda entre 220 cm

-1 a 330 cm

-1.

Os estudos imunológicos e Western Blotting

Aleatoriamente coelhos Nova Zelândia brancos fêmeas criados com peso de 1-1,5 kg foram seleccionados para immunizationas acordo com o protocolo estabelecido no nosso laboratório [27]. de imunoglobulina de soro G (IgG) a partir dos animais experimentais foi isolado por cromatografia de afinidade em coluna de proteína A-agarose [28] e Western blotting foi realizado de acordo com o protocolo indicado na brochura técnica para sistema ECL Além disso Western Blotting (Amersham, Reino Unido) para estabelecer a especificidade dos anticorpos gerados contra nativa e histonas modificadas H1 nos coelhos [29].

Recolha de amostras de sangue para estudos clínicos

a fim de investigar a presença de auto-anticorpos contra nativa e MG modificado histona H1, os soros foram obtidas de pacientes com câncer (n = 83) de diferentes faixas etárias que frequentam o JN Hospital Medical College, Aligarh, Índia, após o consentimento informado. As amostras foram obtidas após cuidadoso exame clínico dos pacientes com diagnóstico histopatológico comprovado. A população incluiu pacientes com câncer de pulmão (n = 27), próstata (n = 19), de mama (n = 22) e pacientes com câncer de cabeça e pescoço (n = 15) .foram 49 mulheres, com idade média de 38,5 ± 22,9 anos e 34 machos de 36 ± 18,3 anos a média de idade. A idade de todos os pacientes caíram entre 15 e 63 anos. As amostras de indivíduos saudáveis ​​(n = 40; 20 machos 20 do sexo feminino, com idade média de 36 ± 18,6 anos), serviu como controle. As amostras de soro foram aquecidas a 56 ° C durante 30 min para inactivar proteínas do complemento e armazenado a -20 ° C com 0,2% de azida de sódio. A ligação de anticorpos séricos foi avaliada por ELISA.

Ética Declaração

Este estudo foi devidamente aprovado pelo Comitê de Ética Institucional (1617 /FM /22-01-2013) Comissão de Ética e Animal (8289 /OAH /21-02-2013), devidamente registrada no âmbito do Comité para efeitos de controlo e supervisão de experiências com animais (CPCSEA) Índia (registro nº. 401 /RO /C /2001 /CPCSEA), atthe JN Medical College, Faculdade de medicina, AMU.

as amostras de sangue foram colhidas dos pacientes e indivíduos saudáveis ​​após o consentimento verbal informado. O modo de consentimento foi devidamente aprovado pelo comitê de ética. Um registro adequado de todos os pacientes e indivíduos saudáveis ​​foi mantido.

Isolamento de IgG por cromatografia de afinidade

imunoglobulina Serum G (IgG) foi isolado por cromatografia de afinidade em proteína A-agarose coluna [ ,,,0],28]. O soro (0,5 mL) diluiu-se com igual volume de PBS (pH 7,4) foi aplicado no topo da coluna pré-equilibrada com o mesmo tampão. O meio de lavagem foi reciclados 2-3 vezes e material não ligado foi removido por lavagem exaustiva com PBS. A IgG ligada foi eluída com ácido acético a 0,58% em cloreto de sódio a 0,85% e recolhido num tubo contendo 1,0 ml de Tris-HCl 1,0 (pH 8,5). Fracções de 3 ml foram recolhidas e lidas a 280 nm. A concentração de IgG foi determinado considerando 1,4 OD280 = 1,0 mg IgG /ml. A IgG isolado foi dialisado contra PBS e armazenadas a -20 ° C com 0,1% de azida de sódio.

A ligação directa de ELISA

ELISA foi realizada em placas de poliestireno de fundo plano, tal como descrito anteriormente [27] . Poliestireno PolySorp poços de microtitulação foram revestidos respectivamente com 100 ul de proteínas nativas ou modificadas metilglioxal (10 ug /ml). A absorvância (A) de cada poço foi monitorizada a 410 nm num leitor de microplacas automático. Cada amostra foi executado em duplicado e os resultados foram expressos em média de duas leituras.

Competição ELISA

A especificidade antigênica dos anticorpos foi determinada por ELISA de competição [27] .Varying quantidades de inibidores (0-20 ug /ml) foram misturadas com uma quantidade constante de afinidade de IgG purificada e a mistura foi incubada à temperatura ambiente durante 2 horas e durante a noite a 4 ° C. O complexo imune assim formado foi revestido nos poços no lugar da IgG. Os restantes passos foram os mesmos que no ELISA de ligação directa. A percentagem de inibição foi calculada utilizando a fórmula:

ensaio

desvio de bandas

Para a detecção visual de ligação ao antigénio do anticorpo e a formação do complexo imunitário, ensaio de retardamento em gel foi realizada [30]. Os complexos imunitários foram preparados por incubação de quantidade constante de histonas nativas e MG-modificadas com quantidades variáveis ​​de IgG purificadas por afinidade a partir de soros imunes de doentes com cancro em TBS durante 2 h a 37 ° C e durante a noite a 4 ° C. Um quarto de corante das amostras foi adicionado à mistura e a electroforese em 10% SDS-PAGE durante 4 horas a 80 V. Os géis foram visualizados utilizando coloração de nitrato de prata [21].

Análise estatística dos resultados

Todas as medições foram realizadas em duplicatas. Os resultados são expressos como a média ± S.D. A bicaudal

p

valor inferior a 0,05 foi considerado como significativo.

Resultados

espectroscopia de absorção

espectro de absorção UV de histona H1 nativa mostrou uma pico característico para as proteínas a 277 nm. A histona H1 modificado por 2,5, 5, 7,5 e 10 mM de metilglioxal exibiu 67,87%, 90,16%, 94,54% e 96,64% em hyperchromicities os picos espectrais respectivamente. A corcunda como pico tornou-se proeminente a 340 nm nas proteínas modificadas nas concentrações mais elevadas de MG. Os resultados são mostrados na Figura 1.

fluorescência intrínseca

Os máximos de fluorescência para a histona H1 nativa foi obtida a 305 nm e uma característica de emissão de tirosina. A incubação de histona H1 com concentrações crescentes de metilglioxal levou a uma diminuição significativa na intensidade de fluorescência. O 2,5, 5, 7,5 e 10 mM de metilglioxal modificado histona H1 exibiram uma redução de 31,31%, 49,68%, 81,78% e 95,31% na intensidade de fluorescência intrínseca quando comparado com histona H1 nativa. A concentração crescente de metilglioxal, na Amostras de proteínas conduziu a um desvio para o vermelho de 3, 6, 8 e 10 nm de comprimento de onda de emissão. Além disso, a protuberância adicional como picos foram observados na proteína modificada a 440 nm. Os resultados são apresentados na Figura 2.

Análise eletroforética

resultados PAGE mostraram um aumento da mobilidade eletroforética nas amostras de proteínas modificadas em comparação com a histona nativa. As proteínas modificadas apresentadas uma maior faixa que se estende como contra a histona nativa. Uma banda extra também apareceram nas proteínas modificadas com um peso molecular mais elevado do que a histona H1 nativa. Os resultados são apresentados na Figura 3.

análise de PAGE nativa e MG modificado histona H1: 25 ug cada de histona H1 nativo e 2,5, 5, metilglioxal modificado homólogos 7,5 e 10 mm foram colocadas em poços de 10 gel% de poliacrilamida em condições não desnaturantes (pista 1-5), pista 6 mostra o marcador de peso molecular.

AGE ensaio

Em condições idênticas, histona H1 nativa deu nenhuma idade apreciável fluorescência. As intensidades de fluorescência observados para histona H1 nativo e modificado foram 7,886 a 430 nm e 39,21 em 446 nm, respectivamente. MG-H1 exibiram aumento 79,88% na intensidade de fluorescência de AGE. Os resultados são mostrados na Figura 4.

hidrofobicidade da superfície (H

0)

Uma diminuição significativa na intensidade de fluorescência ANS em MG modificado H1, em comparação com histona nativa estava observado. Nativo e MG modificado H1 mostrou intensidades de fluorescência de 26,12 a 279 nm, e 5,21 a 276 nm, que corresponde a uma diminuição na intensidade de fluorescência por ANS 79,97% no caso da histona modificado. Uma mudança azul de 3 nm também foi visto no caso da proteína modificada. Os resultados são mostrados na Figura 5.

carbonilo reactivo conteúdo

A quantificação espectrofotométrica dos carbonilos reactivos ligados proteína após reacção com 2,4-dinitrofenil-hidrazina (DNPH) mostrou valores de absorvância de 0,055 e 0,624 para a histona H1 nativos e modificados, respectivamente, a 370 nm. O teor de carbonilo foi de 2,47 /mg nmole de proteína em histona H1 nativa e 28,36 /mg nmole de proteína no caso de metilglioxal modificado histona H1 que descreve um aumento de 11,48 vezes carbonilos reactivos. Os resultados são mostrados na Figura 6.

espectros de dicroísmo circular

CD análise espectral revelou diferença visível no ellipticities molares de histona nativos e modificados em três comprimentos de onda viz., 190 nm, 201 nm e 222 nm. Observou-se um aumento da elipticidade positiva a 190 nm, uma diminuição da elipticidade negativa a 200 nm e um aumento da elipticidade negativa a 222 nm. A elipticidade observada a 190 nm para a histona nativa e metilglioxal modificado H1 foi 0,909 MDEG e 1.249 MDEG respectivamente. A elipticidade negativo foi obtido a 200 nm e 222 nm. A 200 CD nm (θ) valores para histona nativa e metilglioxal H1 modificado foram – 33,615 MDEG e – 33,132 MDEG e em 222 nm, os valores foram -8,39 e -10,2 respectivamente. Os resultados são mostrados na figura 7.

térmica desnaturação Estudos (Tm) pelo Far-UV CD

As alterações nas características estruturais secundários obtidos através de estudos de temperatura de fusão, seguindo o desdobramento padrões de proteínas através da perda de elipticidade a 222 nm, mostraram abertura hélice no início da histona nativa, em comparação com o MG modificado histona. A temperatura de fusão do ponto médio (Tm) do nativo e modificado MG histona H1 saiu para ser 53 ° C e 64 ° C, respectivamente. Os resultados são apresentados na Figura 8.

análise espectroscópica FTIR-ATR

Os resultados de FTIR de histona H1 nativa mostrou vibracional estiramento C = O, uma banda característica amida I em 1635 cm

-1. No entanto, a modificação post, a banda amida I foi deslocado para 1640 cm

-1. Embora apareceu há bandas profundas na região amida II, mas a diferença de percentagem de transmitância na região era visível. Gravamos menos transmitância para histona nativa em relação à sua forma modificada. Além disso, observou-se um grupo adicional na proteína modificada, que mostrou uma faixa que se estende a 1731 cm

-1. Este alongamento não foi observada na forma nativa. A histona modificado também exibiu uma banda adicional a 1066 cm

-1, que estava ausente na forma nativa nesta região. bandas grandes foram observadas na região, com números de onda entre 3000 cm

-1 a 3500 centímetros

-1. Esta região foi mais ampla para a histona modificado do que para a proteína nativa. Os resultados são mostrados na Figura 9.

A cromatografia líquida espectrometria de massa

Os espectros de massa do padrão CEL foi tomado para investigar a presença de CEL e suas formas decompostos induzida por colisão na nativa e histonas modificado. O pico de base e dois espectros de massa do produto de iões de CEL padrão foram observados a m /z 219.0145 valores, 84,1024 e 130,1032, respectivamente (Figura 10A). Nenhum destes picos, como observado na CEL padrão foi encontrado no caso de histona H1 nativo (Figura 10B); a histona H1 modificado deu o produto ião mais proeminente a m /z de 84,1086. Os picos menos intensos foram observados a m /z de 130.1208 e 219.1432 (Fig 10C).

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

Scanning Electron Microscopy tem sido amplamente utilizada para revelar alta -resolução detalhes estruturais de proteínas. Como observado nas imagens de MEV, a formação de agregados é clara devido à modificação da histona H1 pela MG (Fig 11A). histona nativa parece bastante diferente da sua forma modificada (Fig 11B).

resultados de CD de interações DNA-proteína

A análise dicróico circular de interações entre histona H1 e DNA apresentaram variações acentuadas nas propriedades espectrais de histona nativa, a sua forma modificada e o ADN nativo. DNA nativa mostrou uma banda positiva em 277 nm (θ = 8,542) e uma banda negativo em 243nm (θ = 5,851). As interacções entre a histona H1 com chumbo ADN para diminuir no pico positivo a 276 (θ = 4,9123) e um aumento no pico negativo a 245 (θ = 5,092). Os resultados de MG modificado histonas e o ADN foram diferentes a partir de ADN e H1-ADN, uma vez que deu pico intermédio a 277 (θ = 5,882) e um aumento no pico negativo em 243 (θ = 4,394), respectivamente. Os resultados são apresentados na Figura 12.

estudos de transferência Western

25 ug de nativo e MG-H1 apareceu como bandas claras sobre gel de poliacrilamida após coloração de prata. A proteína modificada mostrou faixa que se estende, formação de entidade de peso molecular superior e um maior brilho em comparação com a contrapartida nativa. Na análise Imunoblot, anticorpos induzidos contra a MG-H1 mostraram ligação específica para o imunógeno com pouco reconhecimento para os epítopos sobre a histona H1 não modificado. Este reitera nossos resultados Elsia. O resultado é dado na figura 13.

A1 e A2 representSDS PAGE nativa e MG-H1, respectivamente. B1 e B2 são os imunotransfer�cias retratando ligação de anticorpos anti-MG-H1 a H1 nativa e MG-H1, respectivamente.

A ligação de auto-anticorpos no soro de pacientes com câncer para H1 nativa e MG modificou histona H1

Significativamente maior percentagem de auto-anticorpos no soro a partir de todos os tipos de cancro observado aumento na ligação com metilglioxal modificado H1, em comparação com a forma nativa nas experiências de ELISA de ligação directa. Fora da totalidade das amostras de soro 83, 54 amostras (65,06%) apresentaram significativamente maior ligação ao MG-H1as contra sua contraparte nativa, mostrando assim um melhor reconhecimento para a histona H1 modificado. Estes incluem 19 amostras de câncer de pulmão, 12 amostras de câncer de próstata, 15 amostras de cancro da mama e 8 amostras ofhead e pescoço. Os resultados são apresentados na Figura 14A-14D.

(a) ligação de auto-anticorpos no soro em pacientes do cancro do pulmão (soros não. 1-27) para nativa (□) e MG modificado histona H1 (■). Normal de soros humanos (NHS) serviu como controle negativo. As mostras do histograma valores médios de absorvância. (B) A ligação de auto-anticorpos no soro de pacientes com cancro da próstata (soros não. 28-46) para nativa (□) e MG modificado histona H1 (■). Normal de soros humanos (NHS) serviu como controle negativo. Os shows do histograma os valores médios de absorvância. (C) A ligação de auto-anticorpos no soro em pacientes com câncer de mama (soros não. 47-68) para nativa (□) e MG modificado histona H1 (■). Normal de soros humanos (NHS) serviu como controle negativo. Os shows do histograma os valores médios de absorvância. (D) A ligação de auto-anticorpos séricos em cabeça e pescoço paciente com câncer (soro não. 69-83) para histona H1 nativa (□) e MG modificado (■). Normal de soros humanos (NHS) serviu como controle negativo. Os shows do histograma os valores médios de absorção.

Ligação de IgG a partir de pacientes com câncer para H1 nativo e modificado MG histona H1

Para melhor avaliar a especificidade fina de auto-anticorpos em pacientes com câncer, IgG foi isolado a partir de amostras de soro que mostram maior ligação em direcção MG modificado histona H1 e avaliadas por ELISA de inibição. IgG foi misturado com quantidades variáveis ​​de nativo e MG-H1 (0-20 ug /ml) e incubou-se durante 2 horas a 37 ° C e durante a noite a 4 ° C. O H1 fornative inibição de anticorpos observados e histonas MG-H1 foi na faixa de 19,4% -36,2% e 49,2% -76,5% respectivamente.O significa a percentagem de inibição por H1 nativa na ligação de auto-anticorpos a partir de pulmão, próstata, mama e cabeça