Abstract

A mucina MUC4 e seu parceiro de membrana do receptor oncogénico ErbB2 humano são o potencial de interação parceiros no desenvolvimento do tumor pancreático humano. No entanto, a forma como eles funcionam ainda é em grande parte desconhecido. Neste trabalho, buscou-se identificar os mecanismos celulares e as vias de sinalização intracelular sob o controle de ambos ErbB2 e MUC4 numa linha celular adenocarcinomatous pancreático humano. Usando co-imunoprecipitação e GST pull-down, mostramos que MUC4 e ErbB2 interagem na linha de células adenocarcinomatous pancreático humano CAPAN-2

via

os domínios EGF de MUC4. clones celulares estáveis ​​foram gerados em que quer MUC4 ou ErbB2 foram derrubados (KD) por uma abordagem shRNA. propriedades biológicas dessas células foram então estudadas

in vitro

e

in vivo

. Nossos resultados mostram que as células ErbB2-KD são mais apoptótica e menos proliferativa (diminuição da ciclina D1 e aumento da expressão p27kip1) enquanto as propriedades de migração e invasivos não foram alterados. clones MUC4-KD foram menos proliferativa com a diminuição da expressão da ciclina D1, parada do ciclo celular G1 e expressão alterada ErbB2 /ErbB3. Suas propriedades de migração foram reduzidos enquanto as propriedades invasivas foram aumentadas. Importante, a inibição da expressão de ErbB2 e MUC4 não prejudicou as mesmas vias de sinalização (inibição da expressão MUC4 afectada a via JNK Considerando que de ErbB2 alterou a via MAPK). Finalmente, as células ErbB2-KD e MUC4-KD mostrou o crescimento do tumor prejudicada

in vivo

. Nossos resultados mostram que ErbB2 e MUC4, que interagem fisicamente, ativam diferentes vias de sinalização intracelular para regular as propriedades biológicas da CAPAN-2 pancreáticas células cancerosas

Citation:. Jonckheere N, N Skrypek, Merlin J, Dessein AF, Dumont P, Leteurtre E, et al. (2012) A mucina MUC4 e sua membrana Parceiro ErbB2 Regular propriedades biológicas de células de câncer pancreático humano CAPAN-2

via

diferentes vias de sinalização. PLoS ONE 7 (2): e32232. doi: 10.1371 /journal.pone.0032232

editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, China

Recebido: 12 Agosto, 2011; Aceito: 24 de janeiro de 2012; Publicado: 29 de fevereiro 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Jonckheere et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Dr. Nicolas Jonckheere é um receptor de uma bolsa de pós-doutorado pelo Institut National Cancer du (Inca) e Ligue Nationale contre le Câncer (LNCC). Nicolas Skrypek é beneficiário de uma bolsa de doutoramento do Centro Hospitalar Regional Universitário (CHRU) de Lille /região Nord-Pas de Calais. Dr Frédéric Frenois é um receptor de uma bolsa de pós-doutorado da Fondation pour la Recherche Médicale (FRM). Johann Merlin é o destinatário de uma bolsa de doutoramento da Université de Lille 2 e Région Nord-Pas de Calais. Este trabalho é apoiado por uma bolsa da la Ligue Nationale contre le Cancer (Equipe Labellisée Ligue 2010, IVS). Isabelle Van Seuningen é o destinatário de uma “Contrat Hospitalier de Recherche Translationnelle” /chrt 2010, AVIESAN. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Pancreatic ductal Adenocarcinoma (PDAC) é a quarta principal causa de morte por câncer no mundo. A curva de sobrevivência é extremamente curto (6 meses) ea taxa de sobrevivência em 5 anos é muito baixa (3%). Este resultado dramático está relacionada à falta de instrumentos terapêuticos e marcadores de diagnóstico precoce que faz com que o câncer de pâncreas o cancro mais mortal. No momento do diagnóstico, mais do que 80% de PDAC são já metastático ou localmente avançado e apenas cerca de 10 a 15% dos pacientes elegíveis são considerados para a ressecção cirúrgica. carcinogênese pancreática segue uma progressão metaplasia /displasia /câncer com PDAC desenvolver a partir de precursores de lesão ductal chamados pâncreas neoplasia intra-epitelial (PanIN-1A /1B /-2 /-3) em que histológico, citológicos e alterações genéticas acumular [1], [2 ]. Identificação de novos alvos moleculares, especialmente aqueles com expressão alterada no início de PanIN e decifrar os mecanismos moleculares subjacentes à doença, sem dúvida, permitir o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para parar /retardar a progressão do tumor.

Neste contexto , a ligada à membrana mucina MUC4, que é expressa como cedo como em PanIN-1A ao passo que não é expresso no pâncreas saudável, e o seu parceiro de membrana a ErbB2 receptor oncogénica, que é frequentemente sobre-expressa em cancro do pâncreas, bem como em PanINs, representam alvos terapêuticos promissores [3], [4], [5], [6].

O gene codifica uma grande MUC4 apomucin (930 kDa) composta por duas subunidades MUC4α MUC4β e [7], [8] [9], [10]. MUC4α é a subunidade extracelular caracteriza uma região típica hiperglicosilado. MUC4β é a subunidade transmembranar contendo três domínios semelhantes a EGF (EGF3, EGF1 e EGF2 localizados a partir de C-terminal para N-terminal) que são conservados em humanos e roedores [4], [11]. A evidência experimental com homólogos de rato de MUC4 e ErbB2 sugere que os domínios semelhantes a EGF desempenhar um papel em interacções receptor-ligando e é um regulador na sinalização relacionada com o crescimento, motilidade ou diferenciação da célula [4], [12]. A partir destes dados, Carraway e colaboradores propuseram MUC4 como um modulador do equilíbrio proliferação /diferenciação [13], mas neste momento, tal mecanismo proposto não foi validado para MUC4 humano.

O oncogene neu codifica ErbB2 /tipo de HER2 I transmembranar do receptor do factor de crescimento que pertence ao receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR /ErbB1) compreendendo família ErbB3 e ErbB4. A proteína ErbB2 consiste num domínio extracelular, um domínio transmembranar e um domínio intracelular tirosina-quinase. ErbB2 tem nenhum ligando conhecido e é descrito como um co-receptor que hetero-dimeriza com os outros receptores ErbB [14]. ErbB2 é comumente overexpressed em cancros, incluindo PDAC, onde ErbB2 é frequentemente amplificados.

Estudos em células humanas continuam a ser escassos e sugerir até agora um possível papel para MUC4 nas propriedades biológicas de células pancreáticas cancerosas [15], [ ,,,0],16]. No que diz respeito a ErbB2, apenas um estudo recente em outro modelo de células de cancro pancreático mostrou que a ErbB2 pode ser envolvido nas propriedades de células de cancro pancreático [17]. Os trabalhos anteriores cólon e células pulmonares mostrou que MUC4 e ErbB2 pode actuar como um complexo funcional e transduzir sinais intracelularmente [18], [19]. No entanto, não fica claro se MUC4 e ErbB2 ativar a mesma via (s) de sinalização.

No presente trabalho, nós comprometeu-se a identificar as vias de sinalização intracelular sob o controle de qualquer ErbB2 ou MUC4 no mesmo modelo celular de câncer pancreático para testar esta hipótese. Mostramos que MUC4 e ErbB2 humana que interagem fisicamente em células de cancro do pâncreas e que a inibição da expressão de cada um dos parceiros de membrana não prejudiquem as mesmas vias de sinalização (inibição da expressão MUC4 afecta a via JNK Considerando que de ErbB2 altera a via MAPK). Foram observados efeitos diferentes sobre as propriedades biológicas de células de cancro do pâncreas, sugerindo actividades independentes destas duas proteínas com um papel no crescimento do tumor do pâncreas para ErbB2, enquanto MUC4 parece estar envolvido, quer no crescimento e disseminação tumoral.

Materiais e Métodos

estabelecimento de ErbB2 e MUC4 KD linhas celulares

A linha de células de câncer pancreático CAPAN-2 (ATCC, HTB-80) foi cultivada como descrito anteriormente [20]. células ErbB2-KD foram obtidos após a transfecção estável de células CAPAN-2 com pGeneClip ™ puromicina vector que codifica ErbB2 shRNA (SA Biosciences ™). Transfecção estável de 1 ug de plasmídeo digerido Scal foi realizada com Effectene® (Qiagen, Courtaboeuf, França) seguindo o protocolo do fabricante. O vector vazio foi usado para elevar clones de controle de chamadas não Targeting (NT). A selecção foi realizada utilizando puromycine (0,1 ug /ml, Invivogen, Limoges, França) e os clones foram isolados por diluição em série limitada. -MUC4 Nocauteado células (Kd) foram obtidos por infecção retroviral de células CAPAN-2 com o plasmídeo pRetroSuper (SA Biosciences ™) contendo uma sequência de direccionamento MUC4 (5′-AAGTGGAACGAATCGATTCTGTTCAAGAGACAGAATCGATTCGTTCCACTT-3 ‘). O vector vazio foi usado para elevar clones controle chamado

Mock

. A seleção foi realizada utilizando G418 /geneticine (300 ug /ml, Invitrogen, Cergy Pontoise, França) e clones foram isolados por diluição limite serial.

Western blot

citossólicos, extractos celulares nucleares e totais foram preparados como descrito em Van Seuningen

et ai.

[21] e Jonckheere

et ai.

[22], respectivamente e mantidos a -80 ° C até à sua utilização. O teor de proteína (2 ul de extractos nucleares) foi medida em placas de 96 poços utilizando o método do ácido bicinconínico como descrito no manual de instruções do fabricante (Pierce). Western blotting foi realizado sobre uma membrana de nitrocelulose (0,2 mm, Schleicher e Schuell), como descrito anteriormente [23]. As membranas foram sondadas com anticorpos contra erbB-2 (clone Ab-1, diluição de 1/500), p27kip1 (diluição 1/500) do Laboratório de Visão Neomarker, EUA; fosfo-p42 /44MAPK (Thr202 /Tyr204) (clone 20G11, diluição de 1/500), p42 /44MAPK (I37F5 clone, diluição de 1/500), fosfo-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185) (# 9251, diluição de 1 /500), SAPK /JNK (56G8 clone, 1/500), fosfo-p38MAPK (Thr180 /Tyr182) (D3F9 clone, 1/1000), p38MAPK (# 9212, diluição 1/1000), FAK (# 3285, diluição 1 /1000), fosfo-Akt (Ser473) (D9E clone, 1/1000), Akt (clone C67E7, diluição 1/1000), ciclina D1 (clone DCS6, diluição de 1/500), EGFR (# 2232, diluição de 1 /500), tudo a partir de Cell Signaling Technology, EUA; ErbB-3 (clone de C-17, 1/500), ErbB-4 (clone de C-18, diluição de 1/500), MMP2 (clone H-76, diluição de 1/500), MMP9 (clone 6-6b, diluição 1/500), Bcl-xL (clone H-5, diluição de 1/500), Bax (clone N-20, diluição de 1/500), MUC4 (8G7, diluição de 1/500) todos os produtos da Santa Cruz Biotechnology, EUA; MUC1 (M8, generosa oferta do Dr. D. Swallow, Londres), ou β-actina (A5441, a diluição 1/5000) da Sigma, França. Os anticorpos foram diluídos em tampão Tris-tamponada salina contendo 5% (w /v) de leite seco não gordo e Tween-20 (TBS-T), excepto para MUC4 e β-actina e incubadas durante a noite a 4 ° C antes do processamento com a imunocoloração. Os anticorpos secundários conjugados com peroxidase (Sigma) foram utilizados e as bandas imunorreactivas foram visualizadas utilizando o substrato quimioluminescente West Pico (Perbio, Brebières, França). Quimio-luminescência foi visualizada usando LAS4000 aparelho (Fujifilm) e os resultados foram integrados utilizando Gel Software® analista (Claravision). Os dados apresentados são representativos de três experiências independentes.

Co-imunoprecipitação do complexo MUC4-ErbB2

150 ug de CAPAN-2 extracto celular foram incubadas durante a noite com 1,5 ug de anticorpo anti-ErbB2 (coelho policlonal, Ab-1, Thermo Scientific). Proteína A foi ligado covalentemente a reticuladas grânulos de 4% de agarose (Sigma, França), equilibrada com 1 × tampão de ligação (Tris-HCl 200 mM pH 7,5 contendo NaCl 1 M, EDTA 20 mM e 2% de NP40 (v /v)) e adicionado à mistura lisado-anticorpo e incubadas numa plataforma rotativa durante 2 horas a 4 ° C. As pérolas foram então lavadas três vezes com 1 × tampão de ligação. IgGs de coelho (Millipore) foram usadas como um controlo negativo. esferas lavadas foram então misturadas com 2 × tampão de carga de SDS em gel antes da electroforese em 2% (w /v) em gel de agarose e imunotransferência como descrito anteriormente [23].

A construção da GST-MUC4

EGF3 + 1 + 2 proteína de fusão

o cDNA que codifica a MUC4

EGF3 + 1 + 2 sequência foi amplificado por PCR usando uma versão epitopo marcado com FLAG da subunidade MUC4β [16] chamado MUC4F2-CF2 como o molde e F_EGF3 (5′-CGCGGATCCGCCTGTGAGGAGCCG-3 ‘) e R_EGF1 (5′-TCCCCCGGG TCAGAAGCAGCGGCTGTC-3’) como iniciadores. O produto da PCR que codifica MUC4

EGF3 + 1 + 2 foi digerido pela

BamHI

e

SmaI

e inserido em pGEX-4T1 (GE Lifesciences). O pGEX-4T1-GST-MUC4

EGF3 + 1 + 2 construção foi então transfectado em B834pLysS

E. coli

(Novagen), utilizando eletroporação e

E. coli

foi cultivada em meio de Luria Bertani (Invitrogen) para um OD

600 de 0,8. GST-MUC4 expressão da proteína

EGF3 fusão + 1 + 2 foi então induzida por adição de 1 mM de isopropylthiogalactopyranosyl (Ambion), a 15 ° C durante a noite. As células foram colhidas por centrifugação a 3800 x g a 4 ° C, ressuspenso em 60 ml de tampão de lise (1 × PBS, 1 mM de DTT, 1 mM de EDTA, 1% (v /v) de Triton X /100) e lisadas por sonicação (sonicador Branson 250). Após centrifugação (20 000 x g, 90 min, 4 ° C), o sobrenadante foi recuperado, e GST-MUC4

EGF3 + 1 + 2 foi separada a partir do lisado de células inteiras usando esferas de glutationa-agarose (Qiagen). Após os grânulos de lavagem com tampão de lise, GST-MUC4

EGF3 + 1 + 2 da proteína de fusão foi eluída por 40 mM de glutationa reduzida em tampão de Tris-HCl 50 mM pH 8,0 contendo NaCl 150 mM, 0,1% (v /v) Triton X /100 e 1 mM de DTT. A pureza da proteína foi determinada por coloração com azul de Coomassie após 12% de SDS-PAGE. A proteína purificada foi dialisada contra 1 x tampão de ligação e armazenado a 4 ° C até à sua utilização.

GST pull-down

O GST-MUC4

EGF3 + 1 + 2 foi carregado sobre esferas equilibradas glutationa (Qiagen), como descrito pelo fabricante. Após a ligação durante a noite a 4 ° C, na presença da proteína ErbB2 humana recombinante (5 mg, R D systems, Lille, França), as esferas de glutationa foram lavadas 3 vezes com tampão de ligação 1 ×. As esferas lavadas foram então misturadas com 2 × tampão de carga de SDS e ferve-se a 100 ° C durante 5 min. O sobrenadante foi carregado numa 6% SDS-PAGE e transferidas em uma membrana de PVDF. blotting ErbB2 Ocidental foi realizado como descrito acima.

ligando Proximidade ensaio

In situ

ensaios ligando proximidade foram realizadas utilizando Duolink II Starter Kit Red (Olink, UPPSALA, Suécia ) seguindo o protocolo do fabricante. Resumidamente, 2,5 × 10

5 as células foram semeadas em uma corrediça permanox de câmara (Nunc, Brumath, França) e incubou-se 72 h, para se chegar a 70-80% de confluência. As células foram fixadas 20 min com 4% (v /v) de paraformaldeído à TA antes de um passo de bloqueio com a solução de bloqueio durante 30 minutos a 37 ° C. Os anticorpos primários contra MUC4 (8G7) e ErbB2 (C-18) foram diluídos a 1/50 em 1 × PBS pH 7,4 e incubou-se durante 90 min à temperatura ambiente. sonda PLA mais anti-coelho e anti-murganho MENOS foram diluídas a 1/5 em diluente de anticorpo, e incubou-se com as células 1 h a 37 ° C após dois passos de lavagem. A ligação e amplificação foram então realizadas a 37 ° C, a fim de visualizar o complexo. As lâminas foram montadas com meio de montagem Duolink II contendo DAPI. Colorações foram visualizados com uma Zeiss LSM 710 microscópio confocal (Zeiss, Jena, Alemanha), as imagens foram capturadas e analisadas com o software de navegação eficiente Zeiss (Zeiss, Jena, Alemanha).

A microscopia confocal

a microscopia confocal foi realizada como previamente descrito [24]. anticorpos MUC4 (8G7, Santa Cruz) e ErbB2 (C-18, Santa Cruz) foram utilizados na diluição 1/50 em 1 × D-PBS + Mg

2 ++ Ca

2 + (Invitrogen) contendo 0,2% (w /v) e saponina a 2% (v /v) de soro de cabra. AlexaFluor® 594 cabra anti-rato e AlexaFluor® 488 cabra anti-coelho (Invitrogen) anticorpos secundários foram respectivamente usados ​​para detectar MUC4 e expressão ErbB2.

ensaios de migração e invasão

A migração celular e invasão propriedades dos diferentes clones foram avaliados utilizando respectivamente 24, bem câmaras de Boyden de controlo (8 uM poros) e câmaras revestidas com matriz de Matrigel® (BD Biosciences, Le Pont de Claix, França) seguindo o protocolo do fabricante. Resumidamente, 10% (v /v) de soro fetal de bovino foi utilizada como quimioatractivo na cara inferior. 5 × 10

4 células foram plaqueadas na câmara superior e incubaram-se durante 48 h. Após a coloração com DiffQuick (médiane Diagnostics, Plaisir, França), as células na superfície inferior foram contadas usando um microscópio óptico com × 100 de ampliação. Oito campos de visão aleatórios foram contadas e a experiência foi repetida quatro vezes.

citometria de fluxo

As células foram cultivadas durante 24 h antes de serem colhidas por tripsinização, e, em seguida, ressuspensas em 1 x PBS. As células foram fixadas por adição de 1 ml de 70% (v /v) de etanol e incubação em gelo durante 30 min. As células foram então lavadas com 1 x PBS, tratou-se durante 5 minutos com RNase A (100 mg.ml

-1) e, finalmente, coradas com iodeto de propídio (50 mg.ml

-1, Sigma) durante 30 min. análise de células foi realizada em um Beckman Coulter EPICS XL3-MCL (Villepinte, França), utilizando o software Wincycle (Sistemas de Fluxo de Phoenix, San Diego, CA, EUA).

xenoenxertos subcutâneos

subcutânea (SC) xenoenxertos (6 × 10

6 células em 150 ul de meio RPMI 1640) de Capan-2 clones foram injectados com 150 uL de Matrigel® (Ref 354262, BD Biosciences, Le Pont de Claix, França) em Grave: imunodeficientes combinados (SCID) que foram criados e mantidos sob condições isentas de agentes patogénicos (6 ratinhos /tipo de célula). o desenvolvimento do tumor foi seguido periodicamente. O volume do tumor (mm

3) foi determinada por meio do cálculo V = W

2 × L /2, na qual W corresponde à largura (em milímetros) e L o comprimento do tumor (mm). Os ratos foram mortos 55 dias após a inoculação. Todos os procedimentos estavam de acordo com a orientação e aprovado pelo comitê de cuidados com os animais (Comité Ethique experimentação Animale Nord Pas-de-Calais, Permit número /protocolo: AF042008). Para cada tumor SC, o tecido foi fixado em formalina antes de inclusão em parafina. Os ratos que apresentam características de dor (perda de peso, caquexia, piloereção) ou portadores de tumor atingir 1 cm

3 foram sacrificados.

Imunohistoquímica

SC tecidos xenoenxerto foram fixados em 10% (w /v) tamponada de formaldeído, embebida em parafina, cortados em quatro espessura uM e aplicadas em lâminas SuperFrost® (Menzel-Glaser, Braunschweig, Alemanha). As lâminas foram então coradas com HE-Saffron-Astra azul. imunohistoquímica Manual (IHC) foi realizada conforme descrito em Van der Sluis

et al

[25] e IHC automática com um imunohistoquímica automatizado (ES, Ventana Medical System, Strasbourg, França) como no Mariette

et al

[26]. Os anticorpos foram utilizados como se segue:. 1:200 diluição de anti-ErbB2 (Dako), 1:100 de anti-MUC4 8G7 (Santa Cruz Biotechnology) e 1:50 de anti-MUC1 M8

Microarray DNA análise

análises transcriptoma comparativos foram realizados em quatro MUC4-KD e quatro ErbB2-KD clones celulares. Eles foram comparados com um conjunto de quatro Mock e quatro clones celulares NT, respectivamente. qualidade RNA foi verificada usando o Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Massy, ​​França). amostras ARNc foram sintetizados utilizando kit baixo RNA entrada linear fluorescente de amplificação (Agilent). A hibridação de Cy3 e Cy5 marcado ARNc foi realizada na 44 K pangenomic 60 microarray mer oligonucleótido humano (Agilent), de acordo com o protocolo do fabricante. Microarrays foram escaneados usando o G2505C scanner e recurso de software de extração Agilent (v10.5). Os dados foram processados ​​com o software GeneSpring (v10) para a normalização, filtragem e análise estatística. Os genes regulados positivamente ou regulados negativamente (dobre mudança 5) com significância estatística (P 0,05) foram classificados usando assintótica cálculo do valor P. Todos os dados são Miame compatível. Os dados brutos foram depositados em Gene Expression Omnibus (GEO, número de acesso: GSE31322).

qRT-PCR

Total de RNAs a partir de células de câncer pancreático foram preparadas utilizando o kit NucleoSpin® RNA II ( Macherey Nagel) seguindo o protocolo do fabricante. Os ADNc foram preparados como anteriormente descrito [27]. A PCR foi realizada utilizando o kit de SsoFast ™ Evagreen Supermix seguindo o protocolo do fabricante utilizando o sistema de PCR em tempo real CFX96 (Biorad). informações Primer é dada na tabela S1.

A análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando Graphpad Prism software 4.0 (Graphpad softwares Inc., La Jolla, EUA). Os dados são apresentados como média ± SEM. Diferenças na média de duas amostras foram analisadas por do estudante

t

teste ou testes ANOVA com a comparação selecionados pelo teste HSD post-hoc de Tukey com diferenças inferiores a 0,05 considerado significativo e foram indicados com um *. ** Indica P 0,01, *** indica p 0,001. Diferenças de contingência foram analisadas pelo teste do qui quadrado.

Resultados

MUC4 e ErbB2 interagir fisicamente nas CAPAN-2 pancreáticas células cancerosas

Imunoprecipitação de CAPAN-2 extrato celular com anticorpo anti-ErbB2 foi realizada antes de imunotransf erência com anticorpos anti-MUC4. MUC4 imunocoloração indica que MUC4 co-imunoprecipitado com ErbB2 em CAPAN-2 células (Figura 1A, pista 1). A especificidade da interacção foi avaliada utilizando IgG de coelho irrelevante que mostraram nenhuma banda imunoprecipitada (pista 2). A fim de mostrar a interação física direta entre MUC4 e ErbB2, primeiro realizado um ensaio de pull-down GST. Para isso, fizemos uma GST-MUC4

proteína EGF3 + 1 + 2 de fusão, que contém os três domínios semelhantes a EGF de MUC4. Em seguida, preparou duas colunas de afinidade tendo tanto o GST-MUC4

EGF3 + proteína de fusão 1 + 2 ou a GST sozinha em que ErbB2 humana recombinante foi carregado. A seguir cromatografia de afinidade, de imunotransferência anti-ErbB2 mostrou uma banda específica de ErbB2 para a coluna de esferas de glutationa tendo a GST-MUC4

EGF3 + 1 + 2 da proteína de fusão (Figura 1B, pista 1). Não foram observadas bandas de GST glutationa coluna de suporte sozinho (pista 2).

(A) Co-imunoprecipitação de 150 ug de CAPAN-2 extracto celular com um anticorpo anti-ErbB2 (pista 1) ou IgG de coelho ( pista 2). extracto de células CAPAN-2 sozinho (pista 3). (B) imunotransferência ErbB2 de GST pull-down da proteína ErbB2 humana recombinante com contas de GST glutationa (pista 2) de GST-MUC4 grânulos

EGF3 + 1 + 2 de glutationa (pista 1) ou. ErbB2 recombinante sozinha (pista 3). (C)

In situ

ensaio ligando proximidade em células CAPAN-2. complexos MUC4 e ErbB2 (pontos vermelhos) são indicadas por uma seta. Os núcleos foram coradas utilizando DAPI. experiência de controlo foi realizada na ausência de anticorpo primário. (D) de detecção de imunofluorescência de MUC4 (vermelho) e ErbB2 (verde) por microscopia confocal mostraram co-localização das duas proteínas (amarelo). (E) A expressão de MUC4 e ErbB2 em dois clones representativos de células MUC4-KD e ErbB2-KD e seus respectivos controles (Mock e NT) por transferência de Western.

Interação entre MUC4 e ErbB2 foi, então, confirmada usando outra abordagem que é o

In situ

ensaios de proximidade de ligação (PLA). Os resultados indicam que MUC4 e ErbB2 formar um complexo endógeno em células CAPAN-2 (pontos vermelhos, setas, Figura 1C). Finalmente, estudos de microscopia confocal confirmou a co-localização de MUC4 e ErbB2 em CAPAN-2 células (Figura 1D). No seu conjunto, estes resultados indicam que MUC4 e ErbB2 interagem fisicamente em CAPAN-2 células cancerígenas pancreáticas

através

MUC4

EGF3 + 1 + 2 região que contém os três domínios semelhantes a EGF. Nós, então, comprometeu-se a identificar os mecanismos celulares e as vias de sinalização intracelular sob o controle de ambos os parceiros.

Geração e caracterização de clones celulares ErbB2-KD e MUC4-KD estáveis ​​

Os cinco ErbB2- KD e sete clones celulares MUC4-KD mostrou inibição, respectivamente, quase completa ou total de ErbB2 e expressão MUC4 comparação para controlar clones (Figura 1E). A análise de Western blot de outro mucina ligada à membrana que é importante no cancro, MUC-1, indicam que a inibição de MUC4 auditivos que dramaticamente de MUC1 enquanto que a inibição de ErbB2 não teve nenhum efeito (Figura S1). Quando olhou para a expressão dos outros três membros da família de receptores ErbB, a inibição da MUC4 ou expressão ErbB2 levou a uma forte diminuição de ErbB2 e ErbB3 (MUC4-KD) e de ErbB3 (ErbB2-KD), respectivamente, enquanto que nenhuma efeito foi detectado para ErbB1 e ErbB4 (Figura S1).

Papel de ErbB2 e MUC4 sobre a proliferação celular e a apoptose

células MUC4-KD mostrou proliferação diminuída de 48 h que foi mantida a 72 h e tornou-se significativa em 96 h (44% menos do que as células Mock, p 0,05). células ErbB2-KD foram também menos proliferativa, com um decréscimo significativo de 27% às 96 h (p 0,05) (Figura 2A). Um forte paragem do ciclo celular na fase G1 (54,5% ± 0,13) foi observada em células MUC4 kD quando em comparação com células falsamente (37,4% ± 7,2, *, p = 0,016) (Figura 2B). Além disso, a fase G2M foi muito mais curto em células MUC4-KD (20,9 ± 4,7%) em comparação com células de controlo Mock (39,6 ± 6,7%, **, p = 0,0035) (global *, p = 0,0102). Em células ErbB2-KD, uma tendência para uma paragem do ciclo celular em G1 também ocorreu que permaneceu estatisticamente não significativa (p = 0,119) (Figura 2B). A fim de identificar os mecanismos responsáveis ​​por esta alteração na proliferação, expressão de marcadores de ciclo celular foi avaliado por Western blotting (Figura 2C). Claramente, diminuição da proliferação em células MUC4-KD foi associada com repressão da ciclina D1. Em células ErbB2-Kd, proliferação diminuída, foi associado ao aumento da expressão de p27

KIP1 inibidor do ciclo celular e diminuição da ciclina D1 (Figura 2D), sugerindo uma prisão celular no ponto de verificação proliferação G1 /S.

(a), o crescimento celular foi avaliada por contagem de células às 24, 48, 72 e 96 h para CAPAN-2-MUC4 KD ou ErbB2-KD e os seus respectivos controlos (Mock e NT). * = P 0,05 usando estudante

t

-teste. (B) Os perfis de distribuição do ciclo celular de MUC4-KD, ErbB2-KD e seus clones de controlo (Mock e NT) por citometria de fluxo após incubação com iodure propídio. Os valores são expressos como a média de três experiências independentes. * = P 0,05 pelo teste do qui-quadrado. ns = não significativo. (C) Efeito de MUC4 ou silenciamento ErbB2 foi analisada no ciclo celular ciclina D1 marcador e p27

KIP1 por western blot. β-actina foi medida como o controlo interno. (D) As bandas foram quantificadas por densitometria. Histogramas da proporção (ciclina D1 ou p27

KIP1 /β-actina) são mostrados. (E)% de população de subG1 MUC4-KD KD-ErbB2 e controlos (Mock e NT, respectivamente) foi determinado por citometria de fluxo após incubação com iodure propídio (* = p 0,05). (F) Western blot foram realizadas para caspase clivada 3, Bcl

XL e Bax no MUC4-KD, ErbB2-KD e seus respectivos controles (Mock e NT). β-actina foi avaliada como um controlo interno. (G) propriedades de migração de MUC4-KD, ErbB2-KD e clones de controlo (Mock e NT) foram avaliadas por meio de Boyden câmaras. Os resultados são expressos como número médio de células por campo migratório visão (*** = P 0,001, ns = não significativo). (H)% da invasão (células /células migratórias invasoras) foi determinada utilizando câmaras de Boyden revestidas com Matrigel®.

Para avaliar se a inibição MUC4 ou ErbB2 podem afetar a apoptose, a medição da população celular por apoptose ( células subG1) por citometria de fluxo foi realizado (Figura 2E). Os resultados indicaram um aumento significativo da população subG1 (13,33% ± 2,1) em células ErbB2 kD quando em comparação com os clones de controlo NT (6,2% ± 0,4) (*, p = 0,017). Em células MUC4-Kd, não foram observadas diferenças na população de células subG1 quando em comparação com os clones de controlo (Mock ns, p = 0,19). Expressão de marcadores de apoptose por imunotransferência indicou que Bax e Bcl

XL não foram alterados nas duas células MUC4-KD KD-ErbB2 e enquanto não se observou aumento da caspase-3 clivada em células ErbB2-kD (Figura 2F).

papel do MUC4 e ErbB2 na migração de células /invasão /adesão

Para avaliar o papel do MUC4 e ErbB2 na migração de células /invasão, os experimentos foram realizados em câmaras de Boyden com ou sem revestimento Matrigel®, respectivamente . Os resultados indicaram que um número significativamente menor de células migratórias foi observado em células MUC4-KD (37,8 ± 1,5) em comparação com células Mock (60,1 ± 3,3) (p≤0.001), enquanto nenhuma diferença significativa foi encontrada em células ErbB2-KD (53,5 ± 8,8) em comparação com os clones de controlo NT (56,2 ± 6,3) (Figura 2G). Quando medido invasividade, células MUC4 kDa apareceu significativamente mais invasiva (41,8% ± 1,5, n = 7) do que as células que expressam MUC4 (simulado) (19,5% ± 1,5, n = 5) (p = 0,029) (Figura 2H). clones de ErbB2-Kd, por outro lado, foram ligeiramente menos invasiva (9,4% ± 1,15) do que as células que expressam ErbB2 (NT, 14,14% ± 2,1), mas esta redução não foi significativa (p = 0,09). A capacidade das células ErbB2-KD MUC4-KD e aderir em Matrigel® (feita de dois componentes do pâncreas extracelular colágeno matriz IV e laminina) ou colágeno I também foi avaliada, mas não foram encontradas diferenças significativas tanto para células (não mostrado) .

Papel do ErbB2 e MUC4 na sinalização intracelular

O impacto da ErbB2 ou MUC4 nas principais vias de sinalização intracelular foi estudada por Western blot para: MAPKs (p42 /44, p38 e JNK ), Akt, e quinase de adesão focal (FAK) (Figura 3 e Figura S2). Fosforilação de p42 /p44 MAPK foi totalmente abolida em células ErbB2-KD em comparação com os clones de controlo NT, indicando inibição completa desta via subsequente a silenciamento de ErbB2. Em células MUC4-KD em comparação com os clones mock, p42 constitutiva /p44 MAPK fosforilada diminuído, enquanto que P42 /44 aumentou sugerindo uma activação da via MAPK ligada à supressão MUC4.

análises de Western blot (A) foram realizadas sobre extracto citosólico de MUC4-KD, ErbB2-KD e controles (Mock e NT, respectivamente) para a expressão de ambas as formas fosforilada e constitutivos da p42 /p44, JNK e p38 MAPK. β-actina foi utilizada como controlo interno. Dois clones representativos são apresentados. (B) As bandas foram quantificadas por densitometria. Histogramas da proporção (fosforilada forma /constitutiva) para p42 p44, JNK e p38 MAPK quinases /são mostrados.

Quando olhou para a via JNK, observou-se uma repressão total de JNK fosforilação em MUC4 clones -kd comparados aos controles Mock sugerindo que a expressão MUC4 dramaticamente impactos atividade da via JNK. Não se observou qualquer efeito na via JNK em clones ErbB2-KD. via MAPK p38 não parecem ser significativamente alterada, quer após o ErbB2 ou silenciamento MUC4 (Figura 3). Da mesma forma, Akt e FAK vias não foram significativamente modificados (Figura S2).

No seu conjunto, estes resultados mostram que a perda de MUC4 e ErbB2 prejudica dramaticamente JNK e p42 /44 MAPK vias de sinalização, respectivamente.

Efeito do ErbB2 e MUC4 em propriedades tumorais

in vivo

Para confirmar

in vitro

dados de efeitos MUC4 e ErbB2 sobre as propriedades da célula tumoral, estudos de xenotransplante SC foram realizadas . Os resultados indicam que o volume do tumor foi significativamente menor em ratinhos xenoenxertados com M4-2-1 ou M4-2-10 clones no dia 22 (Figura 4A) em que a falta de MUC4 foi confirmada por IHC (Figura 4B). Redução de expressão ErbB2 previamente demonstrado

in vitro

por transferência de Western foi também confirmado

in vivo

em tumores MUC4-KD por IHC (Figura 4B).