Abstract
O nosso estudo anterior descobriu que [6] -shogaol, um dos principais componentes bioativos em gengibre, é extensivamente metabolizado em células cancerosas e em ratos. Não está claro se estes metabolitos reter bioatividade. O objectivo do estudo é o de sintetizar os principais metabolitos de [6] -shogaol e avaliar a sua inibição do crescimento e indução de apoptose em células cancerosas humanas. Doze metabolitos de [6] -shogaol (M1, M2 e M4-M13) foram sintetizados usando métodos químicos simples e facilmente acessíveis. ensaios de inibição de crescimento mostrou que a maioria dos metabólitos de [6] -shogaol teve atividades mensuráveis contra células cancerosas humanas HCT-116 e H-1299. Em particular, metabolito M2 retido consideravelmente as actividades biológicas de [6] -shogaol, com um IC
50 uM de 24,43 em 116 HCT-células de cancro do cólon humano e um IC
50 de 25,82? M em H-1299 humano células de câncer de pulmão. Também exibe uma potência relativamente elevada foi tiol-M13 conjugado, com IC
50 valores de 45,47 e 47,77 uM para células HCT-116 e H-1299, respectivamente. A avaliação da toxicidade dos metabolitos sintéticos (M1, M2 e M4-M13) contra as células normais de cólon humano de fibroblastos de pulmão de células humanas normais IMR-90 CCD-18Co e demonstrou uma biotransformação desintoxicante de [6] -shogaol. O metabólito mais ativo M2 tinha quase nenhuma toxicidade para CCD-18Co e IMR-90 células normais com IC
50 anos de 99,18 e 98,30 mM, respectivamente. TUNEL (marcação terminal Terminal desoxinucleotidilo transferase dUTP nick) ensaio indicou que a apoptose foi desencadeada por metabolitos M2, M13, e seus dois diastereómeros M13-1 e M13-2. Não houve diferença significativa entre o efeito apoptótica de [6] -shogaol eo efeito da M2 e M13 após o tratamento 6 horas
Citation:. Zhu Y, Warin RF, Soroka DN, Chen H, Sang S ( 2013) metabólitos de Ginger Component [6] -Shogaol permanecer Bioactive em células cancerosas e possuem baixa toxicidade em células normais: Síntese química e Avaliação Biológica. PLoS ONE 8 (1): e54677. doi: 10.1371 /journal.pone.0054677
editor: Joseph J. Barchi, National Cancer Institute em Frederick, Estados Unidos da América
Recebido: 24 Outubro, 2012; Aceite: 13 de dezembro de 2012; Publicação: 30 de janeiro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Zhu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health concede CA138277 e CA138277S1 a SS. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Apesar dos enormes esforços feitos para o desenvolvimento de terapias contra o câncer ao longo das últimas décadas, o câncer ainda é um grande problema de saúde pública mundial. Evidências crescentes mostrou que os tratamentos usando agentes ou inibidores que têm como alvo apenas um evento biológico ou uma única via específicas geralmente falham na terapia do cancro [1]. agentes quimioterapêuticos convencionais têm sido mostrados para ser associada com a toxicidade inaceitável. Novas abordagens para o controle do câncer são extremamente necessárias. Quimioprevenção é uma área inovadora da pesquisa do câncer que incide sobre a prevenção do cancro através da farmacológico, biológica e intervenções nutricionais [2]. estudos que se acumulam têm mostrado que os fitoquímicos alimentares presentes em plantas e frutos, que são geralmente considerados como agentes, não tóxicos, podem activar ou bloquear várias vias importantes que estão implicados na sobrevivência de células cancerosas e o crescimento [1], [3], [4] . Quimioprevenção por fitoquímicos comestíveis é agora considerada como uma abordagem segura, barata, facilmente aceitável e acessível para a prevenção do câncer, controle e gestão.
Ginger, o rizoma da
Zingiber officinale
, tem sido um comumente usado especiarias e drogas bruto por muitos anos em todo o mundo. O gengibre é elogiado por seu alívio de náuseas, propriedades anti-inflamatórias e atividade anti-câncer putativa [5] – [7]. Os principais componentes farmacologicamente activos de gengibre são gingeróis e shogaols (Figura 1) [5]. processamento térmico de gingerols dá shogoals como os principais constituintes de gengibre seco [5], que mostram frequentemente uma maior actividade anti-cancerígena do que os seus precursores. Por exemplo, o nosso grupo demonstrou que [6] -, [8] -, e [10] -shogaols exibiram muito maior potência anti-proliferativa do que [6] -, [8] -, e [10] -gingerols contra H- 1299 HCT-116 células cancerígenas do cólon humano pulmão humano e [8]. Kim
et al
. relatou que [6] -shogaol exibiu efeitos inibidores de crescimento muito mais forte em células A-549 com câncer de pulmão humanos, HCT-15 células humanas de câncer de cólon, OV 3 SK-células cancerosas humanas ovarianos, e 2 SKMEL células de câncer de pele humanas do que [ ,,,0],4] -, [6] -, [8] -, e [10] -gingerols [9]. Juntamente com as nossas colaboradores, verificou-se que [6] -shogaol foi mais eficaz do que o [6] -gingerol na inibição da 12-
O
tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA) promoção do tumor induzida em ratos [10 ]. Um estudo mais recente mostrou que a [6] -shogaol apoptose induzida, a activação de caspase, e a clivagem de poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) em células de carcinoma hepatocelular humano SMMC-7721 e xenoenxertos de tumor SMMC-7721 através de um retículo endoplasmático (ER ) mecanismo associado ao estresse [11].
Um estudo recente do nosso grupo demonstrou que [6] -shogaol é extensivamente metabolizado em camundongos e em células cancerosas, em que treze metabólitos (M1-M13 ) foram detectadas e identificadas [12]. quantidade vestigial de metabolitos M6-M12 foram purificados a partir de amostras fecais recolhidas de ratinhos [6] -shogaol tratados, e as suas estruturas foram caracterizadas com base na análise de dados>
13C, e 2-D RMN [12 ]. As estruturas dos metabolitos restantes (M1-M5) e M13 foram elucidadas com base na análise da sua MS
n (n = 1-3) e os espectros de comparação com padrões autênticos. Com a sua α, estrutura cetona β-insaturado, verificou-se que [6] -shogaol pode ser reduzida para gerar metabolitos M6-M9 e M11. Nós também descobrimos que [6] -shogaol é o substrato para a conjugação tiol através da via do ácido mercaptúrico para formar metabolitos M1-M5, M10, M12 e M13. Como a maior parte [6] -shogaol é metabolizado
in vivo
e nas células cancerosas, a questão crítica é saber se os metabolitos [6] -shogaol são bioativo. Mesmo se menos potente do que [6] -shogaol, eles ainda podem contribuir para a actividade biológica total de [6] -shogaol
In vivo
.
O desafio actual para o estudo da bioactividade de metabolitos é a sua falta de disponibilidade comercial. Com quantidades vestigiais de metabolitos purificados a partir de amostras de fezes de rato, que foram apenas capazes de investigar os efeitos dos dois principais metabolitos M9 e M11 sobre a inibição do crescimento e indução de apoptose em células cancerosas humanas. Os nossos resultados mostraram que M9 e M11 são compostos bioactivos que podem inibir o crescimento de células de cancro e induzem a apoptose em células de cancro do pulmão e do cólon humano, se bem que com menos potência do que [6] -shogaol. Portanto, é oportuna para desenvolver métodos químicos para sintetizar os metabólitos de [6] -shogaol e continuar a analisar as suas actividades anti-câncer. O presente estudo descreve uma síntese química dos metabolitos anteriormente identificados de [6] -shogaol análise e uma bioactividade em células de cancro. Também são as toxicidades de [6] -shogaol e dos seus metabolitos em células de pulmão e cólon humanos normais investigados, proporcionando uma comparação de [6] -shogaol de toxicidade num modelo de não-cancro.
Resultados
Chemical Synthesis dos metabólitos de [6] -shogaol
doze metabolitos (M1, M2 e M4-M13) foram sintetizados com sucesso a partir de [6] -shogaol usando abordagens semi-sintéticos simples e de fácil acesso na atual estudo (Figuras 2 e 3). Em resumo, a reacção de [6] -shogaol com L-cisteína (Cys), N-acetil-L-cisteína (NAC) ou L-glutationa (GSH), gerado tiol-conjugados M2, M5, ou M13, respectivamente (Figura 2). Subsequentemente, a redução de tiol-conjugados M2 ou M5 por NaBH
4 levou-se a conjugados hidroxilados M1 ou M4, respectivamente (Figura 2). A redução selectiva de [6] -shogaol por uma combinação de NaBH
4 e CeCl
3.7H
2O resultou em M6 (Figura 3) [13]. A hidrogenação de [6] -shogaol sobre Pd /C proporcionou M11, seguido por tratamento com NaBH
4 para produzir M9 (Figura 3). Além disso, a desmetilação de M11 utilizando BBr
3 deu M8 (Figura 3). Michael reacção de [6] -shogaol com NaOMe ou NaSMe produziu o aducto metoxi M7 ou o aducto metiltio M10, respectivamente (Figura 3) [14], [15]. Dos quais, o aducto metiltio M10 foi tratada com NaBH
4 para dar M12 (Figura 3). Uma vez que tanto a redução da cetona e as reacções de Michael utilizados neste estudo são não-estereosselectivo, metabolitos M1, M2, M4-M7, M9, M10, M12, M13 e são sintetizados na forma de misturas de diastereómeros.
Reagentes e condições: i.) de L-cisteína, NaHCO3 (cAT), MeOH /H2O, TA, 24 h; ii) NaBH4, MeOH, 0 ° C, 2 h; iii) N-acetil-L-cisteína, NaHCO3 (CAT), MeOH /H2O, TA, 72 h.; Iv.) L-glutationa reduzida, NaHCO3 (CAT), MeOH /H2O, TA, 3 h
Reagentes e condições:. I) H2, Pd /C (10% w /w), THF, ta, 18 h; ii) BBr3, DCM, -78 ° C -rt, 2 h; iii) NaBH4, MeOH, 0 ° C -rt, 2 h; iv) aq. 15% NaSCH3, THF, ta, 6 h; v) de Na, MeOH, 0 ° C -rt, 4 h; vi) NaBH4, CeCl3.7H2O, MeOH, -78 ° C, 30 min.
Temos caracterizado totalmente as estruturas de M5-M12 utilizando o 1-D e 2-D RMN e de espectro de massa dados em nosso estudo anterior [12]. Por conseguinte, as estruturas destes compostos sintéticos foram confirmados por comparação dos seus
1H e
13C Os espectros de RMN com os de padrões autênticos, obtidos a partir de amostras de fezes de ratinho. As estruturas dos metabolitos sintéticos restantes (M1, M2, M4, e M13), previamente deduzida por técnicas de espectrometria de massa em várias fases [12], foram também confirmadas pelos seus dados dos espectros de 1-D e 2-D RMN para a primeira vez.
M2 mostrou a fórmula molecular C
20H
31NO
5S, com base em positiva APCI-MS em
m /z
398 [m + H]
+ e seus dados
1H e
13 C RMN. O peso molecular de M2 foi de 42 unidades de massa a menos do que a N-acetilcisteína conjugado [6] -shogaol (M5) [12], que indica a cisteína M2 foi conjugado [6] -shogaol. Isto estava de acordo com o facto de que M2 foi feita por [6] -shogaol e L-cisteína. Isto foi também suportado pela observação da ausência de um grupo acetilo no
1H e
espectros de 13C RMN de M2. A ligação de uma porção L-cisteinil ao [6] resíduo -shogaol em C-5 foi estabelecida por HMBC cruzadas picos entre H
Cys-β (δ
H 3,18 e 2,84) e C-5 ( δ
C 42.3) (Figura 1). Portanto, o M2 foi confirmada como sendo 5-cysteinyl- [6] -shogaol.
M1 tinha a fórmula molecular de C
20H
33NO
5S com base positiva APCI-MS em
m /z
400 [m + H]
+ e sua
1H e
13C dados de RMN. O peso molecular de M1 foi de 2 unidades de massa mais elevado do que o de M2, correspondentes com o facto de que M1 foi um produto reduziu-cetona de M2, e também suportado pelo aparecimento de metinos oxigenados (dois conjuntos de protões para os diastereómeros em δ
H 3,66 e δ
H 3,90, e δ
C 69.3) em sua
1H e
espectros de 13C. correlações HMBC chave entre H-3 (δ
H 3.66 e δ
H 3,90) para C-1 (δ
C 32,5) e C-5 (δ
C 43.8), bem como H-1 (δ
H 2,68 e 2,58) a C-3 (δ
C 69.3) em M1 (Figura 1), estabelecido um grupo hidroxilo em C-3 da cadeia lateral de alquilo de M1. HMBC cruzadas picos entre H
Cis-β (δ
H 3,15 e 2,85) a C-5 (δ
C 43,8), e H-5 (δ
H 2.94) para C
Cis-β (δ
C 32,8) fornecida a ligação da porção de cisteinilo e a posição C-5 do M1 através de uma ligação tioéter. Assim, M1 foi confirmado como sendo 5-cisteinil-M6.
M4 mostrou a fórmula molecular C
22H
35NO
6S, com base em positiva APCI-MS a
m /z
442 [M + H]
+ e sua
1H e
13C dados de RMN. O peso molecular do M4 era 2 unidades de massa mais elevado do que o de M5 (5-
N
-acetylcysteinyl- [6] -shogaol), em conformidade com o facto de um produto M4 foi reduzida-cetona de M5. Este foi ainda apoiada pelo aparecimento de metinos oxigenados (dois conjuntos de prótons para os diastereoisómeros em δ
H 3,70 e δ
H 3,88; e δ
C 69.3) em sua
1H e
13C os espectros de RMN, o desaparecimento do grupo cetona carbonil esperado em [6] -shogaol, e as correlações HMBC observadas a chave H-3 (δ
H 3.70 e δ
H 3,88) a C-1 ( δ
C 32,5) e C-5 (δ
C 43.8), bem como H-1 (δ
H 2,67 e 2,58) a C-3 (δ
C 69.3) na sua espectro HMBC (Figura 1). O grupo acetil foi mostrado ligado a a-NH
2 da porção cisteinil por correlação HMBC detectado em H
Cys-α (δ
H 4,54) para CH
3CO (δ
C 174,0). Além disso, HMBC cruzadas picos entre H
Cis-β (δ
H 3,00 e 2,80) e C-5 (δ
C 43,8) fornecida a ligação de uma porção acetylcysteinyl e a posição C-5 da M4. M4, mesmo, foi confirmado para ser 5-
N
-acetylcysteinyl-M6.
M13, que tem a fórmula molecular C
27H
41N
3O
9S com base positiva APCI-MS a
m /z
584 [m + H]
+ e os seus dados de RMN, foi feita por [6] -shogaol e reduzida L-glutationa (GSH) .
1H-
1H COSY cruzadas picos encontrados em H
Glu-α /H
Glu-β /H
Glu-γ, em combinação com correlações chave HMBC entre H
Glu-α (δ
H 3.65) para Glu α-COOH (δ
C 174,0) bem como H
Glu-γ (δ
H 2,55 e 2,51) para Glu γ-CON ( δ
C 175,2), reconheceu a estrutura de um resíduo glutamilo (Glu) (Figura 1). A estrutura do resíduo cisteinil (Cys) foi criado pelo
1H-
1H COSY cruzadas picos em H
Cys-α /H
Cys-β em combinação com correlação HMBC entre H
Cis-β (dois conjuntos de protões em δ
H 3,05-2,95 e 2,84-2,80) para Cys α-CON (δ
C 175,2) (Figura 1). Subsequentemente, a ligação do resíduo glutamilo com a porção de cisteinilo foi estabelecida entre Glu γ-COOH e Cys α-NH
2 através de uma ligação amida, por correlações HMBC encontradas em H
Cis-α (δ
H 4,50) para Glu γ-CON (δ
C 175,2). A ligação de uma porção glicinil ao resíduo de cisteinilo foi encontrada entre Cys α-COOH e Gly α-NH
2, por correlações HMBC observadas em H
Gli-α (δ
H 3,80) para α Cys -CON (δ
C 175.2). Assim, o resíduo de GSH foi sem dúvida, identificado como γ-glutamil-cisteinilglicina. Consequentemente, a ligação da porção GSH ao [6] resíduo -shogaol foi estabelecida em C-5 através de uma ligação tioéter por correlações HMBC encontradas em H
Cys-β (dois conjuntos de prótons em δ
H 3.05- 2,95 e 2,84-2,80) a C-5 (δ
C 42.2). Portanto, M13 foi confirmada como sendo 5-glutathiol- [6] -shogaol.
a separação de isómeros M13 em HPLC preparativa resultou em dois diastereoisómeros, M13-1 e M13-2, que muito semelhante
1H e
13 C RMN. As principais diferenças foram a
sinais 1H para H
Cys-βb (δ
H 2.73 em M13-1 vs. 2.81 no M13-2) e H-4a (δ
H 2.76 em M13 -1 vs. 2.70 no M13-2) eo
sinais de 13C para C-4 (δ
C 49.9 em M13-1 vs. 49,6 em M13-2) e C-5 (δ
C 42,0 vs 42,4 em M13-1 em M13-2) (Figura 4). Em seu espectro NOESY, observou-se as correlações entre H
Cys-βb (δ
H 2,73) e H-5 (δ
H 3.10) em M13-1 e H
Cys-pA ( δ
H 2.97) e H-5 (δ
H 3.10) em M13-2, sugerindo que a H-5 em M13-1 tinha a mesma configuração que a do H
Cis-βb e H- 5 em M13-2 tinha a mesma configuração que a do H
Cis-pA (Figura 4). Sabe-se que H
Cis-α no resíduo GSH tem o
configuração R
(Figura 4). A constante de acoplamento (
J
= 5,0 Hz) de H
Cys-pA (δ
H 2,97) com H
Cys-α (δ
H 4,49) é muito menor do que (
J
= 8,7 Hz) de H
Cys-βb (δ
H 2,81) com H
Cys-α, sugerindo que H
Cys-pA (δ
H 2,97) tem o mesmo
configuração de R
como a de H
Cys-α e H
Cys-βb tem o
S
configuração. Portanto, as configurações de H-5 em M13-1 e M13-2 foram tentativamente atribuído como
S Comprar e
R
, respectivamente (Figura 4).
Crescimento efeitos inibidores contra o cancro humano e células normais
Duas linhas celulares de cancro humano, HCT-116 e H-1299, foram tratados com [6] -shogaol ou seus metabolitos sintéticos M1, M2, M4 e M13- , com concentrações que variam de 0 a 80 uM. ensaios de viabilidade celular, utilizando MTT resultou em oito metabolitos activos, M2, M5, M6, M8-M11, e M13, contra as células de cancro do cólon HCT-116, com IC
50 valores de 24,43, 54,26, 68,77, 58,76, 82,22, 78,16, 83,97, e 45,47? M, respectivamente (Figura 5), e oito metabolitos activos, M2, M5, M6 e M9-M13, em células de cancro do pulmão H-1299, com IC
50 valores de 25,82, 72,62, 61,28, 82,50, 60,63, 66,50, 69,91, e 47,77? M, respectivamente (Figura 6). Entre eles, M2, a cisteína conjugado metabolito de [6] -shogaol, foi encontrada para ser mais potente para ambas as células HCT-116 e H-1299 com CI
50 valores de 24,43 e 25,82 mm, respectivamente, o que era comparável para o pai [6] -shogaol, com um IC
50 de 18.20 M em HCT-116 células e um IC
50 de 17.90 M em células H-1299. O segundo metabolito mais activo foi de 5-glutathionyl- [6] -shogaol (M13), com IC
50 valores de 45.47 e 47.77 M em HCT-116 e células H-1299, respectivamente. 5-
N
-acetylcysteinyl- [6] -shogaol (M5) também exibiu bioatividade perceptível com IC
50 valores de 54,26 M em HCT-116 células e 72,62 M em células H-1299. Este metabolito, no entanto, a diminuição da actividade exibida quando comparada com a de 5-cysteinyl- [6] -shogaol (M2), sugerindo a acetilação em α-NH
2 da porção cisteinil diminui a actividade de M2. Além disso, a redução de um grupo cetona na cadeia lateral de alquilo resultou em pouca ou nenhuma actividade contra células cancerosas HCT-116 e H-1299, como observado a partir de M1 e M4 contra M2 e M5, bem como M6, M9, e M11 contra [6] -shogaol, indicando a biotransformação redutora de [6] -shogaol e seus metabólitos foi inativação principalmente.
Bar
, erro padrão (n = 6).
Bar
, erro padrão (n = 6).
Avaliação da citotoxicidade nas células normais de fibroblasto cólon humano células pulmonares humanas normais CCD-18Co e IMR-90 mostraram que todos os metabolitos sintéticos (M1, M2 e M4-M13) foram menos tóxicos do precursor [6] -shogaol, e a maioria deles tinha pouco ou nenhum efeito inibidor (Figuras 5 e 6), indicando assim uma biotransformação de desintoxicar [6] -shogaol. Mais importante ainda, o metabolito M2, que tem a maior potência contra as células cancerosas H-1299 ambos HCT-116 e, mostrou quase nenhuma toxicidade contra células de cólon normais células pulmonares normais IMR-90 com CI CCD-18Co e
50 valores de 99,18 e 98,30 mM, respectivamente, em comparação com aqueles de pai [6] -shogaol com um IC
50 de 43,91? M em direção à linha de células do cólon normal, CCD-18Co e um IC
50 de 36.65 mM em direção à linha normal de células do pulmão IMR -90. Além disso, M13, com IC
50 valores de 75,50 e 57,54? M contra células CCD-18Co e IMR-90, respectivamente, também exibido toxicidade mais baixa em relação ao pai [6] -shogaol.
A fim de investigar a influência da estereoquímica em actividade, metabolito M13, como uma mistura de diastereómeros, foi separado por fase inversa de HPLC preparativa em dois isómeros individuais, M13-1 e M13-2. As células cancerosas HCT-116 e H-1299 foram tratadas com M13 ou os seus estereoisómeros constituintes (M13-1 e M13-2) individualmente, com concentrações que variam de 0 a 80 uM. Encontrámos ambos os isómeros tinha uma actividade semelhante, mas ligeiramente inferior a M13, e M13-2 a ser ligeiramente mais eficaz do que M13-1, com um IC
50 valor de 54,90 uM em células HCT-116 e 63,77? M em H-1299 células, contra 71,20 uM e 74,39 uM nas mesmas respectivas linhagens de células (Figura 7). M13 reconstituído por indivíduos M13-1 e M13-2, com uma razão aproximada de 01:02 (molar /molar), que é semelhante à proporção em M13 original, apresentada a actividade equivalente, com IC
50 valores de 46,46? M em células HCT-116 e 41,98 uM em células-1299 H, em comparação com o original com M13 IC
50 valores de 45,47 uM em células HCT-116 e 47,77 uM em células H-1299. Isto sugeriu que o efeito inibidor do crescimento observada de M13 não pode ser atribuída a um isómero ou de outro.
Bar
, erro padrão (n = 6).
M2 e M13 induzir a apoptose em células cancerosas humanas
em muitos casos, a morte celular é o resultado da activação da via reguladora importante conhecido como apoptose, ou morte celular programada. O objetivo foi determinar se a apoptose foi desencadeada após exposição a [6] -shogaol e seus metabólitos por utilização de um ensaio de TUNEL, o qual detecta a quebra de ADN característica de células que sofrem apoptose. Neste estudo, testou-se os dois metabolitos mais activas contra o crescimento de células cancerosas, M2 e M13, assim como um dos metabolitos mais abundantes, M6, em conjunto com [6] -shogaol. Incubámos H-1299 e HCT-116 células com elas em várias concentrações para determinar a gama activa destes compostos contra apenas DMSO. Os resultados estão resumidos na Figura 8. Depois de 24 horas de incubação, metabolito M6 não exibir qualquer efeito apoptótico em linhas de células H-1299 e HCT-116. apoptose significativa foi observada para M2 e M13 em ambas as linhas celulares, excepto para M2 em células H-1299 para a concentração de 20 uM. A indução da apoptose por [6] -shogaol foi significativamente superior ao de ambos M2 e M13 na mesma concentração (20 ^ M). Em células H-1299, um efeito apoptótico equivalente a [6] -shogaol pode ser obtido se a concentração de M2 e M13 foi duas vezes (40 ^ M) do que a de [6] -shogaol. Resultados semelhantes foram obtidos em células HCT-116, excepto que a indução de apoptose M2 foi significativamente superior a 40 uM. Em todas as linhas celulares, um aumento da concentração de [6] -shogaol, M2, M13, M13-1, M13-2 ou M6 produziu um aumento correspondente no nível de apoptose em células de cancro (Figura 8A e 8B).
células TUNEL positivas foram observadas na potência 400X. 10 campos por lâmina foram contados e média.
Bar
, erro padrão; o, não é significativa; +, P 0,05; *, P 0,01; **: P 0,0001. Todos os testes estatísticos são t-teste de Student não emparelhado, 2 atado, em comparação com DMSO ou a [6] -shogaol concentração correspondente.
De modo a determinar se o efeito apoptótico observado na Figura 8A e 8B foi constante ao longo do tempo, incubámos [6] -shogaol, M2 e M13 em células HCT-116 por apenas 6 horas (Figura 8c). Após 6 horas de incubação com [6] -shogaol ou metabolitos M2 ou M13, fomos capazes de detectar níveis significativamente mais elevados de apoptose para todos os 3 compostos, em comparação com DMSO, em células HCT-116. Curiosamente, não houve diferença significativa entre o efeito apoptótico de [6] -shogaol e os efeitos de M2 em 20 e 40 uM e M13 a 40 uM. M13 foi significativamente mais potente do que o [6] -shogaol a 20 uM. A exposição de células HCT-116 a M13 isómeros M13-1 e M13-2, também mostrou um nível mais elevado de apoptose, mas o efeito apoptótico dos isómeros foi significativamente inferior em comparação com [6] -shogaol para ambas as concentrações utilizadas. Estes resultados mostram que a apoptose é desencadeada por [6] -shogaol metabolitos M2, M13, M13-1 e M13-2, e é o mecanismo responsável, pelo menos parcialmente, para a morte celular observada anteriormente.
Discussão
agora é bem aceito que os compostos naturais oferecem a oportunidade de interferir nos estágios iniciais de câncer ou prevenir o seu desenvolvimento completo [16]. No entanto, estes compostos têm as suas limitações, tais como
in vivo
volume de negócios rápido, quantidades limitadas nos géneros alimentícios, e sua eventual toxicidade com doses mais elevadas [17]. É notável que os efeitos anti-cancro para estes compostos pode ser observada em estudos de coorte, apesar de uma curta semi-vida e metabolismo rápido uma vez ingerido [18]. Muitas vezes, a presença do composto só pode ser avaliada por quantificação de metabolitos, o que sugere que estes metabolitos circulam no corpo durante um certo período de tempo e, potencialmente, interagir com os processos biológicos [19]. Por conseguinte, uma hipótese que explica a bioactividade de compostos naturais é que os próprios metabolitos reter e transportar a totalidade ou parte da bioactividade do composto inicial. O presente estudo explorou essa possibilidade usando [6] -shogaol, o principal componente do gengibre seco, e seus metabólitos.
O nosso estudo anterior indicou que [6] -shogaol é extensivamente metabolizado em camundongos e em células cancerosas e mais de 90% de [6] -shogaol é convertido nos seus metabolitos [12]. Nós também notado que células normais IMR-90 humana, em certa medida metabolizado [6] -shogaol de uma maneira semelhante para as células cancerosas (dados não mostrados). Como resultado, metabolismo rápido de [6] -shogaol pode oferecer a chance de seus metabólitos estáveis para se envolver em processos biológicos se possuíssem bioatividades. De modo a verificar esta hipótese, é crítico para a obtenção dos metabolitos numa forma estável. Isolamento do seu ambiente nativo não seria conveniente e provavelmente não iria produzir as quantidades necessárias para a biologia experimental. A síntese química é muito mais desejável, reprodutível e eficiente. Temos purificado M6-M12 em quantidades muito limitadas (0,5-17 mg) a partir de amostras de fezes coletadas a partir de [6] -shogaol ratos tratados [12]. A fim de ter a quantidade suficiente para estudar ainda mais a bioactividade de [6] -shogaol metabolitos, descrevem-se os passos de química permitindo a síntese dos principais metabolitos de [6] -shogaol neste estudo. Doze metabolitos de [6] -shogaol (M1, M2 e M4-M13) foram sintetizados com sucesso por abordagens possíveis. As estruturas dos metabolitos sintéticos foram verificadas utilizando 2-D dados de RMN 1-D e /ou, bem como espectros de massa.
em comparação efeitos inibidores do crescimento dos metabolitos sintéticos com [6] -shogaol em duas humanas células cancerosas e duas células humanas normais. Os nossos resultados mostraram que dois metabolitos, M2 e M13, possuía os efeitos inibidores de crescimento mais comparável a [6] -shogaol em relação a células cancerosas. Mais importante ainda, M2 exibiu um efeito discriminatório, uma vez que não parecem ser tóxicos para as células normais. Este efeito não foi detectado com [6] -shogaol. M13 também mostraram efeitos menos tóxicos em relação a células normais comparativamente [6] -shogaol. Além disso, M5, M6 e M12-M8 também teve certa potência contra o crescimento de células cancerosas, mas não mostrou qualquer toxicidade contra células normais com IC
50 valores maiores do que 100 um (Figuras 5 e 6). Os nossos resultados indicam claramente que os metabolitos de [6] -shogaol permanecem bioactivo contra células cancerosas, mas são muito menos tóxico do que a [6] -shogaol para as células normais. Isto confirma a nossa hipótese de que os próprios metabolitos reter e transportar a totalidade ou parte da bioactividade do composto inicial.
A apoptose é um mecanismo frequentemente responsável pela indução da morte celular, em resposta ao stress interno ou externo. A fim de obter insights sobre o mecanismo de ação dos metabólitos, foi realizado um ensaio de TUNEL no HCT-116 células usando M2, M6, M13 e seus dois isômeros, M13-1 e M13-2 e comparou suas atividades ao de [ ,,,0],6] -shogaol. Ele mostrou que tanto M2 e M13, mas não M6, são capazes de induzir apoptose de células de cancro em ambos os HCT-116 células de cancro de cólon humano e células de cancro de pulmão humano H-1299 (Figura 8A e 8B). Para M13, indução de apoptose pode não ser firmemente atribuída a um isómero ou de outra, o que sugere que a configuração estéreo não é importante para a bioactividade deste composto. Observou-se que tanto M2 e M13 poderá desencadear apoposis em células HCT-116 a um nível semelhante ao do [6] -shogaol no ponto de tempo de 6 horas (Figura 8C). No entanto, após 24 horas de exposição aos metabolitos, a percentagem de células positivas TUNEL foi principalmente inalterada em 20 pM, tanto para M2 e M13, enquanto o efeito de [6] -shogaol foi notavelmente aumentada. O efeito de indução de apoptose em M2 a uma concentração de 40 uM aumentaram dramaticamente no ponto de tempo de 24 horas em comparação com a do ponto de tempo de 6 horas, que era significativamente mais elevada do que a de M13, a uma concentração de 40 uM. Observou-se também um efeito dependente da concentração de [6] -shogaol e os seus metabolitos na apoptose de células de cancro, em que um aumento na concentração de um composto resultou em um aumento da percentagem de células apoptóticas correspondente. Em conjunto estes resultados sugerem que é provável que a activação de outros mecanismos estão envolvidos no desencadear a morte de células de cancro, no entanto, a apoptose parece ser uma das principais vias activadas para [6] -shogaol metabolitos para induzir a morte de células de cancro.
é sempre um desafio para separar estereoisómeros. Entre todos os metabolitos sintetizados, M13 era a mistura de diastereómeros únicos que fomos capazes de separar utilizando uma coluna de HPLC preparativa não quiral. Nossos resultados indicaram que M13 como a mistura de M13-1 e M13-2 teve efeitos inibitórios um pouco melhor crescimento em células de câncer do que os dois diastere�eros sozinho e M13-1 e M13-2 tiveram atividade semelhante, embora M13-2 foi ligeiramente mais potente que M13-1. Mais importante, foi observado que o metabolito M13 de [6] -shogaol sob a forma de uma mistura de M13-1 e M13-2 em HCT-116 células de cancro do cólon humano (dados não mostrados). Seria vantajoso para separar os dois diastereómeros de M2, no metabolito mais activo de [6] -shogaol, usando uma coluna quiral e, ainda, determinar o efeito da configuração estéreo na actividade deste composto em estudos futuros. Nós recentemente identificado como sendo um metabolito M2 de [6] -shogoal em humanos (dados não publicados). Assim, é importante para determinar se M2 existe como uma mistura de dois diastereómeros em camundongos e em humanos.
Em conclusão, o presente estudo nos permitiu mostrar que os metabolitos de [6] -shogoal pode explicar a bioactividade do composto-mãe, e especificamente desencadeia vias moleculares responsáveis pela morte de células de cancro de um modo semelhante. Ele sugere que a actividade anti-cancro atribuída a compostos tais como [6] -shogoal pode ter sido parcialmente deturpado no passado. O que foi originalmente pensado para ser um efeito do composto natural pode ter sido o resultado direto de rápido metabolismo do composto, tornando-o menos capaz de desencadear mecanismos moleculares. No entanto, a aparição de seus metabólitos nos tecidos-alvo, então, completar, manter ou substituir completamente o efeito bioativo do composto inicial. Complementar
in vivo serão necessários
estudos para obter uma resposta definitiva para essa pergunta, mas a partir de agora o estudo apresentado abre novas possibilidades de pesquisa para o estudo de metabólitos bioativos de [6] -shogaol.
Materiais e Métodos
Materiais
[6] -Shogaol foi purificada a partir de extrato de gengibre em nosso laboratório [8].