Abstract

sulfatide é um glicoesfingolipídio conhecido para interagir com várias proteínas da matriz extracelular, tais como tenascin- C, que é sobre-expresso em muitos tipos de cancro incluindo o do cólon. Em vista do sucesso limitado da quimioterapia no cancro colo-rectal e elevada toxicidade da doxorubicina (DOX), uma abordagem de encapsulação de lipossomas contendo sulfatide (SCL) foi feita para ultrapassar estas barreiras. Este estudo avaliou a citotoxicidade in vitro, biodistribuição, a eficácia terapêutica e a toxicidade sistémica in vivo de sulfatide contendo doxorrubicina lipossomal (SCL-DOX) usando o adenocarcinoma do cólon humano HT-29 de xenoenxerto como modelo experimental. In vitro, SCL-DOX foi mostrado para ser entregue nas núcleos e exibida retenção prolongada em comparação com a DOX livre. A utilização deste sistema de entrega para entregar nanodrug DOX para o tratamento de ratinhos portadores de tumor produziu uma eficácia melhorada tanto terapêutico em termos de supressão do crescimento tumoral e sobrevivência prolongada em contraste com o fármaco livre. Além disso, o tratamento de ratinhos portadores de tumor com SCL-DOX resultou numa absorção inferior DOX nos principais locais de toxicidade da droga livre, ou seja, o coração e pele, bem como mielossupressão e cardiotoxicidade reduzida diminuída. Tais sistemas de entrega nanodrug guiadas em lipídios naturais pode representar uma nova estratégia para o desenvolvimento de quimioterápicos antineoplásicos eficazes que visem o microambiente do tumor para ambos tumor primário e micrometástases

Citation:. Lin J, Yu Y, Shigdar S, Fang DZ , Du JR, Wei MQ, et ai. (2012) aprimorado antitumoral Eficácia e Redução Toxicidade sistémica de sulfatide Contendo Nanoliposomal Doxorrubicina num modelo de xenoenxerto de cancro colorectal. PLoS ONE 7 (11): e49277. doi: 10.1371 /journal.pone.0049277

editor: Maurilio Sampaolesi, Stem Cell Research Institute, Bélgica

Recebido: 22 de julho de 2012; Aceito: 08 de outubro de 2012; Publicação: 07 de novembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Lin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do National Health and Medical Research Council (# 479505); Austrália-India Fund Strategic Research, (ST01-0013). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal é a terceira causa mais comum de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo [1], [2], com até 25% dos pacientes com doença metastática. Apesar de a cirurgia e quimioterapia, muitos destes pacientes eventualmente sucumbir a doenças metastáticas. terapias adjuvantes, incluindo radioterapia e quimioterapia, são projetados para atingir células tumorais residuais. Na fase III, os doentes com cancro colorectal, a quimioterapia continua a ser a estratégia de tratamento principal [3]. No entanto, o sucesso destas terapias é limitada pelo aparecimento de células cancerosas resistentes a terapia, assim como toxicidades limitativas da dose [4]. Ao longo das últimas décadas, os sistemas terapêuticos em nanoescala surgiram como novas modalidades terapêuticas para o combate ao câncer [4]. As formulações de nanopartículas de fármacos anticancerígenos livres tradicionais pode ter melhorado a farmacocinética e biodistribuição, perfis de eficácia anti-tumor melhorada, bem como a reduzida toxicidade para os tecidos saudáveis.

fármacos lipossomais foram os primeiros aprovado e amplamente utilizada como a nanomedicina, para o tratamento de cancros [5], [6]. Os lipossomas são vesículas microscópicas de fosfolípidos com uma estrutura da membrana em bicamada. Estudos pré-clínicos e clínicos demonstraram que os perfis farmacocinéticos, bem como as especificidades de segmentação, de lipossomas pode ser controlada e modificada para reduzir os efeitos secundários de fármacos encapsulados e melhorar a sua eficácia [7], [8], [9].

Nós desenvolvemos recentemente um sistema transportador lipossomal romance que é composto por dois lípidos encontrados em seres humanos, e 1,2-sulfatide dioleoyl-

sn-glicero-

3-fosfoetanolamina (DOPE) [12 ], [13]. De acordo com um pH fisiológico, DOPE confere estabilidade ao sulfatide contendo lipossomas (SCL) através dos seus efeitos inibitórios sobre a fusão de lipossomas, tal como a incorporação de sulfatide em vesículas DOPE melhora grandemente a estabilidade dos lipossomas formados, mesmo na presença de plasma, presumivelmente devido à a hidratação do sulfato de cabeça-grupo carregado negativamente da glicoesfingolipídio [10]. Nós também têm demonstrado que a interacção entre sulfatide e tenascina medeia a ligação de SCL ao ECM e endocítica absorção dos lipossomas pelas células de tumor, pelo menos in vitro [10], [11].

A entrega direccionada de agentes anti-cancerígenos para o microambiente do tumor é uma avenida promissora para a terapia de cancro colorrectal metastático. A tenascina-C, um grande glicoproteína extracelular hexabracchion matriz, é altamente expresso no microambiente da maioria dos tumores sólidos, incluindo cancro colorectal, mas é muito reduzida ou ausente na maioria dos tecidos adultos [14]. O nosso sistema transportador lipossomal contendo sulfatide representa, assim, uma nova classe de sistema de entrega intracelular de lípidos naturais guiada por segmentação do microambiente do tumor. Ao explorar uma nova direcção tal para o desenvolvimento de agentes quimioterapêuticos anti-cancro mais eficazes, é importante compreender o comportamento in vivo do nanocarrier, como a única distribuição regulada pelas propriedades do nanocarrier podem alterar a eficácia terapêutica, bem como alterar a toxicidade perfil do fármaco encapsulado. No presente estudo, nós utilizamos um modelo de murganho de xenoenxerto de adenocarcinoma colo-rectal humano (HT-29) que é conhecido por expressar tenascina-C [15], [16] e um medicamento de quimioterapia amplamente utilizado, a doxorrubicina (DOX), como um modelo de carga útil para estudar a biodistribuição, a eficácia antitumoral e toxicidade do sistema transportador lipossomal contendo sulfatide.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

o Comitê de Bem-Estar animal da Universidade Deakin aprovou todos os animais protocolos utilizados nesta pesquisa.

Cultura de células

A linha de células de adenocarcinoma colorretal humano HT-29 foi adquirido da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). 5A de McCoy meio (modificado) foi adquirido de Invitrogen ™ (Austrália). de soro bovino fetal (FBS) foi adquirido a Hyclone (Canadá). A tripsina foi adquirida a Invitrogen ™ (Austrália). frascos de cultura de tecidos foram adquiridos a BD Falcon ™ (Austrália). pratos com fundo de vidro foram adquiridas a partir de MatTek Corporation (Ashalnd, MA, EUA). Células HT-29 foram cultivadas em meio de McCoy 5A suplementado com 10% de soro fetal de bovino, penicilina (50 U /ml) e estreptomicina (50 ug /ml), numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2 e 95% de ar a 37 ° C.

Preparação de SCL-DOX

Os lipossomas foram preparados de acordo com um método previamente publicado com algumas modificações [10]. Resumidamente, vesículas unilamelares DOPE contendo 30% sulfatide (razão molar) foram preparados por um método de hidratação seguidas por extrusão de membrana de policarbonato. DOPE (13,35 mM) e sulfatide (6 mM, Avanti Polar Lipids, Inc.) foram dissolvidos numa mistura de clorofórmio e metanol (02:01, v /v), e a mistura de lípidos, composto de DOPE /sulfatide (3: 7, mol /mol), foi transferido para tubos de vidro. As amostras foram, em seguida, reduzido a um volume mínimo sob uma corrente de azoto, e armazenado sob vácuo durante 24 h a 4 ° C para evaporar completamente o solvente orgânico. As películas lipídicas finas foram hidratadas pela adição de 1 mL de sulfato de amónio 250 mM (pH 8,5). As amostras foram então colocadas num banho de gelo-água e sonicou-se, sob azoto, durante 2,5 min com 50% de amplitude usando um sonicador (Sonics Materials, Inc). Após sonicação, os lipossomas foram formados por extrusão através de membranas de policarbonato (Avanti Polar Lipids, Inc.) com tamanhos de poro de 400 nm consecutivos durante 14 vezes, a 200 nm para 14 vezes e 100 nm para 19 vezes à temperatura ambiente. Para estabelecer um gradiente de sulfato de amónio trans-bicamada, os lipossomas extrudidos foram dialisadas contra um volume 250 vezes maior de 10% de sacarose em Trizma 25 mM a pH 8,5 a 4 ° C durante 24 h. O tampão externo foi mudado três vezes durante a diálise. Após a diálise dos lipossomas, de DOX, em sacarose a 10% a uma concentração final de 5 mg /mL, foi adicionado aos lipossomas a uma razão fármaco para lipído de 0.3:1 (w /w), seguido de incubação numa banho de água a 60 ° C durante 1 h. Não-encapsulado DOX foi removido por cromatografia de exclusão de tamanho utilizando uma coluna Sephadex G-50. A concentração de fosfolípidos (DOPE) nos lipossomas foi determinada como descrito anteriormente [17]. O tamanho da vesícula e potencial zeta de SCL foram medidos usando Zetasizer Nano ZS Particle sistema de caracterização de Malvern? Instruments (Malvern, Reino Unido). A DOX carregado na SCL foi quantificada utilizando um detector de fluorescência em Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC).

cromatográfica instrumentação foi utilizado baseado num método anteriormente publicado, com algumas modificações [18], [19]. Resumidamente, o sistema de HPLC (Milford, MA, EUA) utilizada neste estudo é composto por um módulo Waters e2695 Separação e um Waters 2475 Detector de Fluorescência multi λ. Os comprimentos de onda de excitação e de emissão foram fixados em 470 nm e 585 nm, respectivamente. A separação cromatográfica foi realizada utilizando uma coluna Nova-Pak C18 (3,9 × 150 mm de d.i., 4 mm, Waters, EUA) com uma coluna de guarda C18 Nova-Pak (3,9 × 20 mm d.i., 4 mm, Waters, EUA). Uma mistura de metanol e tampão fosfato 10 mM (pH = 3,0) foi utilizado como fase móvel. O caudal utilizado no ensaio foi de 1 mL /min e a coluna foi mantida a 40 ± 5 ° C durante todo o processo cromatográfico.

Análise de Citotoxicidade

O efeito de DOX livre ou SCL-DOX no modelo HT-29 de citotoxicidade foi determinada utilizando o ensaio de proliferação celular do MTT [20], [21]. Células HT-29 foram semeadas a uma densidade de 2 × 10

3 células por poço numa placa de 96 poços em meio 5A de McCoy 100 ul contendo 10% de FBS. solução de DOX livre e SCL-DOX foram adicionados a cada poço 24 h após o plaqueamento (concentração final de 0-100 ug /ml). Após 48 h de incubação a 37 ° C, 5% de CO

2, absorvância foi medida a um comprimento de onda de 570 nm utilizando um leitor de placas VICTOR TM X5 Multilabel HTS (PerkinElmer Life and Analytical Sciences). A citotoxicidade foi expressa como uma percentagem das células de controlo. A concentração de inibição de 50% (IC

50), definido como a dose de agentes que inibiram 50% do crescimento celular, foi interpolada a partir das curvas de crescimento utilizando o SPSS 13.0 [18], [19]. Todos os experimentos foram realizados em triplicado e repetido três vezes.

Confocal análise de microscopia para Cellular captação e retenção de SCL-DOX

HT-29 células (1 × 10

5 células /poço) foram semeadas em placas de 35 mm de vidro pratos de fundo e incubadas a 37 ° C em 5% de CO

2 durante 24 h. O meio foi então substituído com meio de cultura completo que continha 2 ug /mL de DOX livre ou SCL-DOX. Vinte e quatro horas mais tarde, as células foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e fotografada para estudos de captação celular. Para os estudos de retenção, as células foram primeiro expostas a 2 ug /mL de DOX livre ou SCL-DOX no meio de cultura celular completo, durante 24 h e, em seguida, lavada duas vezes com PBS. As células foram então incubadas com meio de cultura celular fresco e fotografada em série em 1 h, 2 h, 4 h, e 24 h usando um laser de fluorescência microscopia confocal de varrimento FluoView FV10i (Olympus, Japão).

Análise das propriedades farmacocinéticas in vivo

Sprague-Dawley (SD) ratos (200 a 250 g) foram alojados num quarto com temperatura controlada (25 ± 1 ° C) com um ciclo de luz-escuro de 12 h. Os ratos foram alimentados

ad libitum

com uma dieta padrão, mas foram mantidos em jejum durante a noite antes DOX livre ou administração SCL-DOX. Todos os procedimentos envolvendo experimentação animal foram aprovados pelo Comitê Bem-Estar Animal da Universidade Deakin.

Para investigar a farmacocinética (PK) propriedades do SCL-DOX in vivo, ratos SD saudáveis ​​foram injetados por via intravenosa com DOX livre ou SCL-DOX via na veia da cauda com uma dose única de 5 mg de DOX /kg. O sangue foi recolhido em série a partir do mesmo animal em tubos heparinizados a partir da cauda aos 2 min, 0,5 h, 2 h, 6 h, 24 h e 48 h. Após a recolha, as amostras foram centrifugadas a 3000 ×

g

a 4 ° C durante 10 minutos para separar o plasma. Para determinar os níveis de DOX no plasma, 495 ul de metanol e 405 ul de tampão de fosfato foram então adicionados a 100 ul de plasma, agitada em vórtice durante 1 min e centrifugou-se a 21000 ×

g

durante 10 min a 4 ° C. O sobrenadante foi transferido para outro tubo, seguida pela adição de 2 ul de ácido perclórico (35%, v /v). As amostras foram agitadas durante 1 min e centrifugou-se a 21000 ×

g

durante 10 min a 4 ° C, seguido pela medição da concentração de DOX utilizando HPLC.

Implantação de tumor, tratamento e Avaliação

tumores de xenoenxerto foram estabelecidos em 6 semanas de idade do sexo feminino BALB /c-Foxn1

nu ratos que foram comprados a partir do animal Resources Centre (Perth, Austrália). Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes do animal institucional Conselho de Acção Social da Universidade de Deakin. Os ratinhos foram mantidos sob condições isentas de agentes patogénicos em TECNIPLAST Sealsafe ™ gaiolas individualmente ventiladas (Buguggiate, Itália) a (25 ± 1 ° C) e a 12 h de luz /12 horas de ciclo escuro. Eles foram alimentados

ad libitum

com uma dieta padrão.

HT-29 de células utilizadas para os tumores de xenoenxerto foram preparadas por tripsinização. As células foram lavadas e ressuspensas a uma concentração de 3 x 10

7 células /mL em PBS, o qual foi, em seguida, inoculados subcutaneamente (s. C.) No flanco direito dos ratos. O tamanho do tumor foi avaliada utilizando um paquímetro digital a cada dois dias após o implante e carga tumoral aproximada (mm

3) foi calculado como comprimento x largura

2/2 (

V

=

lw

2/2), onde o comprimento e largura são o eixo mais longo e mais curto em milímetros [22].

Para o estudo captação tumoral, ratos com tumores de ~ 150 mm

3 foram tratados com DOX livre ou SCL-DOX (5 mg /kg de DOX ou equivalente) através de injecção na veia da cauda. Vinte e quatro horas após a injecção, os ratinhos foram sacrificados por injecção de Lethabarb R (100 mg /kg) e os tumores foram processados ​​tal como descrito anteriormente [23], [24]. concentração de DOX no tecido foi determinada utilizando HPLC.

Para experiências terapêuticas, os ratos foram tratados quando os tumores de xenoenxerto atingiu 35 mm

3. Os ratinhos receberam uma injecção de solução salina, DOX livre (5 mg /kg), SCL-DOX (5 mg /kg em DOX) ou em branco SCL via veia da cauda, ​​duas vezes por semana durante 3 semanas. O crescimento do tumor foi monitorizado medindo os diâmetros do tumor cada dois dias com um compasso de calibre e animais pesos foram monitorizados ao mesmo tempo. O ponto final do estudo foi definida como a carga tumoral atingindo 1,700 milímetros

3.

Análise de Toxicidade sistémica

Para avaliar a toxicidade geral da DOX livre e SCL-DOX, sangue foi coletada quando os ratos para experiências terapêuticas foram sacrificados. contagem de células sanguíneas e troponina foram analisadas por um laboratório de patologia veterinária (Gribbles Patologia Veterinária, Clayton, Victoria, Austrália). esfregaços de sangue foram obtidas de cada animal, para se obter uma contagem de glóbulos brancos em relação adaptado a partir do método de contagem de plaquetas para fonio [25], [26], com modificações menores. As lâminas foram coradas com Giesma e uma área do esfregaço de sangue foi escolhida, onde os glóbulos vermelhos encostados uns aos outros, mas não se sobrepõem, com campos consecutivos escolhidos para eliminar polarização. O número total de glóbulos brancos por 1500 células vermelhas foram contadas (n = 3 para cada slide) e comparadas para cada grupo.

Análise de Dados

Todos os resultados são apresentados como médias e erro padrão (média ± SE). Os parâmetros farmacocinéticos foram calculados a partir das concentrações plasmáticas médias usando o software farmacocinético software DAS 2,0 (Mathematical Farmacologia Comité Profissional da China, Shanghai, China). As diferenças nos valores médios entre os diferentes grupos foram determinados por uma análise de uma via de variância (ANOVA) utilizando o programa SPSS 13.0. A significância foi considerada a valores de

p

. 0,05

Resultados

Caracterização de SCL

O diâmetro do SCL incorporando DOX foi encontrada para variar dentro 92,3 ± 1,3 nM (média ± DP, n = 10) com um índice de polidispersidade (PDI) de 0,15 ± 0,01 (média ± EP). Com uma relação peso inicial de DOX para DOPE de 0.3:1, o SCL teve uma eficiência média aprisionamento DOX de 94,11 ± 2,27% (média ± S.E.). O valor potencial zeta de SCL foi -26,38 ± 2,20 mV (média ± S.E..). A DOX dopar relação de peso após DOX encapsulação em SCL foi 0.5:1.

intracelular captação e retenção de SCL-DOX em células HT-29

Aproveitando a propriedade de fluorescência natural de DOX , a captação e retenção de livre DOX ou SCL-DOX celular foi estudada usando laser scanning microscopia confocal. Células HT-29 foram incubadas com 2 ug /ml de DOX ou SCL-DOX durante 24 h. Após lavagem, examinou-se a captação celular de diferentes formulações de DOX. Como mostrado na Figura S1 (baixa ampliação) e Figura 1 (ampliação elevada), ambos DOX livre e SCL-DOX foram absorvidos pelas células de adenocarcinoma colorectal e havia acumulação de DOX no núcleo em ambos os grupos (Figura 1), embora células tratadas com DOX livre mostrou ligeiramente mais forte fluorescência vermelha (DOX) do que aqueles tratados com SCL-DOX após 24 h de incubação. Curiosamente, a retenção de SCL-DOX em células HT-29 foi melhor do que isso para livre DOX. Como mostrado na Figura S2A (baixa ampliação) e Figura 2A (ampliação elevada), após lavagem com PBS e a incubação em meio fresco durante 4 h, a fluorescência de DOX no grupo de DOX livre diminuiu significativamente. Além disso, as células tratadas com acesso DOX mostrou fluorescência vermelha diminuição de 24 h após a lavagem. Por outro lado, a fluorescência vermelha para SCL-DOX foi mais estável em comparação com o do grupo de DOX livre. Mesmo 24 horas após a lavagem, DOX fluorescência pode ser facilmente observado nos núcleos de células tratadas com SCL-DOX (Figura S2B e a Figura 2B). A retenção aumentada de SCL-DOX in vitro sugere que a formulação de SCL DOX pode apresentar melhor eficácia do tratamento in vivo.

células HT-29 foram incubadas com 2 ug /mL de DOX livre ou equivalente SCL-DOX para 24 h. Após duas lavagens com PBS, as células foram fotografadas com um microscópio de fluorescência confocal. (A) células tratadas com acesso DOX. (B) As células tratadas com SLC-DOX. Vermelho: fluorescência a partir de DOX; azul: núcleos corados com Hoechst 33342. As barras de escala: 10 mm

HT-29 células foram incubadas primeiro com 2 ug /mL DOX livre ou equivalente SCL-DOX por 24 h.. Após duas lavagens com PBS para remover os fármacos, as células foram cultivadas em meio de cultura completo fresco seguido por imagiologia em série em 1 h, 2 h, 4 h e 24 h utilizando microscopia confocal. (A) células tratadas com acesso DOX. (B) As células tratadas com SLC-DOX. Vermelho: fluorescência a partir de DOX; azul: núcleos corados com Hoechst 33342. As barras de escala:. 10 um

In vitro A citotoxicidade

Para o estudo da citotoxicidade in vitro, células HT-29 foram expostas a várias concentrações de livre DOX ou SCL-DOX durante 48 h, e a viabilidade celular foi medida utilizando o ensaio MTT. Como mostrado na Tabela 1, o IC

50 de DOX por células HT-29 foi de 1,74 ± 0,10 ug /mL, enquanto o IC

50 de SCL-DOX foi de 2,77 ± 0,06. Assim, sob condições in vitro onde as células foram expostas a uma concentração constante dos agentes ao longo de todo o período de ensaio, DOX livre foi mais tóxico do que o SCL-DOX. Vazio SCL não mostraram efeitos sobre a sobrevivência da célula (dados não mostrados).

melhores propriedades farmacocinéticas de SCL em ratos sadios SD

As propriedades farmacocinéticas de ambos DOX livre e SCL- DOX foram estudados em ratos SD do sexo masculino saudáveis. A cinética de depuração do soro de DOX livre e SCL-DOX foi comparada como se mostra na Tabela 2. Neste estudo, a taxa de depuração de DOX encapsulada por SCL-Dox (1,39 L /h /kg) foi significativamente mais baixa do que a da solução de DOX ( 2,68 l /h /kg,

p Art 0,01), sugerindo uma taxa diferente da depuração de SCL-DOX em comparação com o fármaco livre. Além disso, a área sob o plasma curvas de concentração-tempo durante o período de estudo (AUC

0-48 h) de DOX entregue através SCL foi 2,37 vezes maior do que livre DOX (

p Art 0,01) . Assim, DOX poderia exibir uma taxa de depuração significativamente reduzida, bem como biodisponibilidade melhorada quando administrado aprisionado em SCL.

biodistribuição e captação tumoral Vantagens do SCL-DOX

Estudos comparando a acumulação de DOX livre ou SCL-DOX em tumores e órgãos foram realizadas em um /c ratinhos nus HT-29 de modelo de xenoenxerto de tumor de ratinhos BALB. Os animais foram injectados i.v. com uma única dose de DOX livre ou SCL-DOX (5 mg /kg) e não houve diferença estatisticamente significativa na concentração de DOX nos rins entre os dois grupos de tratamento 24 horas após a administração. Os pulmões e fígado apresentou maior acumulação DOX (4,74 vezes e 12,94 vezes, respectivamente) com um tratamento de SCL-DOX (Figura 3A), e o baço, um órgão principal do sistema reticuloendotelial, mostrou um 17 vezes maior acumulação de DOX com tratamento SCL-DOX. No entanto, o tratamento de SCL-DOX em ambos os órgãos principais que exibem toxicidades limitativas da dose de DOX clinicamente, nomeadamente a pele e coração, diminuiu a acumulação de DOX a 59,0% (0,039 ± 0,001 ug /g contra 0,066 ± 0,003 ug /g) e 77,4% (0,956 ± 0,073 ug /g contra 1,235 ± 0,083 ug /g) em comparação com o DOX livre, respectivamente (Figura 3A e 2B). acumulação DOX Além disso, SCL encapsulamento significativamente melhorado (cerca de 1,3 vezes; 0,060 ± 0,005 ug /g contra 0,047 ± 0,003 ug /g) em que o tumor de xenoenxerto em comparação com o livre DOX (figura 3D), confirmando claramente a entrega DOX intratumoral aumentada por SCL -DOX in vivo.

ratinhos nus portadores humanos de cancro colorectal HT-29 xenoenxertos foram tratados com 5 mg /kg DOX livre ou SCL-DOX iv Os ratinhos foram sacrificados 24 horas mais tarde. Os órgãos e tecidos foram colhidos, lavados, pesados, e a DOX foi extraído e quantificado. Os dados são apresentados como média ± E.P. (N = 5~6). *,

P Art 0,05 em relação ao livre DOX; **,

P

. 0,01 em comparação com livre DOX

Avançado Terapêutico Eficácia do SCL-DOX

Foram avaliadas a atividade antitumoral do SCL-DOX usando a ratinhos BALB /c nu HT-29 do tumor modelo de xenoenxerto. Uma vez que o tumor tinha aumentado para cerca de 35 milímetros

3, dividiu-se os animais aleatoriamente em quatro grupos (n = 5~10), a fim de minimizar a diferença de peso e o tamanho do tumor entre os grupos. Os seguintes regimes foram administrados i.v. duas vezes por semana durante 3 semanas: (

i

) solução salina; (

ii

) vazia SCL; (

iii

) livre DOX (5 mg /kg) e (

iv

) SCL-DOX (5 mg /kg). O peso corporal dos animais e o tamanho do tumor foram então monitorizado até que o tamanho do tumor nos animais de controlo atingiram o ponto final do estudo. Como apresentado na Figura 4, para os grupos de ratinhos que receberam soro fisiológico ou SCL vazio de controlo, o tratamento não mostraram qualquer eficácia, e os tamanhos de tumor médio no final do estudo eram 1129.03 ± 55,06 milímetros

3, e 1188,63 ± 137.54 mm

3, respectivamente (média ± SE; n = 5~6). O grupo de tratamento SCL-DOX demonstrou eficácia superior, com uma carga de tumor média final de 586.52 ± 29,63 milímetros

3, em comparação com 809.13 ± 43,75 milímetros

3 no grupo DOX livre. Assim, em comparação com solução salina ou tratamento de DOX livre, a eficácia de SCL-DOX para suprimir o crescimento do tumor na dose de 5 mg /kg foi significativamente melhorada por ~1.9 vezes e ~1.4 vezes, respectivamente.

Os ratinhos portadores de xenoenxertos de HT-29 foram injectados iv com soro fisiológico, 5 mg /kg de DOX livre, SCL-DOX ou SCL vazio, duas vezes por semana, durante 3 semanas, como indicado, a partir do dia, quando o volume do tumor atingiu ~ 35 mm

3. Os dados apresentados são médias ± E.P. (N = 5~6). *,

P Art 0,05 em comparação com soro fisiológico; **,

P Art 0,01 em comparação com soro fisiológico; #,

P Art 0,05 em relação ao livre DOX; ,

P Art 0,01 em comparação com SCL em branco; ,

P

. 0,001 comparado com SCL em branco

Em seguida, comparamos as taxas de sobrevivência de ratos portadores de tumores seguintes os quatro diferentes regimes de tratamento. Como mostrado na Figura 5, tempos médios de sobrevivência para os quatro grupos diferentes foram 26 dias (salinas), 33 dias (livre DOX), 36 dias (SCL-DOX) e, 32 dias (em branco SCL), respectivamente. Assim, o tratamento de SCL-DOX aumento médio do tempo de vida de 38,5% em comparação com o grupo de controlo de solução salina, por 12,5% em comparação com o grupo de SCL e branco de 9,1% em comparação com o grupo de DOX livre. Estas experiências demonstraram que a administração de SCL-DOX em 6 doses ao longo de um período de três semanas originou não só uma melhor inibição do crescimento do tumor, mas também melhorou a sobrevivência de animais portadores de xenoenxertos.

A curva de sobrevivência de Kaplan-Meier mostra a melhoria do tempo de vida de ratinhos portadores de xenoenxertos tratados com SCL-DOX (n = 9~10 por grupo). Os ratos foram tratados como indicado na Figura 3 e foram sacrificados durante todo o período do estudo em cima de alcançar o nosso ponto final do estudo.

Redução Toxicidade sistémica de SCL-DOX

cardiomiopatia induzida por DOX é um das toxicidades principais que limitam a dose da droga [27]. Troponina-T é liberado de miócitos DOX-danificados [28], portanto, a medição dos níveis séricos desta proteína fornece uma avaliação sensível de cardiotoxicidade inicial da DOX. O método utilizado na presente estudo tem um limiar de corte de 0,01 mg /L para indivíduos normais [29]. Como mostrado na Tabela-3, o tratamento de DOX livre resultou em um nível sérico de troponina 75-vezes mais elevada em comparação com os controlos, o que confirma a cardiotoxicidade conhecido do fármaco livre. No entanto, não foi observada a elevação da troponina soro para o grupo de tratamento de SCL-DOX, que se manteve abaixo dos níveis de corte, como com os grupos de controlo, indicando que o tratamento de ratinhos portadores de xenoenxertos com 6 doses de SCL-DOX ao longo do período de quatro semanas tinha cardiotoxicidade mínima. Para investigar se a encapsulação de DOX em SCL teve qualquer impacto sobre a gravidade da supressão da medula óssea (mielossupressão), o efeito adverso mais comum de DOX quimioterapia [27], estudamos as alterações nas células brancas do sangue periférico contar. Como mostrado na Figura 6, não houve diferença estatisticamente significativa no número total de células brancas do sangue entre a solução salina tratada ou grupos tratados com SCL-DOX. Além disso, em comparação com ratinhos tratados com DOX livre, aqueles tratados com SCL-DOX teve um 2,0 vezes e 3,3 vezes superior para contagem de linfócitos e monócitos, respectivamente. Assim, os nossos dados sugerem que SCL-DOX tem cardiotoxicidade mínima e mielossupressão significativamente reduzida.

HT-29 ratinhos portadores de xenoenxertos foram tratados como indicado na Figura 3. O sangue foi recolhido imediatamente depois os ratos foram sacrificados ao atingir o ponto final. Os dados apresentados são médias ± E.P. (N = 3~5). *,

P Art 0,05 em comparação com soro fisiológico; ***,

P Art 0,001 comparado com soro fisiológico; #,

P Art 0,05 em relação ao livre DOX; ##,

P

. 0,01 em comparação com livre DOX

Discussão

Este estudo é o primeiro a avaliar a distribuição de tecidos, in vivo actividades anticancro e perfil de toxicidade do SCL-DOX em um modelo de murganho de xenoenxerto de adenocarcinoma colo-rectal humano. Nós mostrámos vários pontos importantes: (a) SCL-DOX foi prontamente absorvidos pelas células de cancro do cólon e exibidos retenção prolongada; (B) o encapsulamento de DOX em SCL resultou numa diminuição da distribuição da droga para os locais principais de toxicidade aguda e crónica de DOX livre, ou seja, o coração e a pele, bem como marcadamente reduzido cardiotoxicidade e mielossupressão; (C) drogas lipossomal contendo sulfatide exibida uma eficácia terapêutica aumentada num modelo de rato de adenocarcinoma colo-rectal humano.

a captação intracelular de SCL em células de glioma foi demonstrado ser um resultado de captação endocítica dos lipossomas na anterior trabalhar [11]. Neste estudo, foi confirmada a captação intracelular de SCL-DOX por células de adenocarcinoma colorrectal humano, HT-29, utilizando microscopia confocal. Importante, foi demonstrado que o medicamento de quimioterapia encapsulado foi entregue intracelularmente para o local de acção, os núcleos, as células de HT-29 (Figuras 1 e 2). Além disso, o medicamento entregue lipossomal foi retido pelas células tumorais, mesmo 24 horas após a lavagem. O nosso estudo in vitro a citotoxicidade em relação a viabilidade das células de cancro colorrectal tratados com SCL-DOX e a DOX livre utilizando o ensaio de MTT e mostrou que ambas as formas possuem citotoxicidade evidente. Curiosamente, o SCL-DOX tem um IC

50 59% maior do que a DOX livre (Tabela 1). Isto é consistente com observações de outros de que a IC

50 do fármaco livre e lipossómica, quando ensaiados in vitro, varia de acordo com as linhas celulares utilizadas e a natureza dos lipossomas. Por exemplo, Wang et ai. encontrados na linha celular de cancro da próstata de rato MLLB2, o IC

50 da formulação lipossomal foi significativamente menor do que a DOX livre [30]. Num estudo de células MCF-7 /ADR resistente, a DOX lipossómica mostrou um 30 vezes mais baixa IC

50 em comparação com DOX livre [31]. No entanto, em estudos de outros livre DOX parece ter maior captação intracelular e exibe citotoxicidade mais elevada do que a de DOX lipossomal. Por exemplo, na linha celular de carcinoma hepatocelular, HepG2, livre de DOX foi indicado para possuir uma citotoxicidade mais elevada comparada com a de lipossomas camuflados DOX-carregado [24]. Além disso, o polietileno glicol (PEG) revestido-DOX lipossomal tem sido demonstrado que têm menos toxicidade do que DOX livre na linha de células de glioma, as células L-87 [10]. É importante perceber que a farmacocinética in vivo são muito diferentes entre DOX lipossomal e livre DOX. A meia-vida de DOX lipossomal pode ser de vários dias, enquanto DOX livre pode ser eliminado em alguns minutos in vivo [32], [33], [34]. Em pratos de cultura de células, as células são expostas a uma concentração constante da droga ao longo de todo o período de ensaio, e, muitas vezes levar-se livre DOX mais rapidamente do que a formulação lipossómica [35]. Além disso, as células para ensaios MTT são principalmente cultivadas em monocamadas, que têm uma organização espacial drasticamente diferente da arquitectura dos tecidos 3-dimensional in vivo [36]. Assim, a comparação do IC

50 entre uma droga livre e uma nanopartícula-formulação do fármaco in vitro fornece uma medição da citotoxicidade sob uma concentração constante durante um período de ensaio escolhida, e por isso pode não ser capaz de proporcionar uma fiável predição da eficácia terapêutica in vivo [37]. No presente estudo, embora o IC

50 de SCL-DOX foi maior do que a de livre DOX em células HT-29 in vitro, a formulação de SCL foi mostrado para exibir um efeito inibidor muito melhor do tumor através da DOX livre em HT -29 ratinhos nus portadores de tumores (Figuras 4 e 5).

tumores gastrointestinais são conhecidos por serem relativamente resistentes a agentes quimioterapêuticos. Em 80% dos tumores do cólon sem tratamento, existe um nível elevado de I (MDR I) gene multi-resistente [38]. A comparação das propriedades farmacocinéticas entre a DOX livre e SCL-DOX em ratos SD saudáveis ​​exibida a significativa diminuição da taxa de depuração de SCL-DOX em comparação com livre DOX (

p Art 0,01).