Sumário

porco- (PORCN) é uma transferase O-acilo ligado à membrana que é necessário para a palmitoilação de proteínas Wnt, e que é essencial em diversas vias de Wnt para Wnt-Wntless (WLS) de ligação, secreção de Wnt, e a atividade de sinalização Wnt. Testou-se PORCN foi necessário para a proliferação de células transformadas. Knockdown de PORCN por múltiplos siRNAs resultados independentes de um defeito de crescimento de células num subconjunto de linhas celulares de cancro epiteliar. O defeito de crescimento é em células epiteliais mamárias humanas (HMEC) dependente da transformação. Além disso, PORCN knockdown indutível por dois shRNAs independentes reduz marcadamente o crescimento de estabelecidos MDA-MB-231 em xenoenxertos de cancros ortotópico em murganhos imunodeficientes. Inesperadamente, o defeito proliferação resultante da perda de PORCN ocorre de uma forma de Wnt-independente, uma vez que é resgatado por re-expressão de PORCN cataliticamente inactivo, e não é observada após knockdown RNAi-mediada da proteína transportadora de Wnt WLS, nem depois do tratamento com o inibidor IWP PORCN. Consistente com um papel numa via de Wnt-independente, knockdown de PORCN regula um conjunto distinto de genes que não são alterados por outros inibidores da sinalização de Wnt. proteína PORCN aparece, assim, a trabalharem em um romance via de sinalização que é a taxa-limitante para o crescimento de células cancerosas e tumorigênese independente da sua função enzimática no Wnt biossíntese e secreção

Citation:. Covey TM, Kaur S, Tan Ong T , Proffitt KD, Wu Y, P Tan, et ai. (2012) PORCN Moonlights em uma via Wnt-independente que regula Cancer proliferação celular. PLoS ONE 7 (4): e34532. doi: 10.1371 /journal.pone.0034532

editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japão

Recebido: 08 de dezembro de 2011; Aceito: 01 de março de 2012; Publicação: 11 de abril de 2012

Direitos de autor: © 2012 Covey et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado pelo Programa de Assinatura Research Duke-NUS e da Investigação (STAR) Investigator Award Translational Singapura (a DMV) financiado pela Agência de Ciência, Tecnologia e Pesquisa, Singapura e do Ministério da Saúde, Singapura. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Wnts são secretados glicoproteínas aciladas que podem atuar como moléculas de sinalização autócrina ou de curto alcance e morphogens de longo alcance. A 19 humana diferente Wnts regulam múltiplas vias de sinalização, e a sua desregulação está implicada em diversas desordens do desenvolvimento, biologia das células estaminais, a proliferação e a angiogénese [1], [2]. Existe, portanto, um intenso interesse na manipulação da via Wnt embora intervenção em diversos pontos na produção de Wnt e as cascatas de sinalização a jusante. Uma estratégia para atingir ampla interrupção de vias de sinalização Wnt é para evitar a secreção de Wnt por meio da inibição da proteína PORCN.

porco- (PORCN) foi descoberto pela primeira vez como um gene de polaridade de segmento de Drosophila necessário para a distribuição normal de Wingless (Wg ), o homólogo de Drosophila de WNT [3]. PORCN é um membro da transferase (MBOAT) O-Acil família ligada à membrana e é conservada entre espécies [4], [5]. PORCN é um multi-passe de membrana integral residente enzima no retículo endoplasmático e é necessário para a modificação lipídica de proteínas Wnt. A acilação por PORCN parece ser absolutamente essencial para a secreção adequada e a actividade de todos os vertebrados Wnts [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11] e eliminação genética de PORCN é embrionário letal [12], [13]. PORCN não tem nenhuma função conhecida para além do seu papel na biogênese de Wnts, e é, portanto, um alvo terapêutico atractivo em doenças com aumento da sinalização de Wnt. Na verdade, várias pequenas moléculas inibidoras de função PORCN foram recentemente descritos, incluindo inibidor da Wnt Produção 1 e 2 (IWP-1 e IWP-2) [14]. Existem duas abordagens gerais para a inibição PORCN, farmacológicas e genéticas. Notavelmente, estes métodos de inibição PORCN pode dar resultados diferentes. Isto pode ser devido a diferentes durações e grau de inibição, mas também porque a ablação genética de uma enzima pode inesperadamente desmascarar múltiplas funções independentes para um produto de gene único

Dois locais em proteínas Wnt pode ser acilado:. A serina correspondendo a S209 de Wnt3a é palmitoleated, enquanto que a cisteína correspondente ao Cys77 é palmitoilada [4], [11], [15]. acilação Ser209 é necessário para se ligar a WNT Wntless (WLS) [16], uma proteína transmembranar altamente conservado multipasse especificamente envolvido na secreção de Wnt [17], [18], [19]. WLS transporta Wnts para a membrana de plasma, onde eles são em seguida libertados no espaço extracelular de um modo dependente do pH. Consistente com o papel de Wnt WLS na secreção, as células sem WLS funcionais Wg acumular no Golgi [17] e ratinhos sem WLS têm fenótipos de desenvolvimento letais consistentes com um papel chave na sinalização Wnt [20]. O papel de Wnt cisteína acilação é menos claro [21]. Cys77 parece estar envolvida na actividade da proteína segregada de sinalização, tal como mutação de local os resultados de uma proteína segregada com actividade de sinalização variavelmente reduzida [15]. Palmitoilação neste local pode ser necessário para a ligação a receptores Frizzled ou outros.

Enquanto PORCN é claramente crítica para a secreção e a função de Wnt, não se sabe se que desempenha funções adicionais distintas da sua função enzimática na via Wnt . Por exemplo, pode acilar PORCN substratos não-Wnt adicionais. Alternativamente, uma vez que é uma proteína PORCN evolutivamente antigo presente nas metazoários mais simples [22], que pode ter co-evoluiu enzima independente, “bicos” funções tão bem. Como PORCN é tanto crucial no desenvolvimento e um potencial alvo terapêutico em doenças humanas, que é importante para compreender totalmente a função da proteína em células PORCN. Para dissecar o papel da PORCN no Wnt-dependente em relação vias Wnt-independentes, que comparou o efeito de inibição da secreção de Wnt por vários meios, incluindo PORCN knockdown, WLS knockdown, e pequena inibição molécula de PORCN. Descobrimos que as funções PORCN em pelo menos duas vias independentes, que controla a secreção de Wnt, e um segundo que não requer actividade de transferase palmitoil mas que é para o crescimento de células epiteliais transformadas limitante da velocidade e regula a expressão de um conjunto distinto de genes . O papel da PORCN Wnt-independente em rápida proliferação tem implicações importantes tanto para o desenvolvimento embrionário e câncer.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

Todos os experimentos realizados em ratos abordar relevante e necessária questões científicas. Estes foram realizados utilizando anestesia e analgésicos recomendados durante procedimentos e concluiu em tempo hábil para evitar dor desnecessária ou carga sobre os ratos. Todos os experimentos foram realizados com a aprovação do Comitê Animal Care e Use o NUS Institucional (IACUC).

Células, plasmídeos, e reagentes

Todas as linhas de células de câncer foram obtidos a partir da ATCC. As células STF e STF3A foram derivados a partir de células HEK 293 tal como anteriormente descrito [23]. HMEC transformada (hTERT + H-Ras V12 + p53 knockdown) e as células imortalizadas (hTERT) foram o dom de Mathijs Voorhoeve, Duke-NUS Graduate Medical School, Cingapura. células masculinas-tronco embrionárias de murino (ES), com um lócus PORCN alvejado que coloca sítios loxP a montante do exão 8 ea jusante do exão 10 foram feitas por Ozgene. células ES alvo de gene nulos PORCN foram seleccionados pelo laboratório de Davor Solter (Instituto de Biologia Médica, Singapura). MDA-MB-231 células que expressam pTRIPZ foram feitas utilizando transdução lentiviral (Abertas Biosystems). As sequências shRNA utilizados foram P1: 5’CCT GGA TAT CCT TCC ACA GCT -3 ‘P2: 5′-TAT TTA GCC AAT AAG ACA TGG T -3′, W1: 5’-ACC AAG AAG CTG TGC ATT GTT – 3 ‘, W5: 5′-TGG ACA TTG CCT TCA AGC TAA-3’. pMKIT-HA-mPORC-D (presente de Tatsuhiko Kadowaki) foi clonado no plasmídeo retroviral MSCV-Puro (presente de Mathijs Voorhoeve). Ponto e mutantes siRNA-imune foram feitas usando o site Stratagene Quikchange mutagénese dirigida. As células MDA-MB-231 e MCF-7 expressando de forma estável de tipo selvagem e mutante foram gerados PORCN por transdução retroviral e selecção em puromicina. A pequena molécula PORCN inibidores IWP-1 e IWP-2 foram generosamente fornecidos pelo Dr. Lawrence Lum. siRNAs foram de Dharmacon: Controle /não-alvo (# D-001810-01-05), PORCN 7 (# J-009613-07), PORCN 8 (# J-009613-08), WLS 5 (# J-018728 -05), beta-catenina 11 (# J-093415-11).

RT-PCR /qPCR.

O ARN total foi extraído a partir de células utilizando Qiagen RNeasy Kit, 1 ug de RNA estava reversamente transcrito utilizando o kit de síntese de ADNc iScript Bio-Rad, e qPCR foi realizado com Bio-Rad SsoFast EvaGreen Supermix. Modelos

mouse tumor.

Para knockdown transiente, 100.000 células MDA-MB-231 as células foram transfectadas com os siRNAs indicados (Controle ou P7) e depois injetadas no 4

th posição mamária almofada de gordura de camundongos NOD-SCID fêmeas mais velhas de 6 semanas. Para modelos de tumor e PORCN WLS, 500.000 células MDA-MB-231 células em 50 ul de DMEM foram injectados ortotopicamente na 4

th posição almofada de gordura mamaria de ratinhos fêmea de idade 6 semanas de BALB /c nus. Uma injecção de pós semanas, os agrafos foram removidos e o crescimento do tumor foi quantificada por medição de compasso de calibre. Para induzir PORCN knockdown, água de beber foi suplementada com doxiciclina a 0,5 mg /mL e actualizada a cada dois dias. Após o término do estudo, os tumores foram colhidos, pesados ​​e a expressão do gene foi analisada.

estudos de proliferação.

As células foram colocadas em placas a 70-80% de confluência em placas de 6 cavidades e foram transfectadas com os ARNsi indicados em 100 nm usando um Dharmafect seguindo o protocolo do fabricante. 24 h após a transfecção, as células foram tripsinizadas e novamente plaqueadas a uma diluição de 1:40 a 1:80 em placas de 12 poços. Para estudos de proliferação com IWP, as células foram plaqueadas em placas de 12 poços a 10% de confluência. Meios contendo veículo (DMSO) ou IWP-1/2 foi funciona diariamente. As placas de 12 poços foram recolhidos ao longo de um período de 7 dias, fixadas com MeOH arrefecido em gelo, e coradas com violeta de cristal (0,5% CV em 25% de MeOH). Para quantificar o número de células, o violeta de cristal foi solubilizado em 1% de desoxicolato de sódio em água e a absorvância foi medida a 590 nm. experimentos paralelos foram realizados e as células foram tripsinizadas e contadas com um contador Beckman Coulter durante um período de 7 dias.

Microarray.

MDA-MB-231 (70-80% confluentes) foram transfectadas com 50 nM de ARNsi durante 48 horas. O ARN foi isolado utilizando o kit de purificação RNeasy da Qiagen. Labeled ARNc foi preparado e hibridado com micromatrizes U133_Plus_2.0 Affymetrix de acordo com os protocolos do fabricante. Os dados da matriz foi normalizada usando o algoritmo de RMA. 1482 genes diferentes são detectados por uma ANOVA algoritmo (False Descoberta Rate (FDR) = 0,01). análise de agrupamento hierárquico identifica significativamente diferentes grupos de amostras a partir de 1482 genes diferentes. A análise foi realizada utilizando software Partek.

Resultados

PORCN é necessário para a secreção de Wnt

Para gerar ferramentas de investigação da função PORCN, foram identificados e validados dois independentes e não siRNAs que se sobrepõem, e siP7 siP8, que têm como alvo todas as variantes de splicing de PORCN e deram mais do que 90% knockdown de ARNm PORCN (Figura 1A) em células HEK-293. Como esperado, knockdown de PORCN na presença de Wnt3a transfectadas resultou numa diminuição da β-catenina /TCF-driven expressão de luciferase em células HEK-293 com um repórter integrada SuperTopFlash células (STF) (Figura 1B). Da mesma forma, knockdown de PORCN em células com STF integração estável de células Wnt3a (STF3A) resultou na secreção de um defeito Wnt3a para o meio (Figura 1C), consistente com o papel essencial da PORCN na secreção de Wnt.

. STF3A células foram transfectadas com 100 nM do ARNsi indicados e PORCN mensagem foi analisada 48 horas mais tarde por PCR em tempo real quantitativa. Histograma representa ARNm PORCN relativo normalizado para ARNm de actina. NT, não transf ectadas; SIC, controle de siRNA; siP7 e siP8, específico PORCN ARNsi. B. PORCN blocos knockdown sinalização Wnt /β-catenina. sinalização /β-catenina em relação Wnt foi medida em células STF3A transfectadas com 100 nM da SIC, siP7 ou siP8 siRNA. C. PORCN knockdown inibe a secreção Wnt3a. STF3A células foram transfectadas com 100 nM do ARNsi indicados. O meio foi alterado para 1% de meio FCS 48 horas após a transfecção, e recolhidas 16 horas mais tarde. A abundância de Wnt3a foi avaliada em 30 mL de meio condicionado (meio) e 15? G de lisados ​​celulares totais (WC) por SDS-PAGE e imunotransferência com os anticorpos indicados. Actina imunotransferência demonstra o carregamento igual de lisados ​​de células inteiras. D. números relativos de células de cancro da mama MDA-MB-231 é diminuída após PORCN knockdown. As células foram transfectadas com os ARNsi indicados e avaliados como proliferação em Procedimentos Experimentais. As barras de erro indicam o desvio padrão. E. PORCN knockdown retarda o crescimento de várias linhas celulares de cancro da mama. O número de células foi avaliada 4 dias após a transfecção de siP7 siRNA e representados como% de proliferação de células transfectadas com ARNsi de controlo. *, P 0,05; ** P 0,01 para diferença do controle. F. PORCN knockdown retarda selectivamente o crescimento de hMECs transformadas. O efeito do knockdown PORCN sobre o crescimento de hMECs imortalizadas com células HMEC-hTERT ou hTERT transformadas por expressão de H-RasV12 knockdown e estável de p53 foi avaliada 6 dias após a transfecção com controlo ou ARNsi siP7. A eficiência de transfecção em ambos os tipos celulares foi 80% como avaliado por expressão da GFP. *, P 0,05 comparado com o ARNsi de controlo. G. PORCN altera knockdown expressão de genes-alvo /β-catenina Wnt. Mensagem Relativa de PORCN e outros genes alvo de Wnt /β-catenina em células MDA-MB-231 (superior) e células-BR-3 SK (parte inferior) foi avaliada por meio de qRT-PCR de 72 horas após a transfecção com 100 nM do indicado siRNA.

Perda de PORCN inibe o câncer de mama crescimento celular

para testar se PORCN foi importante para a proliferação de células de câncer de mama foram avaliados pela primeira vez sua expressão em um painel de linhas celulares de cancro da mama. PORCN mRNA estava presente em todas as linhas testadas, com MDA-MB-231 e soma 159 células exibindo a mensagem mais abundante (Figura S1A). Nós adicionalmente analisadas estas células para a sinalização de Wnt /β-catenina basal, mas não ver activação consistente ou significativa de TOPFlash sobre o repórter controlo negativo FOPFlash em qualquer uma das linhas celulares testadas (dados não mostrados). Embora algumas destas linhas de células têm sido referidos como tendo activação de Wnt /β-catenina endógeno devido à regulação positiva de Wnts e silenciamento dos inibidores de Wnt segregados [24], [25], [26], sob as nossas condições de cultura não havia qualquer indicação de um loop autócrino Wnt.

Como a sinalização de Wnt pode activar tanto a via dependente β-catenina e β-catenina independente, testou-se PORCN knockdown afectou a proliferação e a sobrevivência destas linhas celulares do cancro da mama humano, mesmo na ausência de sinalização β-catenina endógena detectável. PORCN siRNAs siP7 siP8 e foram capazes de produzir, pelo menos, 75% knockdown de ARNm PORCN em células MDA-MB-231 (Figura 1G). Inesperadamente, este causou uma diminuição acentuada na proliferação de células ao longo do tempo (Figura 1D). Estas descobertas foram estendidas em cinco linhas celulares de cancro da mama adicionais; knockdown RNAi-mediada de PORCN causou uma diminuição estatisticamente significativa na proliferação (Figura 1E) em cada linha de células testada. knockdown RNAi-mediada de PORCN foi relatado para causar a apoptose em células de cancro do pulmão humano [27], embora este resultado não pode ser reproduzido de forma independente [28]. Enquanto que encontramos uma diminuição no crescimento de uma série de linhas celulares de cancro da mama, PORCN knockdown não resultou em apoptose ou uma mudança na distribuição do ciclo de células em qualquer das linhas tumorais testadas (Figura S1B, e dados não mostrados). Notavelmente, PORCN knockdown não afecta a proliferação de todas as células. Por exemplo, linhas de cancro derivados de mesoderme, tais como células de fibrossarcoma HT-1080 e fibroblastos BJ transformadas não foram afectados de forma mensurável (dados não mostrados). Além disso, PORCN não é essencial para o crescimento de células estaminais embrionárias e fibroblastos de embrião de ratinho [12], [13]. Importantemente, o efeito do crescimento de PORCN knockdown é a transformação específica em células epiteliais. hMECs transformadas são sensíveis a PORCN knockdown enquanto HMECs imortalizadas não são afetados (Figura 1F). Consistente com a constatação de que o efeito do knockdown PORCN sobre o crescimento não é dependente da sinalização de Wnt, os hMECs transformadas não apresentam qualquer evidência de sinalização de Wnt autócrino /β-catenina (dados não mostrados).

As consequências de PORCN knockdown foram examinadas ainda ensaiando genes alvo Wnt endógenos no SK-BR-3 e MDA-MB-231, uma vez que teve o maior defeito de proliferação após PORCN knockdown. Estas linhas foram relatados ter a sinalização Wnt autócrino [24], [29], embora não conseguimos detectar esta em ensaios TOPFLASH nas nossas linhas celulares específicos. PORCN knockdown em células MDA-MB-231 conduziu a um decréscimo modesto, mas estatisticamente significativa na abundância de transcritos que codificam os genes alvo de Wnt AXIN2, ciclina D, e LEF1 (Figura 1G, painel de cima). Uma redução significativa dos dois AXIN2 e ARNm LEF1 foi encontrada em SK-BR-3 de células (Figura 1G, painel inferior). Tomados em conjunto, PORCN knockdown diminuiu a taxa de crescimento de um número de linhas de células transformadas, e esta correlacionado de forma imperfeita com o knockdown de gene alvo de Wnt /β-catenina incluindo AXIN2, ciclina D e cMyc.

knockdown de PORCN retarda tumoral crescimento num modelo ortotópico de rato

Para abordar se PORCN knockdown pode retardar o crescimento de células tumorais num ambiente mais complexo em que os sinais derivados do estroma adicionais também pode estimular a proliferação, investigou-se a taxa de estabelecimento de tumores

in vivo

. MDA-MB-231 células transfectadas com siControl ou siP7 siRNA foram ortotopicamente injetadas em camundongos NOD-SCID e tomar tumor foi monitorado. MDA-MB-231 com knockdown PORCN transiente apresentado um intervalo de 2 semanas em tomar tumor em comparação com controlos (Figura S1C). O atraso na formação do tumor sugeriu que a função do gene PORCN é importante tumor tomar e /ou progressão e nos encorajou a prosseguir uma abordagem knockdown estável.

Para testar se a perda de PORCN afetaria o crescimento de tumores estabelecidos, nós analisamos 25 miR-30 construções à base e identificados dois microRNAs independentes que forneceram robusta knockdown PORCN. Estes foram clonados em um vetor lentiviral indutível, pTRIPZ, que fornece expressão dual de Proteína Fluorescente Vermelha (RFP) e o shRNAmir na presença de doxiciclina. As células MDA-MB-231 foram gerados com pTRIPZ integrado de forma estável, quer mexidos condução shRNAmir (shControl) ou um dos dois shRNAmirs independentes contra todas as variantes de splicing de PORCN (aqui chamado shP1 e SHP2). Em células em cultura, a adição de doxiciclina levou à indução da redução shRNAmir com -75% de mensagem PORCN e alta expressão de RFP (Figura 2A). Como esperado, esta diminuição do ARNm PORCN nas células MDA-MB-231 conduziu a um decréscimo na sinalização activadas por Wnt3a do repórter STF (Figura 2B). Para testar se PORCN knockdown pode ser induzida

In vivo

, as células foram injectadas em ratinhos ortotopicamente BALB /c nus. Quando os tumores atingiram um tamanho palpável (~ 0,2 cm), a doxiciclina foi adicionada à água de beber. Após 7 dias a doxiciclina, os tumores foram recolhidos e analisados ​​para a mensagem PORCN. Ambos os tumores shP1 e Shp2 tiveram uma redução na mensagem PORCN, indicando que a doxiciclina está atingindo as células e induzindo PORCN knockdown

in vivo

(Figura 2C).

A. Estabelecimento de PORCN knockdown inducible. MDA-MB-231 células com integração estável dos pTRIPZ- SHC (controlo), -shP1, ou -shP2 shRNAmir foram tratadas com 5 ng /mL de doxiciclina (à direita) ou veículo de controlo (esquerda). PORCN e ARNm de actina foi avaliada por RT-PCR, e a expressão RFP foi avaliada por microscopia de fluorescência. B. Induzível knockdown de PORCN inibe a sinalização de Wnt /β-catenina. As linhas celulares MDA-MB-231 foram transientemente transfectadas estáveis ​​com vector de expressão e Wnt3a SuperTOPflash e luciferase de Renilla plasmídeos repórter, e depois tratou-se com 5 ng /mL Dox durante 48 horas antes da avaliação da sinalização de Wnt /β-catenina, como descrito. Histograma representa SuperTOPflash sinalização em relação à expressão de luciferase de Renilla. C. induzível knockdown de ARNm PORCN em xenoenxertos ortotópicos. As linhas celulares estáveis ​​foram injectados ortotopicamente na 4

th almofada de gordura mamaria de ratinhos BALB /c nus. Após estabelecimento de tumores palpáveis ​​(15 dias), Dox foi adicionado à água por um período de 7 dias, os tumores foram colhidos e abundância de ARNm foi avaliada por qRT-PCR. Histograma representa ARNm PORCN relativo normalizado para ARNm de actina. D. PORCN knockdown retarda o crescimento do câncer. Os tumores foram colhidos e pesados ​​19 dias depois do início do tratamento com doxiciclina. o crescimento do câncer E. é retardado por inducible knockdown PORCN. O volume do tumor foi medido por pinças nos tempos indicados.

Para testar se PORCN knockdown afecta o crescimento do tumor, as mesmas linhas de células foram injectadas em ratinhos ortotopicamente BALB /c nus. Os tumores foram deixados para atingir ~ 0,2 cm de diâmetro (cerca de 2 semanas após a injecção) e, em seguida knockdown PORCN foi induzida pela adição de doxiciclina para a água. Após a indução por doxiciclina, houve uma redução significativa na taxa de crescimento de tumores que expressam quer shP1 ou SHP2 (Figura 2E). Este pareceu ser dependente da dose, como shP1 produzido tanto um maior knockdown da PORCN e uma maior redução no crescimento do tumor (Figura 2C e E). Uma vez que os tumores de controlo atingiram ~ 1 cm de diâmetro, os ratinhos foram sacrificados. Os tumores foram excisados, pesados ​​e medidos. Os tumores foram significativamente menor e mais leve que se continha o induzido shP1 ou SHP2 shRNAmir (Figura 2D). Estes resultados demonstram que o knockdown de ARNm em PORCN estabeleceu uma resultados ortotópicos de cancro da mama num atraso significativo no crescimento do tumor. Assim, PORCN desempenha um papel crítico na proliferação celular MDA-MB-231, tanto em cultura, e em xenoenxertos.

Perda de PORCN afecta o crescimento de células de cancro de um modo

Wnt-independente

O acima resultados mostram que o knockdown de PORCN regula a proliferação de várias linhas celulares de cancro da mama. O efeito sobre a proliferação não é devido aos efeitos fora do alvo do ARNi, uma vez que foram obtidos resultados idênticos com os dois siRNAs independentes e dois shRNAmirs independentes adicionais contra um total de 4 regiões diferentes de PORCN. Mais importante, todas as construções de ARNi foram dentro sequência contida dentro de cada uma das quatro variantes de splicing PORCN humanos codificação. Porque o efeito de PORCN knockdown não se correlacionou fortemente com o seu efeito sobre genes dependentes β-catenina, como AXIN2, a ciclina D e cMyc, considerou-se a possibilidade de que PORCN knockdown pode diminuir o crescimento celular através de um β-catenina circuito Wnt autócrina independentes ou , em alternativa, que PORCN tem algumas funções adicionais, Wnt-independentes. Para diferenciar entre estas possibilidades, que inibiu a secreção de Wnt por duas abordagens independentes adicionais.

A acilação de Wnts por PORCN é necessário para a sua ligação à proteína de transporte, WLS, que transporta Wnts do RE ou Golgi para o plasma membrana antes da secreção [16]. Como tal inibição, farmacológica de acilação e perda de WLS tanto inibir a secreção de Wnt semelhante a PORCN knockdown [17], [18]. Na medida em que sabemos até agora, todos os Wnts mamíferos exigem tanto PORCN e WLS para a secreção. Como esperado, siRNA knockdown de WLS e PORCN tudo semelhante e que inibia eficazmente accionado-Wnt3a sinalização (Figura 3A). PORCN função enzimática pode ser inibida com o inibidor de molécula pequena IWP-1 [14]. Semelhante aos resultados publicados, descobrimos que IWP-1 inibe a secreção para o meio de Wnt com um IC

50 de aproximadamente 200 nM (Figura 3B). IWP-1 também inibe eficazmente a sinalização-driven Wnt3a em células MDA-MB-231 em doses semelhantes (Figura 3C). Usando essas abordagens alternativas, examinamos a consequência da diminuição da secreção de Wnt sobre o crescimento de células cancerígenas.

A. WLS, β-catenina, e PORCN knockdown tudo inibir a sinalização de Wnt /β-catenina em células STF3A. Os seguintes siRNAs foram usados ​​em 100 nm: para PORCN, siP7; para WLS, siW5; para β-catenina, siβC11. B. IWP-1 inibe a secreção de Wnt3a. O meio condicionado a partir de células foi avaliada por STF3A Wnt3a como descrito após as células foram incubadas durante 16 horas na presença da concentração indicada de IWP-1. C. IWP-1 inibe a sinalização-driven Wnt3a em células MDA-MB-231. As células MDA-MB-231 foram co-transfectadas com Wnt3a e STF, durante a noite e tratadas com veículo (DMSO) ou doses indicadas de IWP-1. D. O indicada linhas de células foram transfectadas quer com siRNAs como acima, ou tratados com IWP-1 ou veículo de controlo. contagem de células total no dia 6 foi avaliada tal como descrito e em comparação com células não tratadas. IWP-1 foi utilizado a 2 uM e funciona a cada 24 h. E. Western blot de WLS em células MDA-MB-231 que expressam estavelmente SHC, shW1, e shW5 shRNAs. F. WLS knockdown não retardar o crescimento do tumor. As células MDA-MB-231 que expressam estavelmente SHC, shW1, e shW5 shRNAs ortotopicamente foram injectados em ratinhos nus BALB /C e o crescimento do tumor monitorizados como descrito. G. WLS níveis de mensagem em tumores extraídos de (E), avaliados por qRT-PCR e normalizadas para actina.

Surpreendentemente, ao contrário PORCN knockdown, knockdown de WLS teve pouco ou nenhum efeito sobre a proliferação de qualquer linha celular de cancro testadas, incluindo MDA-MB-231, MCF7, DLD-1, SK-BR-3, T47D, e células HeLa (Figura 3D e dados não mostrados). Da mesma forma, β-catenina knockdown não afectou o crescimento celular em células MDA-MB-231 ou células MCF7. Confirmando a eficácia de knockdown, perda de β-catenina diminuiu significativamente a proliferação de células DLD-1, que foram estabilizados β-catenina, devido a uma mutação no gene da polipose adenomatosa coli (APC) (Figura 3D). O pequeno efeito de knockdown β-catenina na proliferação de células MDA-MB-231 nesta experiência não foi observado em experiências repetidas. Além disso, a adição de IWP-1 em doses que dão 80% de redução da sinalização de Wnt /β-catenina não teve efeito sobre o crescimento celular ou a viabilidade das células MDA-MB-231, MCF7, e as células DLD-1, linhas que eram sensível a ambas PORCN siRNA e shRNA (Figura 3D). Nós alargado para este resultado um painel de outras linhas celulares de cancro e também não encontrou efeitos de IWP-1 ou da molécula relacionada IWP-2 no crescimento e viabilidade celular (Figura S2). Estes resultados demonstram que o bloqueio da secreção de Wnt por WLS knockdown ou tratamento IWP não alterou a proliferação de células de cancro e de sobrevivência, o que significa que estas células não dependem da sinalização de Wnt autócrino. É importante ressaltar que estes dados sugerem que a perda de PORCN pode, portanto, afetar o crescimento de forma independente Wnt.

Perda de WLS não afeta tumor tomar ou o crescimento

Por causa da surpreendente falta de efeito da WLS knockdown em cultura de células, buscou-se estender este resultado para um modelo de tumor. As células MDA-MB-231 foram transduzidas de forma estável com um de dois WLS shRNA de segmentação (shW1 e shW5) ou um shRNA controlo, (SHC). Ambos os shRNA WLS segmentação deu um knockdown eficiente no ARNm ( 80%) e ao nível da proteína (Figura 3E). Estas células foram injectadas em ratinhos nus ortotopicamente BALB /c e a progressão do tumor foi monitorizado. Os tumores de todas as três linhas cresceu a uma taxa muito similar (Figura 3F). Quando os tumores atingiram ~ 1 cm de diâmetro, eles foram removidos e avaliados quanto à persistência de WLS knockdown. Ambos shW1 shW5 e mantido a 60% de knockdown WLS nos tumores (Figura 3G). Assim, enquanto WLS knockdown é eficaz, persistente, e diminui a sinalização β-catenina, que não tem nenhum efeito sobre o crescimento de células ou tumores de xenoenxerto MDA-MB-231. Tomados em conjunto com o efeito de PORCN knockdown no crescimento do tumor (Figura 2E), esses dados ainda apoia a ideia de um papel Wnt-independente da PORCN no crescimento de células cancerígenas

in vivo

tipo selvagem e mutante PORCN ambos os efeitos do crescimento de salvamento

PORCN knockdown diminuiu a proliferação do cancro, ao contrário de inibição da actividade enzimática PORCN com a molécula pequena IWP-1. Este paradoxo sugerido que a proteína PORCN pode desempenhar um papel estrutural necessária nas células. Para confirmar que a perda de proteína PORCN é responsável pelos efeitos de crescimento observadas, procurou-se resgatar este fenótipo usando uma versão siRNA-imune de rato PORCN-D. Utilizando uma construção de MSCV-3XHA-tagged mPORCN-D [4], utilizou-se mutagénese dirigida ao local para dar imunidade a siP7 siARN. Para fazer PORCN cataliticamente inactivo, nós mutado H341, um resíduo catalítico invariante MBOAT previsto para participar de atividade catalítica PORCN. Experiências em várias linhas celulares PORCN nulos confirmou que mPORCN (H341A) é completamente inactivo cataliticamente (Figura 4E e dados não mostrados). Além disso, PORCN (H341L) foi recentemente demonstrado que é cataliticamente inactivo em células ES PORCN nula [13]. Em transfecções transitórias, a proteína mutante foi expressa PORCN em níveis semelhantes aos de tipo selvagem PORCN e actua de uma forma negativa dominante, inibindo eficazmente tanto a secreção e a expressão de luciferase de Wnt-TCF conduzido em células STF3A (Figura S3, A-C). Usando versões de siRNA-imune destas construções, que co-transfectadas células MDA-MB-231 com siP7 siRNA e mostrou não teve nenhum efeito na abundância da proteína PORCN ectópica (Figura 4A, painel superior), o que confirma a imunidade ao siP7 siARN. As células MDA-MB-231 que expressam mPORCN de tipo selvagem foram um aumento da actividade STF-driven Wnt3a (Figura 4B). Notavelmente, MDA-MB-231 células que expressam H341A mPORCN têm actividade reduzida de sinalização β-catenina-driven Wnt3a, consistente com uma função negativa dominante em células MDA-MB-231 também. Ambos tipo selvagem e H341A PORCN co-localizar com calnexin (Figura 4C), um marcador ER [30], de acordo com relatórios anteriores que mostram PORCN localização para o ER [4].

A. A análise de transferência de Western de células MDA-MB-231 transfectadas com construções de P7 imunes marcada com HA de WT e H341A PORCN. A construção PORCN contém 2 mutações silenciosas adicionais que o tornam imune a P7 siRNA knockdown. EV, vector vazio; WT, wildtype PORCN-HA; MT, H341A-PORCN-HA. B. tipo selvagem mas não PORCN mutante estimula a sinalização de Wnt /β-catenina. As células MDA-MB-231 foram co-transfectadas com plasmídeos que codificam para a WT e H341A-PORCN, Wnt3a, e o repórter SuperTOPflash. H341A-PORCN tem um efeito dominante negativo significativo sobre a sinalização de Wnt /β-catenina. C. tipo selvagem e mutante PORCN são apropriadamente localizada. microscopia de imunofluorescência indireta foi realizada com anticorpo anti-HA eo endoplasmático calnexin retículo marcador. D. tipo selvagem e dominante PORCN H341A negativos são igualmente eficazes em resgatar o defeito de crescimento causado por PORCN knockdown. MDA-MB-231 foram co-transfectadas com ARNsi P7 e expressão PORCN constrói como indicado. Os números de células foram medidos tal como descrito.