Abstract

peroxissoma β receptores activados pelo proliferador /δ (PPARβ /δ) é um receptor nuclear envolvido na regulação de lipídios e metabolismo da glicose, a cicatrização de feridas e inflamação. PPARβ /δ foi também associada com o câncer. Aqui nós investigamos a expressão de PPARβ /δ e componentes da via de biossíntese de prostaglandina in cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC). Encontramos uma expressão aumentada de PPARβ /δ, Cox-2, CPLA

2, PGES e VEGF em NSCLC humana em comparação com pulmão normal. Em linhas celulares de NSCLC PPARβ /ativação δ aumento da proliferação e sobrevivência, enquanto PPARβ /ô knock-down reduziu a viabilidade e aumento da apoptose. PPARβ /agonistas ô induzida Cox-2 e VEGF transcrição, sugerindo a existência de lacetes de alimentação para a frente que promovem a sobrevivência celular, inflamação e angiogénese. Estes efeitos foram observados apenas em alta PPARβ /ô células que expressam, enquanto as células que expressam baixos eram menos ou não afetadas. Os efeitos também foram abolidas pelo PPARβ /ô knock-down ou incubação com um antagonista /δ PPARβ. A indução de VEGF foi devido à ligação de ambos PPARβ /δ para o promotor de VEGF e activação de PI3K através de um mecanismo não-genómico. Descobrimos que PPARβ /δ interagiu com a subunidade reguladora PI3K p85α levando à ativação PI3K e fosforilação de Akt. Colectivamente, estes dados indicam que PPARβ /δ pode ser um elemento central na carcinogênese de pulmão controlar múltiplas vias e representando um alvo potencial para o tratamento de NSCLC

Citation:. Genini D, Garcia-Escudero R, Carbone GM, Catapano CV (2012) da transcrição e Non-transcricional Funções de PPARβ /δ em Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 7 (9): e46009. doi: 10.1371 /journal.pone.0046009

editor: Giuseppe Viglietto, Universidade Magna Grécia, Itália |

Recebido: 11 de maio de 2012; Aceito: 23 de agosto de 2012; Publicado: 25 Setembro 2012 |

Direitos de autor: © Genini et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este foi suportado por “Fondazione Ticinese per la ricerca sul Câncer.” os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO dE iNTERESSES:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes.

Introdução

receptores activados pelo proliferador de peroxissomo (PPARs) são receptores hormonais nucleares (SNPS) ativados por ligantes lipofílicos, incluindo os ácidos gordos de cadeia longa e prostaglandinas [1]. PPARs formar heterodímeros com o receptor de retinóide X (RXR) e se ligam a elementos específicos de promotores de genes. PPARs estão envolvidos em processos metabólicos e de desenvolvimento. PPARβ /δ tem um papel importante no metabolismo dos lípidos e da glucose e é um alvo terapêutico atractivo para distúrbios metabólicos e degenerativas [1]. PPARβ /δ também está implicada na inflamação, cicatrização de feridas, o crescimento e diferenciação celular. PPARβ /δ é sobre-expressa em cancros humanos e pode ser importante na iniciação e progressão do tumor [1]. Em apoio de uma função pró-tumorigénica, PPARβ /ligandos Ô promoveu a sobrevivência de células de cancro in vitro, [2], [3], [4] e o crescimento do tumor em ratinhos [5], [6], [7]. Por outro lado, genética knock-out de PPARβ /δ em células de cancro do cólon diminuiu o crescimento de tumores em ratos [8]. Outros dados, no entanto, usando agonistas e genética knock-out em modelos celulares e mouse contradizem esta função promover tumor [9]. Knock-out de PPARβ /δ em modelos de cancro de cólon foi relatado para promover a formação de tumor em ratos, enquanto que os agonistas reduziu a proliferação de células em crescimento in vitro e do tumor em ratos [10], [11], [12]. Vários fatores podem afetar a resposta ao ligando de activação, a sobre-expressão e knock-out de PPARβ /δ. Nós relatado anteriormente que a expressão e atividade da PPARβ /δ variou consideravelmente em linhagens de células NSCLC humanas e nível de proteína /δ PPARβ dependeu da habilidade ligantes para proteger da degradação proteossomal [13]. O nível basal do receptor e este passo regulador pós-transcrição poderia explicar, em parte, para as respostas variáveis ​​para PPARβ /agonistas ô em diferentes condições experimentais [14].

Durante a cicatrização de feridas e inflamação função /δ PPARβ é associada com a indução da ciclo-oxigenase-2 (COX-2) [1]. Cox-2 transforma o ácido araquidônico lançado pela fosfolipase A

2 (CPLA ​​

2) no PGH

2 [15]. PGH

2 é então transformado em prostaglandinas, como prostaglandina E

2 (PGE

2) e prostaglandina I

2 (PGI

2), dotado de actividades biológicas complexas. O ácido araquidónico e IGP

2 ato como PPARβ /agonistas ô [2], enquanto PGE

2 aumenta a actividade de PPARβ /δ directamente sem ligação ao receptor de [6]. Não esteróides anti-inflamatórios não esteróides (AINEs) e inibidores de Cox-2 afetam PPARβ /δ, impedindo a produção de prostaglandinas [3]. Por outro lado, o aumento da expressão de PPARβ /δ foi reportado para proteger as células cancerosas do antiproliferativa e efeitos pró-apoptóticos de AINEs e inibidores de Cox-2 [3]. COX-2 é sobre-expresso nas lesões pré-malignas e malignas, incluindo os cancros do pulmão [16], e tem um papel importante na inflamação e angiogénese de tumor associada [15]. Além disso, PPARβ /δ e Cox-2 pode ter impacto sobre a produção de factores pró-inflamatórios e pró-angiogénicos em tumores, como factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) [17], [18]. Assim, a evidência atual coloca PPARβ /δ juntamente com Cox-2 e prostaglandinas sintetases dentro de vias de sinalização que podem controlam a proliferação e sobrevivência das células cancerosas e sua interação com o microambiente do tumor.

O câncer de pulmão é a principal causa de câncer morte no mundo [19]. cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) representa cerca de 85% de todos os cânceres de pulmão. NSCLC é muitas vezes diagnosticada em fase avançada e tem um prognóstico muito pobre. Uma melhor compreensão dos elementos envolvidos na origem e progressão do NSCLC poderia conduzir a uma melhoria no tratamento e prevenção. Neste estudo nós investigamos se e como PPARβ /δ poderia contribuir para a patogênese da NSCLC. Descobrimos que PPARβ /δ era frequentemente sobre-regulada em NSCLC em relação ao pulmão normal. PPARβ /δ sobre-expressão foi geralmente associada com um aumento da expressão de CPLA

2, COX-2, PGES e VEGF. Foram examinadas as consequências da activação PPARβ /δ sobre a proliferação celular e sobrevivência e sobre a expressão de Cox-2 e VEGF em linhas celulares de NSCLC. Encontramos evidências consistentes com um papel pró-tumorigénico do PPARβ /δ em NSCLC. Além disso, verificou-se que PPARβ /agonistas ô levou à indução de VEGF também através de um mecanismo não-paralela transcricional ligada a via PI3K /Akt activação. Colectivamente, estes dados indicam que PPARβ /δ pode ser um elemento central na carcinogênese de pulmão controlar vários processos e caminhos e, assim, o que representa um alvo potencial para o desenvolvimento de novas estratégias para o tratamento do cancro do pulmão.

Materiais e Métodos

linhas celulares

pulmão humano linhas celulares de carcinoma H358, H441, H23 e A549 foram adquiridos da American Type Culture Collection (LGC Promochem, Molsheim, F) e foram mantidas em RPMI suplementado com 10% de FBS. As células foram cultivadas em meio RPMI livre de fenol vermelho suplementado com soro retirado-carvão a 5% (Hyclone, Logan, UT, EUA) antes da incubação com os ligandos de PPAR.

Chemicals

GW501516, LY294002 e ciglitazona foram adquiridos da Alexis (Lausana, Suiça). CPGI

2 foi adquirido a Biomol (Plymouth Meeting, PA). L165041 e NS398 foram obtidos a partir de Sigma (Buchs, CH). A wortmanina foi adquirido de Calbiochem (Merck Biosciences, Nottingham, Reino Unido). O antagonista PPARβ /δ GSK0660 foi fornecido pelo Dr. A. Billin (GlaxoSmithKline, EUA). Todos os compostos foram dissolvidos em DMSO.

Amostras de Pacientes

Lung amostras de cancro (carcinoma de células escamosas e adenocarcinomas, fase IA a IIIA) e as amostras de tecido pulmonar normais adjacentes eram da Medical University of South Carolina (Charleston, SC, EUA) e foram obtidos no momento da cirurgia, com o consentimento informado do paciente. As amostras de tecido foram snap-congelado e armazenado em nitrogênio líquido. Isolou-se ARN utilizando ARN STAT-60. RT-PCR foi realizada utilizando 100 ng de RNA total e 0,4 uM de iniciadores com SuperScript One-Step RT-PCR (Invitrogen). Os produtos de PCR foram analisados ​​por electroforese em gel de agarose, utilizando o AlphaImager visualizado (AlphaInnotech) e quantificada por análise densitométrica utilizando o software AlphaImager. Os resultados foram apresentados como a razão entre a intensidade da banda no tumor emparelhado e amostras normais normalizados para o gene de referência β-actina. A análise de correlação de Pearson foi realizada sobre os níveis de expressão de genes normalizados. genome-wide conjuntos de dados de transcriptoma por câncer de pulmão humano e amostras de tecido pulmonar normal de quatro estudos diferentes (PMID: 18992152, 11707590, 20421987, 18641660) foram utilizados para examinar as correlações entre genes alvo ô e putativos PPARβ /. Os valores de expressão gênica normalizados para cada transcrito foram baixados e coeficiente de correlação de Pearson eo p-valor correspondente em relação a PPARβ /δ foram calculadas para as amostras em cada conjunto de dados.

Luciferase Assay

O PPARβ /δ repórter responsivo (DRE) foi fornecido por B. Vogelstein [3]. As células foram transfectadas com DRE ou repórter de luciferase pGL3 de base, juntamente com o plasmídeo de controlo pRL-SV40 utilizando Lipofectamina. As células foram cultivadas em meio RPMI suplementado com soro retirado-carvão a 5% durante 24 h. A actividade de luciferase foi medida utilizando o kit de luciferase duplo (Promega) como descrito [20].

proliferação e viabilidade celular

As células foram plaqueadas em placas de 96 poços em meio RPMI livre de fenol vermelho suplementado com 5% de carvão-soro retirado. Após 24 h as células foram tratadas com os ligandos ou DMSO (0,1%) em soro despojado carvão a 0,1%. Número de células viáveis ​​foi determinada utilizando MTT depois de 72 horas [20]. Todos os ensaios foram realizados em triplicado e repetidas em pelo menos três experiências independentes. Para análise do ciclo celular de células foram crescidas em soro despojado carvão a 0,1% e colhida após 24 h de incubação com os ligandos ou DMSO. As células foram então coradas com iodeto de propidio e analisadas por citometria de fluxo, como descrito [20].

RNA de interferência

Para as experiências de deslocamento batida, as células foram semeadas a baixa concentração (30-50% de confluência ) e transfectadas com 10 nM de ARNsi (Ambion, Huntingdon, Reino Unido) dirigido para PPARβ /δ (siPPARβ /δ) e luciferase de pirilampo (siGL3) usando Interferin acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante (Polyplus). A transfecção de ARNip foi repetido a cada três dias por três vezes. A viabilidade celular foi determinada utilizando MTT após 72 h de crescimento em 0,1% de soro despojado carvão da última transfecção. A apoptose foi avaliada de forma semelhante depois de 72 h por anexina V-FITC e a citometria de fluxo como descrito [20].

Isolamento de ARN e RT-PCR

As células (1 x 10

6 células) foram plaqueadas em placas de 60-mm, cultivadas em soro e meio RPMI sem vermelho de fenol, durante 24 h, e, em seguida, incubadas com vários compostos durante 18 h. O ARN foi isolado utilizando Trizol (Invitrogen) e MiniKit RNeasy (Qiagen). RT-PCR foi realizada em condições não saturante, utilizando o SuperScript ™ III One-Step RT-PCR System (Invitrogen) e iniciadores específicos do gene (Tabela S1) [20]. Os produtos de PCR foram separados em geles de agarose a 2%, corados com GelRed (Biotium, Basileia, CH) e quantificada utilizando o AlphaImager como descrito acima.

imunotransferência

As células foram lisadas, como descrito [13] . Os lisados ​​foram centrifugados a 14000 × g durante 10 minutos para remover qualquer concentração de detritos e de proteína foi determinada. As proteínas foram carregadas em géis de poliacrilamida a 10-12% e analisados ​​por imunotransf erência. Procaspase-3 (302), anticorpos PDK1, PTEN, Akt, fosfo-Akt e (Ser 473) foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Cox-2 (P-29) e PPARβ /δ (H-74) anticorpos foram obtidos de Santa Cruz (Heidelberg, Alemanha). anticorpo tubulina (Ab-1) foi adquirido de Oncogene (Merk Biosciences, Nottingham, Reino Unido).

Cromatina imunoprecipitação (CHIP)

As células foram cultivadas até à confluência em 75 cm

2 frascos, em jejum, e incubadas com GW501516 ou veículo durante 18 h. Chip foi realizada como descrito [21] com o anti-anticorpo PPARβ 4 ug /δ ou anti-IgG como controlo negativo. O PCR foi realizado com os iniciadores abrangendo as regiões de -527 a -298 e -1338 a -1123 a partir do promotor de VEGF na presença de betaína e utilizando DMSO AmpliTaq Gold (Applied Biosystem, Foster City, CA). A análise densitométrica foi realizada utilizando o software AlphaImager.

marcada com His PPARβ /δ suspensos e Immunoprecipitation

A His-PPARβ vector /expressão δ foi descrito anteriormente [13]. O terminal N e C marcada com His construções truncadas de PPARβ /δ foram gerados por mutagénese dirigida ao local. As células foram transfectadas com Lipofectamina, crescido até à confluência e foram incubadas com e sem PPARβ /ligandos Ô. As células foram lisadas em tampão RIPA, durante 30 minutos em gelo e sujeita a puxar para baixo, com His-Select gel de afinidade de níquel (Sigma). As proteínas foram eluídas com tampão de Laemmli. alíquotas equivalentes de lisados, por escoamento e eluatos foram carregadas em geles e analisados ​​por imunotransf erência. Imunoprecipitação (IP) foi realizada utilizando soro anti-p85α (um dom de M. Thelen, IRB, Bellinzona, CH) e A /G sepharose contas (Thermo Científicas). His-PPARβ /δ foi detectado com um seu anticorpo anti-(Sigma).

Resultados

A expressão de PPARβ /δ em células não pequenas do pulmão Cancer

Foram avaliadas o nível de PPARβ /δ juntamente com PPARy, CPLA

2, Cox-2, PGES e IGP em linhas celulares de NSCLC. A expressão destes genes variaram consideravelmente entre as linhas celulares (Fig. 1a). células H441 tinham altos níveis de PPARβ /δ, Cox-2, CPLA

2, PGES e PPARy. células H358 e H23 tinha níveis intermediários de PPARβ /δ e baixa expressão /moderado de Cox-2, PGES, CPLA

2 e PPARy. Interessantemente, as células A549, os quais têm sido utilizados em vários estudos para testar os efeitos de PPARβ /agonistas ô, teve o menor nível de PPARβ /δ e PGES, enquanto teve relativamente elevada expressão de PPARy e Cox-2. A diferença de nível /δ PPARβ entre H441 e células A549 foi confirmada utilizando um repórter sensível PPARβ /δ selectiva de luciferase [3] (Fig. 1B) e era consistente com os dados anteriores de nosso grupo no nível de proteína e da resposta ao ligando de activação no duas linhas de células [13]. Curiosamente, a maioria das linhas celulares de NSCLC não expressaram IGP, com a excepção de as células H23 em que foi detectado um nível baixo de mRNA de IGP. Isto sugeriu que o IGP

2 é improvável que seja produzido endogenamente na maioria das células NSCLC.

(A) RNA isolado a partir das linhas celulares indicadas foi amplificado por RT-PCR para avaliar o nível de PPARβ /δ, PPAR, CPLA

2, Cox-2, IGP e PGES RNA. GAPDH foi usada como um gene de referência. As células H441 e A549 (B) foram transfectadas com um repórter PPARβ /δ luciferase responsivo (DRE) ou repórter de luciferase pGL3 básica (básica). A actividade da luciferase foi avaliada após 24 h. * P 0,01. (C) ARN isolado a partir de tumores do pulmão e no tecido pulmonar normal adjacente foi analisado por RT-PCR com iniciadores específicos para PPARβ /δ e β-actina.

Em seguida, examinámos a expressão dos mesmos genes em amostras normais e de tecidos pulmonares de tumor de doentes com NSCLC (Figura S1). , Encontramos um aumento PPARβ /δ ARNm em muitos tumores, em comparação com as amostras pulmonares normais emparelhadas (Fig. 1C). Para comparar o padrão de expressão em todo o conjunto de amostras, o nível de ARNm de cada gene foi determinada por análise densitométrica, normalizado para p-actina e apresentados como uma relação entre o nível de cada par de tumor /amostras emparelhadas normais (Fig. 2). PPARβ /δ ARNm foi acentuadamente regulada para cima (razão T /N ≥4) em cerca de 50% dos tumores. Isto está de acordo com relatos anteriores de expressão sobre-deste NHR em muitos cancros humanos, incluindo NSCLC [1], [22]. Cox-2, CPLA

2 e PGE foram também regulados positivamente na maioria das amostras de tumor (Fig. 2). A regulação destes genes foi particularmente evidente em tumores com PPARβ /δ sobre-expressão. Notavelmente, IGP foi detectada em pulmões normais e alterados apenas ligeiramente em uma pequena fracção dos casos. PPARy foi moderadamente aumentado em alguns tumores, mas mais frequentemente regulada para baixo, consistente com o papel de supressor de tumor putativo atribuída a este NHR. VEGF, que é um alvo putativo de PPARβ /δ e Cox-2, foi também sobre-regulada em muitos tumores com PPARβ /δ sobre-expressão (Fig.). Notavelmente, o nível de PPARβ /δ significativamente correlacionada com a expressão de Cox-2 (Pearson coeff 0,76;. P-valor, 2.91E-05), CPLA

2 (Pearson coeff 0,69;. P-valor 2.72E- 04) e VEGF (Pearson coeff 0,54;. valor de p 0,018). Para fornecer um apoio adicional para a ligação entre PPARβ /δ, VEGF e Cox-2 foi examinada a nível destes genes em conjuntos de dados de expressão de genes disponíveis ao público a partir de amostras de tecido de câncer de pulmão normal e. Foram encontradas correlações significativas de PPARβ /δ com VEGF e Cox-2 expressão de mRNA em vários conjuntos de dados (Tabela S2). Tomados em conjunto, estes dados indicam frequente e concomitante aumento da regulação do PPARβ /δ, VEGF e componentes da via de síntese de Cox-2 /prostaglandina num subconjunto do NSCLC e proporcionar suporte para a hipótese de que a activação destas vias pode desempenhar um papel na carcinogénese pulmão.

O ARN foi extraído a partir de tumores e no tecido pulmonar normal adjacente a partir de pacientes com cancro do pulmão de células não pequenas e examinado por RT-PCR. Os dados representam a relação entre a expressão do gene em tumores relativamente a tecido normal emparelhado com base na análise densitométrica e normalizado para p-actina utilizada como gene de referência. barras pretas marcar os tumores com maior expressão de PPARβ /δ (T /N rácio ≥4).

PPARβ /δ promove a proliferação e sobrevivência de não-pequenas células do cancro do pulmão células

expressão desregulada de PPARβ /δ podem favorecer a proliferação e sobrevivência de células cancerosas. No entanto, os estudos feitos em modelos diferentes de células, incluindo linhas celulares de cancro do pulmão não forneceu resultados consistentes [9], [23]. Os dados descritos acima sugerem que o contexto em que alguns estudos foram feitos era bastante heterogéneo e pode afectar as diversas respostas celulares à activação PPARβ /δ. Descobrimos que os agonistas PPARβ /ô aumento da proliferação e promovendo a sobrevivência de células NSCLC. Ativação de PPARβ /δ por CPGI

2 em meio de aumento da viabilidade celular de baixo soro e proliferação (Fig. 3A). Efeitos similares foram observados com outro agonista PPARβ /δ, L165041 (Fig. 3B). Consistentemente, análise do ciclo celular mostraram um aumento de células em fase S após o tratamento com CPGI

2 em meio de soro baixo, enquanto as células em fase G1 diminuiu (Fig. 3C). Notavelmente, todos estes efeitos eram evidentes em células com elevada expressão de PPARβ /δ (por exemplo, H441 e H358), enquanto que não houve ou efeito mínimo sobre o crescimento e o ciclo celular em células A549 com baixo nível do receptor (Fig. 3a- C). Estes efeitos pró-crescimento e sobrevivência foram específicos para PPARβ /agonistas ô como a incubação com o agonista de PPARy ciglitazona inibiu o crescimento celular (Figura S2). Além disso, a expressão elevada de PPARβ /δ foi associada com sensibilidade reduzida aos AINEs e inibidores de COX-2, como o sulfureto de sulindac, sulindac sulfona e NS398, em células H441 em comparação com células A549 com baixa expressão /δ PPARβ (Figura S2). Em apoio de uma função pró-sobrevivência, knock-down de PPARβ /ô usando pequeno RNA de interferência (siRNA) afetou a viabilidade celular (Fig. 3D). PPARβ /ô knock-down aumentou também o número de células apoptóticas anexina V positiva (Fig. 3E) e induziu activação de caspase-3, um marcador conhecido de morte celular por apoptose (Fig. 3F). Tomados em conjunto, estes dados indicam que a activação de PPARβ /δ promove a sobrevivência e proliferação de células NSCLC que expressam níveis elevados do receptor.

H441, H358 e células A549 (A) foram incubadas com CPGI

2 na viabilidade médio e celular livre de soro foi avaliada após 72 horas com MTT. * P 0,01 em relação às células de controlo. (B) As células foram incubadas com L165041 como acima. * P 0,01 em relação às células de controlo. (C) As células foram incubadas com CPGI

2 (10 uM) durante 24 h e analisadas por citometria de fluxo.

Painel superior

, perfil de citometria de fluxo representativos de células H358 incubadas com e sem CPGI

2.

Painel

Bottom, a distribuição do ciclo celular em células após 24 horas de incubação com e sem CPGI

2. O aumento das células em fase S em células H441 e H358 determinada em experiências em triplicado foi estatisticamente significativa (P 0,01). (D) As células H441 foram transfectadas com ARNsi para PPARβ /δ e GL3 e a viabilidade celular foi determinada após 72 h com MTT. * P 0,01 em relação às células de controlo. As células H358 (E) transfectadas com PPARβ /δ siRNA e GL3 foram coradas com anexina V e iodeto de propidio e analisadas por citometria de fluxo. A percentagem de células positivas para anexina V (células apoptóticas) é indicado em cada painel. P 0,05. As células H358 (F) foram transfectadas com ARNsi para PPARβ /δ e GL3, lisadas e analisadas por imunotransf erência com um anticorpo da caspase-3. * P . 0,01

PPARβ /δ Activation Induz Cox-2 e VEGF Expressão

Cox-2 e PPARβ /δ pode funcionalmente interagir e reciprocamente regular uns dos outros. A sobre-regulação concomitante de PPARβ /δ e componentes da /via de síntese de prostaglandina de Cox-2 em tecidos e linhas celulares de NSCLC suportado adicionalmente esta ligação e nos induzida para testar se PPARβ /δ poderia afectar de Cox-2 em células NSCLC expressão. Observou-se um aumento de ARNm de Cox-2 por tratamento de células NSCLC com o ligando /δ PPARβ GW501516 (Fig. 4A). Notavelmente, ARNm de Cox-2 não aumentou em células A549, sugerindo que o efeito dependia do nível endógeno de PPARβ /δ. GW501516 induziu também a transcrição do gene da proteína relacionada com a diferenciação adiposo (ADRP), que é um alvo conhecido de PPARβ /δ, em H358 e H441 células e apenas para uma menor extensão nas células A549 (Fig. 4A). Pelo contrário, PDK, um gene alvo PPARβ /δ relatado em outros estudos [24], não foi afectada (Fig. 4A). Uma análise tempo-curso mostraram que as alterações no nível de Cox-2 e ARNm ADRP foram evidentes dentro de 4-8 h desde a adição do ligando e aumentou de novo às 24 h (Fig. 4B).

(A ) H358, H441 e as células A549 foram cultivadas até à confluência, após jejum de 24 h e, em seguida, tratada com GW501516 (5 uM) durante 18 h. O ARN total foi isolado e analisado por RT-PCR. (B) H358 células foram incubadas com GW501516 para os tempos indicados antes da extracção de ARN e análise.

PPARβ /δ e COX-2 poderia constituir um circuito regulador de feed-forward sustentar a sobrevivência e proliferação das células. Além disso, PPARβ /δ foi identificado como um componente chave do interruptor angiogénico durante a progressão tumoral [25] e VEGF, que é o principal mediador de angiogénese, foi identificado como um alvo de PPARβ /δ [18]. Análise da expressão de VEGF em NSCLC e amostras de pulmão normal mostraram aumento da expressão de VEGF e de alta correlação com PPARβ /δ em cancros do pulmão (Fig. 2 e Tabela S2), consistente com a ideia de que PPARβ /δ poderia regular a expressão de VEGF. Para testar o efeito de PPARβ /δ na expressão de VEGF, que trataram células NSCLC com GW501516. VEGF ARNm aumentou em H358 e H441 células incubadas com GW501516, enquanto não se alterou em células A549 (Fig. 4a). Como pode ser visto para a COX-2 e ADRP, VEGF mRNA aumentada dentro de 4-8 h e aumentou de novo após 24 h (Fig. 4B). Para nossa surpresa, a expressão do receptores VEGF VEGFR1 e VEGFR2 foi reduzida após tratamento com GW501516 (Fig. 4A-B).

PPARβ /δ está directamente envolvida na regulação do VEGF Transcrição

Indução da expressão de VEGF por PPARβ /δ poderia representar uma função importante do receptor. Para fornecer provas do envolvimento de PPARβ /δ na indução de VEGF batemos-lo para baixo, usando RNA de interferência. A eficiência do knock-down mediada por siARN foi confirmada por RT-PCR (Fig. 5A). PPARβ /ô knock-down reduziu o nível basal de mARN de VEGF e a capacidade de induzir a GW501516 ARNm de VEGF em comparação com células de controlo transf ectadas (Fig. 5a). O efeito de depleção PPARβ /δ foi mais evidente do que no H358 H441 células, provavelmente por causa do nível inicial inferior do receptor. Resultados semelhantes foram obtidos com a direta PPARβ /δ ADRP alvo. ADRP expressão basal e a resposta a GW501516 foi menor em PPARβ /células δ empobrecido em comparação com células de controlo transf ectadas (Fig. 5a). Curiosamente, knock-down de PPARβ /ô ligeiramente reduzido o nível basal de VEGFR1 e VEGFR2 e aumentado, em vez de antagonizar o efeito de GW501516 (Fig. 5A). Assim, o esgotamento dos PPARβ /δ teve efeitos opostos sobre VEGF e VEGFR, consistentes com a noção de que PPARs pode afetar a expressão gênica por mecanismos distintos [26].

células H358 e H441 (A) foram transfectadas com PPARβ /δ ARNsi de controlo e GL3 e, em seguida, tratada com GW501516 (5 uM) durante 18 h. níveis de genes foi determinada por RT-PCR. (B) As células foram incubadas durante 2 h com GSK0660 (10 uM) e, em seguida, com GW501516 (5 uM) durante 18 horas antes de análise por RT-PCR. (C) H358 células foram tratadas com GW501516 durante 18 h e processadas para imunoprecipitação de cromatina utilizando anticorpos anti-IgG anti-PPARβ /Í e. A região do promotor de VEGF contendo um PPRE (-527 /-298) e uma região não-alvo (-1338 /-1123) foram amplificados por PCR. O PPRE contendo a região do promotor ADRP foi amplificado como controlo positivo.

Painel superior

, varredura gel representativo.

Painel

Bottom, quantificação densitométrica de três experimentos independentes em células H441. * P . 0,01

Além de siRNA mediada por knock-down, testamos a PPARβ antagonista /δ GSK0660 [27]. As células foram incubadas durante 2 h com GSK0660 (10 uM) antes do tratamento com GW501516. Esta dose de GSK0660 não afetou a viabilidade celular mas a atividade /δ efetivamente inibiu PPARβ. GSK0660 tiveram efeitos limitados sobre o nível basal de mARN de VEGF, mas bloqueou a indução de VEGF por GW501516 (Fig. 5A). GSK0660 teve um efeito semelhante no ARNm ADRP tanto em condições basais e após a activação do ligando. GSK0660 reduzida também o nível de VEGFR1 e VEGFR2 ARNm em comparação com células de controlo, tanto em condições basais e na presença de GW501516 (Fig. 5B). Assim, tanto siRNA mediada knock-down e o antagonista /δ PPARβ bloqueada transcrição VEGF, consistente com a hipótese de que PPARβ /δ estava diretamente envolvido no processo e agiu como um activador da transcrição.

Para determinar se PPARβ /δ regulada a expressão de VEGF por ligação directa com o promotor VEGF, foi realizada imunoprecipi tacão cromatina e avaliada a ligação do PPARβ /δ a uma região do promotor de VEGF (-527 /-298) contendo um PPRE [28]. Uma região a montante do promotor de VEGF (-1338 /-1123) falta PPREs foi usado como controlo negativo. Após a activação pelo ligando, ligação de PPARβ /δ foi detectado para o PPRE contendo o sítio enquanto nenhuma ligação foi detectada na região distai (Fig. 5C). A análise densitométrica dos resultados confirmaram a ligação de PPARβ /δ para o promotor de VEGF sobre a activação pelo ligando, enquanto que não havia ligação na ausência de ligando e em amostras de controlo de IgG (Fig. 5C). Além disso, a extensão da PPARβ /ô ligação ao promotor de VEGF foi comparável à que a ADRP promotor, uma conhecida de alvo PPARβ /δ (Fig. 5C).

A activação de PI3K está envolvido na indução de VEGF por PPARβ /δ

Nós exploramos se as vias adicionais que têm sido associados a PPARβ /δ poderia contribuir para a regulação do VEGF em resposta a PPARβ /agonistas ô. A via PI3K /Akt é activada em muitos tipos de cancro e está implicada na angiogénese tumoral [29]. ILK e PDK, duas cinases alvo a jusante de Akt, foram mostrados para ser regulamentado por PPARβ /δ [24] e ativação de PPARβ /δ aumentou fosforilada Akt (pAkt) em células endoteliais progenitoras [30] e células NSCLC [31]. Portanto, nós examinamos se a via PI3K /Akt estava envolvido na indução de VEGF por PPARβ /agonistas ô em células NSCLC. As células foram pré-tratadas durante 2 h com o inibidor de PI3K LY294002 seguido por GW501516. Pré-incubação com LY294002, em doses conhecidas para inibir phopshorylation Akt reduziu a expressão de VEGF e impediu a indução de VEGF em resposta a o /ligando δ PPARβ (Fig. 6A). LY294002 teve um efeito semelhante sobre ADRP. No entanto, o inibidor de PI3K não bloquear a sub-regulação de VEGFR1 e VEGFR2 induzida por GW501516. A wortmanina, um outro potente inibidor de PI3K, tiveram efeitos semelhantes na VEGF, VEGFR e ADRP (Fig. 6A).

(A) H358 células foram cultivadas até à confluência, após jejum de 24 horas e, em seguida, incubadas durante 2 horas com o LY294002 (25 uM) ou wortmanina (200 nM) seguido de GW501516 (5 uM) durante 18 h. O ARN foi extraído e analisado por RT-PCR. (B) As células H358 e H441 foram incubadas com e sem GW501516 durante o tempo indicado. Os lisados ​​celulares foram analisados ​​por imunotransferência com anticorpos para Akt fosforilada total e, PTEN e p85α. (C) As células H358 foram transfectada com His-PPARβ /δ ou vector vazio pcDNA3.1 e incubadas com e sem GW501516 durante 18 h. As células foram lisadas em tampão RIPA e His-PPARβ /δ foi puxado para baixo com o seu select-gel de níquel de afinidade. As imunotransferências foram reveladas com anticorpos para PPARβ /δ e p85α. (D) H358 células foram transfectadas com pcDNA3.1, comprimento completo His-PPARβ /δ (PPARβ /δ 1-441), ou truncada PPARβ /ô reter a parte N-terminal (PPARβ /δ 1-168) e C- parte terminal (PPARβ /δ 168-441), lisadas em tampão RIPA e sujeitas a imunoprecipitação com o anticorpo anti-p85α. Imunotransfer�cias de lisados ​​de células inteiras e imunoprecipitados (

painel do meio e inferior

, respectivamente) foram realizados com anticorpos dirigidos para p85α, tubulina e His-tag. As setas indicam comprimento completo e truncado PPARβ /ô detectado em imunoblots de lisados ​​de células inteiras e os imunoprecipitados.

Painel superior

, representação esquemática de PPARβ estrutura /δ e organização de domínio.

Em conjunto, estes dados indicam que PI3K contribuiu para PPARβ /indução δ mediada por VEGF. A fosfatase e tensina homólogo suprimida no cromossoma 10 (PTEN) é um regulador principal da actividade de PI3K [29]. A modulação da via PI3K /Akt, em resposta à activação de PPAR tem sido atribuído a alterações no nível de PTEN. agonistas PPARy aumento PTEN com consequente inibição da PI3K [32]. Por outro lado, a activação de PPARβ /ô PTEN reduzida levando ao aumento de pAkt [22], [31]. No entanto, quando tratada H441 e H358 células com GW501516 não observamos nenhuma mudança consistente no PTEN nível (Fig. 6B). Além disso, descobrimos que GW501516 induzida pAkt no momento muito cedo. Aumento de pAkt foi observada dentro de 1-2 h de tratamento e foi mantida durante pelo menos 4 horas (Fig. 6B). Akt total, PTEN e p85α eram não ou minimamente afectada no momento, o que sugere que as alterações no nível destas proteínas eram pouco provável para explicar a indução de pAkt pelo agonista PPARβ /δ.

Vários estudos têm mostrado PI3K que pode ser activada por interacção física do p85α subunidade reguladora de PI3K com NHRS.