Abstract

Neste estudo, desenvolvido, caracterizado e validado

in vitro marcado com Anticorpo

um agente de contraste funcional superparagmagnetic base de óxido de ferro de ressonância magnética por conjugação de uma nanopartícula de óxido de ferro comercialmente disponível, Molday ION-Rodamina B carboxilo (MIRB), com um anticorpo monoclonal de ratinho deimmunized (muJ591) de antigénio de membrana específico da próstata segmentação (PSMA ). Este agente de contraste é funcional para a detecção específica e não-invasiva de células de cancro da próstata que são PSMA positivo, um marcador implicados na progressão do tumor da próstata e metástases. A reacção carbodiimida de duas fases utilizado para conjugar o anticorpo à nanopartícula foi eficiente e obteve-se um teor em ferro elementar de 1958 ± 611 por anticorpo. Microscopia de imunofluorescência e a citometria de fluxo mostrou que o conjugado muJ591: MIRB complexo se liga especificamente a células positivas para PSMA (LNCaP). O muJ591: complexo MIRB reduzida adesão celular e a proliferação celular em células LNCaP e causou apoptose conforme testado pelo ensaio de anexina V, sugerindo características anti-tumorigénica. As medições do tempo T2 relaxamento do muJ591: Complexo MIRB usando um MHz Innova NMR 400 e uma sequência spin-echo multi-eco em um 3T MRI (Achieva, Philips) mostrou uma redução do tempo de relaxamento T2 significativo para o muJ591: Complexo MIRB, com um tempo de relaxamento T2 reduzida como uma função da concentração de ferro. As células positivas para PSMA tratados com muJ591: MIRB mostrou um tempo de relaxamento T2 significativamente mais curto tal como obtido utilizando um scanner de 3T. A redução no tempo de relaxamento T2 para muJ591: MIRB, combinada com a sua especificidade contra células PSMA + LNCaP, sugerem o seu potencial como um agente de contraste MR-specific biologicamente

Citation:. Bates D, Abraham S, Campbell M, Zehbe I, Curiel L (2014) Desenvolvimento e Caracterização de um Super-paramagnética de óxido de ferro agente de contraste segmentação células cancerosas da próstata para ressonância magnética marcada com anticorpo. PLoS ONE 9 (5): e97220. doi: 10.1371 /journal.pone.0097220

editor: Roberto Furlan, San Raffaele Instituto Científico, Itália |

Recebido: 13 de dezembro, 2013; Aceito: 16 de abril de 2014; Publicado em: 12 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Bates et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Ontário de Câncer Research através de uma bolsa de investigação (10NOV-446) e as Ciências nacionais e Engenharia do Conselho de investigação do Canadá. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

nos últimos 10 anos, a incidência de câncer de próstata tem vindo a aumentar, mantendo-se o segundo câncer mais comum diagnosticada em homens em todo o mundo. Só no Canadá, é responsável por cerca de 27% dos cancros recentemente diagnosticados em 2012 [1]. o crescimento do tumor de próstata e se espalhou são frequentemente muito lento e permanecer sem ser detectada em estágios iniciais do câncer. planeamento detecção e tratamento actual baseia-se fortemente na utilização de antigénio específico da próstata (PSA) -expressing células. No entanto, a baixa especificidade desse teste levou a overtreatment de câncer mais cedo e menos agressivo e sub-tratamento de câncer indolente, mas agressiva, levando à alta morbidade [2]. Além disso, os tratamentos atuais têm alta morbidade e possíveis recaídas pós-tratamento, que comprometem a qualidade de vida e sobrevida do paciente [3], [4].

Estudos têm sugerido que, por antígeno de membrana específico da próstata visando especificamente (PSMA) células que expressam, tanto localizadas e condições agressivas pode ser tratada [3], [5] – [17]. PSMA é um biomarcador cancro da próstata altamente caracterizado localizado na membrana de células de cancro da próstata, o que sugere a sua utilidade para

In vivo

cancro da próstata estratégias de segmentação específicos [8], [9], [13] – [17]. O gene de PSMA foi clonado, sequenciado, e mapeado no cromossoma 11q14, e é expressa numa elevada percentagem de células epiteliais prostáticas malignas, mas não no endotélio vascular normal [6]. Na verdade, o PSMA é o antigénio da membrana das células epiteliais da próstata único e mais bem estabelecidas altamente restrito, enquanto que o PSA e fosfatase ácida prostática são proteínas secretoras [9], [17]. Imunoterapêutico e detecção de abordagens que utilizam os anticorpos anti-PSMA foram sugeridos como ferramentas excelentes, tanto para a detecção e tratamento do cancro da próstata [8], [9], [13].

PSMA receptores estão localizados principalmente para a apical membrana plasmática do epitélio da próstata e desempenham um papel fundamental na progressão de neoplasias da próstata, provavelmente através da promoção de sinalização anti-apoptótica, assegurando a resistência celular e promover a proliferação de células [6], [18]. Segmentação deste receptor com o anticorpo anti-PSMA J591 tem provado ser uma detecção eficaz e instrumento terapêutico para o cancro da próstata [10] – [12]. Para ser clinicamente aplicável, para o receptor anti-PSMA (mAb) do anticorpo monoclonal de ratinho é de-imunizados por substituição de sequências de imunoglobulina de murideo com sequências de imunoglobulina humana, resultando num anticorpo não imunogénico, humanizado, huJ591 [9], [13] – [15]. O mAb huJ591 tem sido amplamente utilizada na fase I de testes clínicos, onde foi demonstrado ser bem tolerada sem resposta do hospedeiro imune adversa [9], [14], [15].

ressonância magnética endorretal (MRI) está se tornando parte comum do local de trabalho-up para o câncer de próstata. estudos dinâmicos usando agentes de contraste gadolínio-DTPA demonstraram aumento útil de imagens de tumores [19] – [27]. detecção não invasiva de células que expressam PSMA poderia idealmente ser realizada por técnicas de ressonância magnética com contraste funcionais. Os agentes de contraste para melhorar o contraste de tecidos através da alteração dos tempos de relaxação de tecidos para melhorar a visibilidade das estruturas por meio de ressonância magnética. Tais métodos de detecção de exigir o desenvolvimento de agentes de contraste de MRI funcionais, por exemplo, ligando o anticorpo anti-PSMA para IRM agentes de contraste. Molday ION rodamina-B carboxilo (MIRB) é uma nanopartícula base de óxido de ferro disponível no mercado que reduz o tempo de relaxamento T2 de tecidos absorventes e assim ser detectado como uma perda de sinal em imagens de RM [28], [29]. O núcleo de óxido de ferro da nanopartícula MIRB pode ser quimicamente activado para reagir com o terminal amino de proteínas ou anticorpos para formar uma ligação peptídica, obtendo-se um anticorpo /proteína: conjugado complexo MIRB. Um estudo recente demonstrou que MIRB pode ser utilizado para marcar células estaminais, células cancerosas e células imunitárias que preservam as viabilidades celulares elevadas e é detectável por MRI [28]. facilidade de conjugação com a proteína ou o anticorpo, a sua concentração elevada carga de ferro para ressonância magnética, e boa tolerabilidade cela de MIRB torná-lo um bom candidato para um agente de contraste MR marcado com anticorpo funcional.

Neste estudo, desenvolvemos um funcional de óxido de ferro super-paramagnético (SPIO) à base MR agente de contraste que se liga especificamente a receptores de PSMA de ressonância magnética de células de câncer de próstata. Apresenta-se um método para desenvolver este agente de contraste para RM funcional utilizando um SPIO disponíveis comercialmente, Molday ION-Rodamina B carboxilo (MIRB), conjugada com o anticorpo do receptor de J591 anti-PSMA. Nós caracterizado e validado neste complexo anticorpo: SPIO-nanopartículas para a detecção específica de células tumorais do câncer de próstata positivo PSMA utilizando imunofluorescência, citometria de fluxo e 3T MRI clínica. O novo agente de contraste pode ser utilizado para a detecção específica e não-invasiva de células de cancro da próstata com o PSMA, um marcador implicados na progressão do tumor da próstata e metástase [10] -. [17], [30], [31]

Materiais e Métodos

Os anticorpos, agentes de contraste MR e reagentes

murino J591 mAb, a uma concentração de 5 mg /mL e com especificidade conhecida para PSMA, foi adquirido do Dr. Neil o laboratório de H Bander (laboratório de Urologia Oncologia, Weill-Cornell Medical College, New York, NY, EUA), através de um acordo de transferência de material institucional. O anticorpo de controlo de isotipo para a síntese e cultura de células de experiências foi uma IgG1 murina (monoclonal de ratinho IgG1 clone # 11711; Cat #: MAB002, R D systems, Minneapolis, EUA), solução salina a uma concentração de 5 mg /ml em 1 × tampão fosfato sem iões cálcio ou magnésio (Cat #: SH30028.02, Hyclone Inc, Logan, UT, EUA), conforme recomendação do fabricante

Molday ION Rodamina carboxilo (MIRB, Cat #:. CL-50Q02-6C- 50, Biopal, Inc., Worcester, MA, EUA) foi utilizado para preparar o anticorpo: SPIO complexos. Todos os reagentes necessários para as reacções de conjugação e análise, incluindo

N

– (3-dimetilaminopropil) –

etilcarbodiimida hidrocloreto de N ‘

(EDC), N-hidroxissuccinimida (NHS), 2- (4-morfolino) de hidrato de ácido etanossulfónico (MES), bicarbonato de sódio, água de grau HPLC (ChromoSolv água), clorofórmio, acetonitrilo, e óxido de deutério, foram adquiridos a Sigma Aldrich, Oakville, ON, Canadá, a menos que indicado de outra forma.

Anticorpo rotulagem

os anticorpos foram conjugados com MIRB baseada numa modificação do método do fabricante (Cat # CL-50Q02-6C-50, Biopal, Inc., Worcester, MA, EUA). Resumidamente, MIRB (0,2 mg de ferro) foi adicionado a 100 ul de muJ591 ou MUIGG a 1 mg /mL em 1 × tampão PBS (pH 7,65) em tubos de microcentrífuga esterilizado de 1,5 mL. O anticorpo com solução MIRB foi levemente agitada em vórtice antes da adição de 100 uL de tampão bicarbonato de sódio 0,1 M (pH 8,0), incubou-se gelo durante 15 minutos com vortex ocasional, em seguida, mantido 24 horas a 4 ° C num misturador de rotor. O anticorpo durante a noite incubadas: MIRB foram misturados com 50 ul de 2 mg /mL de solução de EDC em água desionizada mais 100 ul de tampão MES (pH 5,6) e mantidos a 37 ° C durante 5 min, com agitação em vórtice ocasional, antes da adição de 50 uL de 2 mg /mL de NHS e incubação a 37 ° C durante mais 15 min, com mistura ocasional. A solução foi então arrefecida em gelo durante 15 min e mantida a 4 ° C durante 48 h num misturador de rotor. Após 48 h, a mistura foi transferida para um tubo estéril de 15 mL cónico e lavado duas vezes com 500 ul de tampão 1 x PBS para extrair o anticorpo: MIRB conjugados ligados à parede do tubo. De modo a remover quaisquer anticorpos não ligados, a mistura reaccional foi transferida para um tubo cónico de 15 mL estéril fresco, contendo 50 ul de 2 mg /mL de NHS mais 150 uL de 0,25 M de tampão MES e vortex. Este tubo foi mantido durante a noite a 4 ° C num misturador de rotor, lavou-se com um volume igual de tampão de bicarbonato de sódio 0,1 M (pH 8,0) e centrifugou-se utilizando 10 K Amicon Ultra filtros centrífugos (Cat #: UFC201024, Millipore Ireland Ltd., Cork, Irlanda), com base no protocolo do fabricante para ultrafiltração. A solução retida na coluna de filtração, que contém o anticorpo restante: MIRB conjugados, foi lavada com bicarbonato de sódio 0,01 M (pH 7,65), utilizando os passos de permuta tampão descrito no protocolo do fabricante. Cada um dos eluentes foram analisados ​​para ambos os teores de anticorpo e de ferro usando o kit de ensaio de proteína de Bradford e ensaio de plasma indutivo espectroscopia de emissão atómica (ICP-AES), com base, respectivamente. A concentração de proteína total dos conjugados foi determinada pelo ensaio de proteína Bradford utilizando concentração gradiente de BSA e γ-globulina humana como padrões para a estimativa indireta do teor de anticorpos.

teor de ferro elementar análise

ICP- AES foi usado para determinar o conteúdo de ferro elementar do anticorpo: MIRB conjugados. Anticorpo: Os conjugados foram MIRB ácido digerido usando um volume igual de ácido nítrico a 70% em água desionizada grau LC-MS, num volume final de amostra de 6 ml; apenas tampão (controlo negativo) foi digerido de forma semelhante. Todas as amostras foram executados no CCD Pro simultânea instrumento ICP-OES Varian Vista (Varian, Inc., Palo Alto, CA, EUA).

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e energia dispersiva de raios X (EDX) espectroscopia

Os complexos muJ591: MIRB foi imobilizado sobre uma membrana de Nucleopore (Cat #: 800280, Whatman, Florham Park, NJ, EUA) e aqueceu-se a 57 ° C num forno de ar quente durante 25 minutos para remover a humidade. O complexo immoblized foi então montado e revestida por borrifamento com carbono. MEV foram adquiridas em 5000 e 10,000 × ampliação usando um Hitachi Su-70 Schotty Field Emission SEM (Hitachi High Technologies America Inc, Dallas, TX, EUA) com uma resolução de 1,5 nm a 1 kV. O mesmo sistema foi utilizado para realizar raios-X espectroscopia de energia dispersiva (EDX) a 5000 × ampliação para confirmar a presença de matéria orgânica e nanopartículas SPIO.

análise granulométrica

O tamanho das partículas de muJ591: MIRB conjugado foi determinada por dispersão dinâmica de luz. O muJ591: conjugado MIRB foi disperso em 0,9% de solução salina a uma concentração de proteína de 0,01% w /v. As medições foram realizadas utilizando um instrumento Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Worchestershire, Reino Unido). Os resultados de dimensão das partículas foram relatados como a intensidade média harmónica diâmetro de partícula (média Z ou) e são expressos em nanómetros.

de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) análise

Para determinar se o muJ591 : MIRB conjugado gerado a partir de reações de rotulagem manteve as características de super-paramagnética exigidas de um agente de contraste MR, medimos o tempo de relaxamento T2 em RMN. As amostras com concentrações de proteína total igual (0,04 ug /uL) de MUIGG: MIRB e muJ591: MIRB complexos foram preparados separadamente em 600 mL de óxido de deutério e transferidos para tubos de Wilmad RMN (Cat #: Z272019, Sigma Aldrich, St. Louis, MO , EUA). tempo de relaxação T2 foram obtidos após a optimização do campo magnético da máquina RMN Innova Unity 500 e as amostras foram tratadas de acordo com a recomendação do fabricante.

análise fluorimétrica

Para testar se a reacção de conjugação causou aumento de fluorescência ou extinção do fluoróforo rodamina-B sobre os conjugados MIRB foi realizada uma análise fluorimétrica. MIRB nanopartículas e muJ591: amostras de complexos MIRB com uma concentração de ferro igual foram analisadas para a intensidade de fluorescência e comprimento de onda de intensidade de pico (λ

max), utilizando um leitor de placas f luorimétrico Synergy4 (BioTek, Winooski, VT, EUA). O λ pico

max e λ

turno max foram determinadas através da representação gráfica dos valores de intensidade de fluorescência em diferentes comprimentos de onda de excitação e emissão.

cultura celular

células LNCaP PSMA-positivo (CRL -1740) e PSMA-negativos células DU145 (HTB-81) foram adquiridos a partir de Cultura de células American Type, Manassas, VA, EUA. Todas as células foram cultivadas em um temperatura de 37 ° C, 5% de CO

2 incubadora utilizando meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de antibióticos /antimicóticos. As células foram cultivadas a 80% de confluência em 75 cm

2 tampa ventilada, frascos pescoço falcon inclinada (Cat #: 353136, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EUA) com meios reabastecido a cada três dias

Anticorpo: MIRB especificidade para o PSMA complexo

as células foram semeadas a uma concentração inicial de 1,000 (por DU145) e células LNCaP (para 2000) por poço em placas de 96 poços e cultivadas durante 3 dias antes de realizar as experiências. os estudos de imunofluorescência foram então conduzidos em LNCaP e DU145 após o tratamento com 0,1 mg /mL muJ591: MIRB durante 1 h com ou sem adição de anticorpo secundário conjugado com AlexaFluor-488 fluoróforo. Em seguida, as células foram incubadas com BSA a 0,5% quente em meio RPMI para encorajar as células a internalização do anticorpo. As células foram então visualizadas em diferentes pontos de tempo (15 min, 30 min, 1 h, 1,5 h, 2 h, 4 h, 6 h e 12 h) sob um padrão microscópio de fluorescência invertido (Axiovert 200, Carl Zeiss. De Gottingen, Alemanha ) ligado a uma câmara de circuito fechado (de 12 bits, Q-Imaging, Surrey, Canadá).

um ensaio de citometria de fluxo foi realizada com base em uma modificação do método descrito por Peldschus K et ai (2010) [ ,,,0],32]. As células foram descoladas utilizando tripsina-EDTA (Invitrogen, Carlsbad, CA), que foi inactivada por meio de lavagem com 10% de FBS meio RPMI-1650. As células foram então lavadas duas vezes com soro isento de meio RPMI-1640, antes da adição de 250 uL MUIGG, MUIGG: MIRB, muJ591, muJ591: MIRB (concentração de proteína de 0,05 mg /mL) seguido por 1 hora de incubação sobre gelo. Os controlos não tratados foram incubadas num volume equivalente de meio isento de soro. Celulares ligados conjugados de anticorpos foram marcados para a detecção usando cabra Phycoerthyrin conjugado rato anti-IgG (Cat # 550589, BD Pharmingen). A citometria de fluxo foi então realizada utilizando um dispositivo FACSCalibur (Becton Dickson, Franklin Lakes, NJ, EUA). medição da fluorescência foram dados como médias geométricas e medianas de 10.000 eventos e representada graficamente em diagramas. Experimentos foram realizados em triplicata e comparou-se a mudança de intensidade de sinal entre células não tratadas e células tratadas com MUIGG, MUIGG: MIRB, muJ591 ou muJ591:. MIRB

A adesão celular

A adesão celular após o tratamento de placas com muJ591 e muJ591: MIRB foi avaliada. O muJ591: MIRB complexo e muJ591 mAb foi preparado em 1 × solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração de 0,01 ug /ml. Em seguida, pré-revestidas placas de 96 poços com 100 ul de muJ591: complexo MIRB e muJ591 mAb em quadruplicado, e incubou-se durante a noite a 4 ° C durante a imobilização do complexo sobre a superfície da placa. Após incubação durante a noite, que aspirado para fora da solução e os poços bloqueados com 1% de BSA em 1 x PBS durante pelo menos 10 minutos e novamente aspirado para fora. poços não tratados foram utilizados como controle. Cerca de 100.000 LNCaP ou DU145 células foram então semeadas nos poços pré-revestidas e de controlo e incubadas a 37 ° C, 5% de CO

2 durante 40 minutos. As células foram, finalmente, lavou-se com soro isento de meio RPMI-1640 até que as células nos poços não revestidos parou separar. Todas as células foram então fixadas com metanol gelado e coradas com violeta de cristal a 0,1%. Filtrou-SDS a 2% foi adicionado e as placas foram incubadas com agitação à temperatura ambiente durante 30 minutos, após o que, as leituras de absorvância a 550 nm foram colhidas utilizando o leitor de placas PowerWave XS (BioTek, Winooski, VT, EUA). Foram comparadas as leituras de absorvância dos muJ591- e muJ591:. MIRB placas revestidas com respeito aos poços de controlo não tratadas para analisar a adesão

proliferação celular e apoptose

Para a avaliação da proliferação de células, uma resazurina baseados no ensaio fluorimétrico (Cat # AR002, R D Systems, Minneapolis, MA, EUA) foi realizada. Depois de as placas de 96 poços foram pré-revestidos com muJ591: MIRB ou 1 × solução salina tamponada com fosfato (controlo) e bloqueadas com BSA a 1% como descrito acima, ou DU145 1000 2000 células LNCaP foram semeadas. As células foram cultivadas até cavidades de controlo atingiu 80% de confluência. As células LNCaP e DU145 foram ainda tratados com muJ591: MIRB complexo (0,01 ug /ml) ou de meio de soro livre (controlo) durante 1 h, após o que o meio foi substituído com meio isento de soro. A solução foi adicionado Resazurina, tal como recomendado pelo protocolo do fabricante, e as placas foram ainda incubadas a 37 ° C, 5% de CO

2 durante 2 horas, seguido de 20 minutos de incubação com agitação no escuro à temperatura ambiente. As intensidades de fluorescência foram então medido às 2, 6, 12 e 24 h após muJ591:. MIRB tratamento utilizando o leitor de placas FLx800 na excitação de 540 nm e de emissão de 590 nm

Para determinar a apoptose e a morte celular causada pela os muJ591: MIRB complexos em células LNCaP, um ensaio de Anexina V-FITC foi realizada (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA). As células foram desalojadas dos frascos utilizando EDTA 2 mM em 1 × solução salina tamponada com fosfato, sedimentadas e ressuspensas em meio estéril, suplementado e, em seguida semeadas em placas de 6 cavidades de cultura a uma concentração de 10.000 células por poço. Uma vez que as células atingiram 80-90% de confluência, muJ591: MIRB ou controlo (MUIGG: MIRB, 0,01 ug /mL e meio livre de soro) tratamento foi adicionado aos poços durante 1 h, seguido de 3 lavagens em solução salina tamponada com fosfato (PBS). análise de citometria de fluxo foi então realizada com base no método descrito por Richard et al (2010) [33].

In vitro

RM

Para validar poderíamos detectar mudanças na o tempo de relaxamento T2 com um scanner MR clínica foi realizada ressonância magnética dos conjugados primeiro e, em seguida, células tratadas com conjugados. O muJ591: MIRB e MUIGG: complexos MIRB, bem como muJ591, MUIGG e MIRB sozinho foram suspensas em PBS em diferentes concentrações (0,28, 0,14, 0,07, 0,04, 0,02 e 0,01 ug de concentração de proteína /mL para os anticorpos, e 0,13, 0,06, 0,03, 0,02 ug /mL para a concentração de ferro no MIRB). Em seguida, 100 mL de meio livre de soro foram adicionados a placas de 96 poços (n = 3) e colocado no scanner MR.

Para

in vitro

célula RM, tanto LNCaP e DU145 As células foram plaqueadas, em triplicado, a concentrações de 10

5 células /poço em placas de 96 poços e cultivadas durante 36-48 h. As células foram então tratadas com 100? L de anticorpo: Os conjugados MIRB ou anticorpos não conjugados durante 1 h, lavadas 2 x vezes com meio livre de soro, 1 × tempo com 1 × tampão Tris-EDTA solução salina tamponada, e 1 × vezes com 0,01 M tampão de bicarbonato de sódio para remover os conjugados não ligados, e, em seguida, ressuspensas em 100 ul meio isento de soro e colocadas no scanner MR. foram usadas MIRB e MUIGG (0,28, 0,14, 0,07, 0,04, 0,02 e 0,01 ug /mL de concentração de proteína)

Para determinar o limite de detecção de células LNCaP foram: Diferentes concentrações de muJ591: MIRB, muJ591, MUIGG. semeadas em placas de 96 poços, em triplicado, em concentrações de 10

5, 7,5

5, 5

5, 2,5

5 e 1,25

5 células /poço e cultivadas durante 48 h. As células foram então tratadas com 100 ul de muJ591: MIRB durante 1 h, lavou-se 2 x vezes com meio livre de soro, 1 × tempo com 1 × tampão Tris-EDTA solução salina tamponada, e 1 × vezes com tampão de bicarbonato de sódio 0,01 M para remover desacoplado conjugados, novamente suspensas em 100 mL meio livre de soro e colocado no scanner MR.

um scanner 3T MRI clínica (Achieva 3.0T TX, Philips, Best, Holanda) com uma pequena superfície foi utilizado bobina Flex. As imagens foram adquiridas com uma rotação sequência multi-echo echo com tempos de 64 eco espaçadas de 5,8 ms (TE /TR = N * 5.8 /1245 ms, FOV = 160 mm x 160 mm, de 1,5 mm de espessura de fatia, matriz de 184 × 184 aquisição, 384 × 384 matriz de reconstrução, flip ângulo de 90 °, de ETL = 32, 1 NEX, onde N é o número de eco de 1 a 64). A intensidade como uma função do tempo de eco foi ajustado a: (1)

Quando M

Z é a intensidade em tempo de eco TE; A, B e T2 são os parâmetros de ajuste [34]. Uma imagem paramétrica do tempo de relaxamento T2 foi obtido para todas as imagens de amostras de anticorpos e as células tratadas com anticorpo. O tempo médio de relaxamento T2 para cada amostra de anticorpos e células vivas foi obtido a partir dos valores de T2 de cada pixel nestas imagens paramétricas.

A análise estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando software Graphpad Prism ( GraphPad Software Inc, La Jolla, CA, EUA). Todos os dados foram testados quanto à normalidade e homogeneidade da variância, utilizando um teste de Shapiro-Wilks e um teste de Bartlett, respectivamente, antes de escolher um paramétrico adequado ou teste estatístico não paramétrico. Um valor p resultante de menos do que 0,05 foi considerado significativo. conjuntos de dados paramétricos foram analisados ​​por meio de testes t de Student ou one-way ANOVA, seguido por um adequado pós-hoc, como uma Tukey HSD. conjuntos de dados não paramétricos foram analisados ​​por meio de uma via Kruskal Wallis ANOVA seguido de post hoc de um Nemenyi, e os testes de Friedman seguido por uma comparação de pares usando uma assinatura de teste de classificações de Wilcoxon com um ajuste de Bonferroni.

Resultados

Antibody: MIRB complexa caracterização molecular

ICP-AES foi utilizado para estimar a quantidade de ferro elementar presente em cada um dos MUIGG conjugado: MIRB e muJ591: complexos MIRB. Observamos que muJ591: complexos MIRB teve 1958 ± 611 (n = 8) de ferro elementar por anticorpo enquanto MUIGG: complexos MIRB teve 2906 ± 631 (n = 8) de ferro elementar por anticorpos. A presença de nanopartículas de ferro na muJ591: Complexo MIRB foi ainda confirmada por espectroscopia de raios-X por Dispersão em Energia (Figura 1). A presença do ferro, também foi confirmado por um rápido tempo de relaxamento T2 obtido por análise de RMN a 400 MHz, que foi de 12,9 ± 0,7 ms para a muJ591: complexo MIRB e 10,2 ± 0,6 para o MUIGG:. Complexo MIRB

A. Scanning Electron Micrograph (SEM) de muJ591 imobilizado: complexos MIRB e mapeamento B. energia dispersiva de raios X (EDX) para Fe, C, O e N sobreposto ao SEM. A presença de nanopartículas MIRB pode ser observado como sinal de ferro (seta a cheio) e o anticorpo como sinal de matéria orgânica (seta a tracejado). As grandes estruturas de branco são os sais do tampão seca

A presença do muJ591:. MIRB complexo imobilizado sobre os cristais de sal do tampão pode ser observado nas imagens de SEM-EDX sobrepostas (Figura 1). mapeamento EDX mostrou a presença de carbono, azoto e hidrogénio sugerindo a presença de componentes orgânicos (anticorpos), bem como ferro a partir da nanopartícula MIRB

Os tamanhos médios de partícula para o muJ591:. MIRB conjugados foram 34,75 ± 14,41 nm com um valor de índice de polidispersibilidade (PDI) de 0,23 ± 0,01. Para efeito de comparação, foram realizadas medições de tamanho de partículas para as nanopartículas MIRB sozinho e obteve 34,64 ± 10,83 nm com um PDI de 0,25 ± 0,02, que estão dentro dos valores reportados pelo fabricante (35 nm)

Antibody:. Complexo MIRB especificidade

microscopia de imunofluorescência foi usada para determinar se células positivas para PSMA LNCaP foram especificamente detectado pela muJ591: MIRB complexo. A Figura 2 mostra o pós-tratamento ponto de tempo de 2 h para ambas as células LNCaP e DU145 tratados com muJ591: MIRB complexo. AlexaFluor-488 coloração permitido para a localização do anticorpo dentro de regiões sub-celulares e extracelulares de células LNCaP que expressam PSMA (Figura 2A). O fluoróforo de rodamina-B (vermelho) que está anexado a MIRB foi especificamente detectada em células LNCaP que expressam PSMA (Figura 2C). Não foram observados sinais fluorescentes vermelhas ou verdes na linha celular de controlo DU145 (Figura 2B e 2D), sugerindo elevada especificidade de muJ591: Complexo MIRB na detecção de células cancerosas da próstata PSMA-positivos

detecção baseada em microscopia de fluorescência de PSMA-. a linha positiva de células do cancro da próstata com muJ591: complexo MIRB: coloração com anticorpo secundário conjugado com AlexaFluor-488 mostra a ligação do anticorpo J591 em (a) LNCaP e que (B) células de controlo DU145 ter nenhuma ligação; e (C) rodamina-B fluoróforo foi observado em células LNCaP (PSMA-positivo) e não em células DU145 (D) (PSMA-negativo).

supressão de fluorescência e valorização de emissões têm sido relatados por sistemas conjugadas de metal-fluoróforo [35]. Nós determinamos que ocorreu paragem da fluorescência em nosso sistema, comparando a intensidade de fluorescência e o pico λ

max de MIRB sozinho e muJ591: complexo MIRB (Figura 3). O λ

max para MIRB só foi 575 nm, enquanto que para o muJ591: Complexo MIRB, o λ

max mostrou dois picos distintos entre 560-575 nm. Além disso, as intensidades de fluorescência entre o pico X

valores max foi de 40 ± 2% mais baixa para o muJ591: MIRB complexo em comparação com MIRB sozinho. Esta redução de valor de pico e a mudança no pico λ

max valores para o fluoróforo rodamina-B sugerem que a conjugação pode saciar a capacidade de fluorescência do fluoróforo rodamina-B para o complexo.

Efeito da conjugação de anticorpos na intensidade de fluorescência relativa do complexo Molday ION rodamina-B (n = 3)

a especificidade e absorção de muJ591:. MIRB comparação com o muJ591 não conjugada e controlar MUIGG foi examinada com cancro da próstata ao vivo linhas de células usando citometria de fluxo. células LNCaP tratadas com muJ591 ou muJ591: MIRB mostraram uma fluorescência mudança de intensidade significativa em FL-2, em comparação com as células não tratadas ou tratamento MIRB apenas e que ambos tinham uma mudança semelhante (Figura 4A). A mudança para muJ591 e muJ591: MIRB tratamento de células LNCaP mostram que há uma absorção específica elevada e do complexo anticorpo-anticorpo e nanopartículas pelas células positivas para PSMA e que não se altera após a conjugação com a nanopartícula. Ligação não específica como testado pelo MUIGG e MUIGG: MIRB não foi observada (Tabela 1). As células de controlo DU145 desprovidas de PSMA não apresentaram mudança na intensidade de qualquer tratamento (Figura 4B)

Especificidade e captação de muJ591:. MIRB, MUIGG: MIRB, muJ591 e MUIGG de células de câncer de próstata. células A. LNCaP apresentou uma mudança que mostrou captação do muJ591 e do conjugado muJ591: MIRB e sem absorção de anticorpos os controles MUIGG ou MUIGG: MIRB conjugado anticorpo. células B. Controle DU145 não apresentaram captação

Antibody:. funcionalidade complexa MIRB

Nós determinamos os efeitos anti-proliferativa, pró-apoptóticos e anti-tumorigênicos potenciais de o muJ591: MIRB conjugado nanopartículas. Em placas revestidas com ambos muJ591 e muJ591: MIRB a leitura da absorvância mostrou uma adesividade reduzidos em células LNCaP semeadas após o revestimento (Figura 5A, p 0,01). Não houve diferença no efeito sobre a adesividade entre o anticorpo e o muJ591 muJ591: complexo MIRB (p = 0,7). O revestimento teve também um efeito sobre células DU145 adesividade mas foi menos pronunciado (Figura 5B). Estes resultados sugerem que o efeito do anticorpo muJ591 na adesividade celular permaneceu inalterada pelo rotulagem anticorpo com MIRB.

A. Reduziu significativamente a adesão em células LNCaP (t-teste de Student, ** P 0,01, n = 4) foi observado como uma redução na absorvência causado pelos dois mAb muJ591 e muJ591: MIRB revestimento. B. A adesão também foi reduzida por este revestimento em células DU145, mas o efeito não foi tão acentuado.

Ensaios fluorométricos baseados em Resazurina

realizada a 2, 6, 12, e 24 h pós-tratamento determinou-se a efeitos anti-proliferativos de muJ591: MIRB em células de cancro da próstata LNCaP positivas para PSMA. Uma diminuição dependente do tempo na proliferação de células para células de LNCaP e nenhuma alteração em células DU145 negativas para PSMA foi observado (Figura 6). Isto sugere que muJ591: MIRB, foi altamente específica para limitar a proliferação celular de células LNCaP

Efeito sobre a proliferação celular de células de cancro da próstata LNCaP e DU145 muJ591 seguinte:. MIRB tratamento em diferentes pontos de tempo obtida como o normalizado resazurina valor unidade fluorescente (RFU) por células tratadas em relação às células não tratadas. células LNCaP mostraram uma RFU significativamente menor do que as células LNCaP tratados com o veículo de comando de arranque no momento ponto-6 h, enquanto que nenhuma alteração significativa foi observada em muJ591: células DU145 tratados com MIRB. teste t de Student, * p 0,05 considerado significativo, n = 4.

Houve níveis significativamente mais elevados de células positivas anexina V em muJ591: células LNCaP tratados com MIRB em relação ao controle (veículo ou MUIGG : MIRB) células LNCaP tratadas. A Figura 7 mostra a percentagem de células LNCaP vivas e mortas, tal como avaliado por citometria de fluxo Anexina V na presença de muJ591: tratamentos MIRB e de controlo;