Abstract

Objetivos

Nós teve como objetivo investigar o valor prognóstico da RRM1 em pacientes GC.

Métodos

Um total de 389 pacientes avaliáveis ​​GC com informações clínico-patológico e sobrevivência foram inscritos de City of Hope (COH, n = 67) e da Universidade de Zhejiang (ZJU, n = 322). a expressão da proteína RRM1 foi determinado por imuno-histoquímica em amostras de tecido FFPE. análises de Kaplan-Meier e Cox foram usados ​​para medir a sobrevivência. atividade e invasão ensaios de Ras /Raf foram usadas para avaliar o papel da RRM1 em linhas de células de GC.

Resultados

In vitro

experimentos demonstraram RRM1 activado Ras /Raf /MAPK transdução de sinal e a proliferação celular promovido GC. Enquanto isso, a expressão RRM1 foi significativamente associada com comprometimento dos linfonodos, tamanho do tumor, a expressão Ki67, tipo histológico e grau histológico nas amostras de tecido GC (

p Art 0,05). A análise de Kaplan-Meier ilustrados que a alta expressão RRM1 previu pior sobrevida em pacientes GC no COH e coortes ZJU (log-rank

p Art 0,01). Na análise multivariada de Cox, as taxas de risco de RRM1 da sobrevivência global foi 2,55 (IC 95% 1,27-5,15) e 1,51 (IC 95% 1,07-2,13) ​​na COH e ZJU define, respectivamente. Em particular, RRM1 previsto especificamente o resultado de GCs avançado com pobre diferenciação e capacidade proliferativa alta. Além disso, a inibição da RRM1 por siRNA reduziu significativamente a piscina de dNTP, Ras /Raf e MMP-9 actividades e os níveis de p-MEK, p-ERK e NF-kB, resultando em atraso de crescimento e reduzida invasão em AGS e NCI-N87 células.

Conclusões

RRM1 superexpressão prevê pior sobrevida em pacientes com estágio avançado GC TNM. RRM1 poderia servir como biomarcador prognóstico e alvo terapêutico para GCs

Citation:. Wang Q, Liu X, Zhou J, Huang Y, Zhang S, Shen J, et al. (2013) ribonucleotídeo redutase subunidade grande M1 prediz pior sobrevida devido a modulação por proliferativa e capacidade invasiva do câncer gástrico. PLoS ONE 8 (7): e70191. doi: 10.1371 /journal.pone.0070191

editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japão

Recebido: 09 de abril de 2013; Aceito: 15 de junho de 2013; Publicação: 29 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi parcialmente financiado pelo National Institutes of Health (NIH) subvenções (R01, CA127541), National Nature Science Foundation da China (NSFC) 81.101.659 /H1609, Nature Science Foundation da província de Zhejiang, China (NSFZ) Y2110073. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

adenocarcinoma gástrico (câncer gástrico, GC) é a segunda principal causa de mortalidade associada ao cancro em todo o mundo, especialmente nos países asiáticos e em desenvolvimento, onde cerca de um milhão de casos são diagnosticados anualmente [1] – [2]. A mortalidade mais elevada (28,1 por 100.000 homens, 13,0 por 100.000 mulheres) de GC tem sido relatada na Ásia Oriental, que inclui China, Japão e Coreia [2]. modalidades de tratamento convencionais, incluindo cirurgia, quimioterapia e radioterapia, têm demonstrado um benefício de sobrevivência para pacientes do GC [3] – [6]. No entanto, a taxa de sobrevida de 5 anos ainda é decepcionante, ea maioria dos pacientes GC morrem de complicações da doença e recaída [3], [7] – [8]. Vários biomarcadores estão a ser investigados com o objectivo de prever e melhorar os resultados de sobrevivência em doentes com GC [9]. Até agora, alguns dos biomarcadores são amplamente usadas clinicamente para GC.

redutase do ribonucleotídeo (RNR) é considerado um alvo terapêutico para o tratamento do cancro. RNR é uma enzima de tempo limitado que catalisa a conversão de difosfatos de ribonucleósido de desoxiribonucleósidos difosfatos através

de novo

metabolismo de nucleótidos endógenos [10]. inibidores RNR, tais como hidroxiureia, têm sido amplamente utilizados para tratar leucemia e tumores sólidos [11] – [13]. No entanto, a aplicação de inibidores de RNR tem sido limitada devido à baixa eficácia, resistência à droga e os efeitos colaterais [14]. A maioria das limitações de inibidores RNR são causadas por segmentação não específica. RNR humano consiste em três subunidades, a grande subunidade M1 (RRM1) e duas subunidades pequenas e M2 M2a. Cada subunidade pequena pode complexo com RRM1 para formar uma holoenzima activa [10]. nível M2 prediz mau prognóstico em vários tipos de câncer, incluindo câncer de pulmão, câncer de pâncreas e GC [15] – [18]. M2B parece desempenhar um papel na supressão malignidade e está associada com melhor sobrevida no câncer colorretal, de acordo com nossa pesquisa anterior [19] – [20]. No entanto, os papéis biológicos de RRM1 não são idênticos entre estes cancros. Nós investigamos os níveis de mRNA de RRM1 no cancro e seções normais do tecido usando o banco de dados Oncomine (www.oncomine.com) correspondente. Sob determinadas condições (

p Art 0,05, mudança dobra 2, classificação gene = 10%, todos os tipos de dados), o mRNA RRM1 foi regulado para cima em 39 análises originais e sub-regulada em 11 única analisa. RRM1 aumentou principalmente nas secções de bexiga, cervical, colorectal, cabeça e pescoço, os cancros do fígado e do pulmão, bem como o melanoma e sarcoma. Enquanto isso, RRM1 foi regulada no cancro da mama, leucemia e linfoma. A subunidade de mamífero RNR R1 (semelhante ao RRM1 em humano) desempenha um papel na supressão malignidade por inactivação da via de sinalização /Raf /MAPK em Ras transformadas com Ras 3T3 (ratinho) [21] – [22]. Mais estudos sobre os resultados demonstraram que a alta expressão RRM1 (juntamente com ERCC1 ou PTEN-regulação) é um determinante de sobrevivência ideal no cancro do pulmão de pequenas células não-estágio inicial (NSCLC) [23] – [26]; no entanto, outros estudos têm mostrado resultados aparentemente conflitantes [27] – [29]. superexpressão RRM1 está relacionada com a resistência à gemcitabina em NSCLC e cancro do pâncreas, que resulta em um resultado pobre [30]. Estes estudos indicam que o papel de RRM1 no cancro permanece controverso, mesmo no mesmo tipo de cancro em diferentes estágios ou em diferentes terapias [31] – [32]. RRM1 tem sido sugerido que têm outras funções biológicas além de formar Holoenzimas RNR para converter NDP para dNDP, o que poderia explicar em parte a baixa eficácia de inibidores RNR no tratamento do cancro. Portanto, amplamente investigando os papéis de RRM1 seria útil no desenvolvimento de inibidores RNR inovadoras para o tratamento do câncer, especificamente. GC é um da maior parte dos cancros comuns em todo o mundo, mas inibidores RNR, tais como hidroxiureia e gemcitabina, não têm sido utilizados vulgarmente devido à baixa eficácia. Por outro lado, foi examinado o impacto da RRM1 nos resultados de GC. Portanto, seria valioso para explorar o papel biológico de RRM1 GC em células e avaliar o significado clínico dos pacientes RRM1 sobreexpressão em GC.

Neste estudo, os papéis de RRM1 na regulação da proliferação celular e invasão através do via de sinalização de Ras /Raf em linhas celulares de GC foram investigados. Enquanto isso, também foram determinadas a expressão da proteína RRM1 eo resultado de 67 pacientes do GC de City of Hope National Medical Center (COH). Os resultados foram ainda mais validado em 322 pacientes do GC da Affiliated Sir Runrun Shaw Hospital da Universidade de Zhejiang (ZJU). Nossos resultados sugerem que RRM1 prediz a sobrevivência pobre em GCs e poderia servir como um biomarcador prognóstico e alvo terapêutico em pacientes GC.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

O protocolo este estudo foi analisado e aprovado pelo conselho de revisão institucional (IRB) do City of Hope National Medical Center e da Universidade de Zhejiang, respectivamente. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes que participaram deste estudo. As amostras GC elegíveis foram coletadas de City of Hope National Medical Center (COH set) e da Affiliated Sir Runrun Shaw Hospital, Universidade de Zhejiang (ZJU set), respectivamente.

Pacientes

Os critérios de inclusão para os participantes incluíram o seguinte: (i) adenocarcinoma gástrico com um diagnóstico patológico; (Ii) o consentimento informado ou dispensa de autorização fornecida pelo paciente; e (iii) acompanhar as informações disponíveis. Foram excluídos os pacientes do GC com (i) falha em fornecer o consentimento informado; (Ii) não-adenocarcinoma ou vários tipos de câncer; (Iii) não amostra de tecido obtida; (Iv) perda de contato após a cirurgia; ou (v) estágio IV GC sem cirurgia paliativa. O conjunto COH incluiu uma série de 67 pacientes GC elegíveis que receberam a cirurgia com R0 (58 casos), R1 (8 casos) ou R2 (1 caso) ressecção em City of Hope Centro Nacional de Medicina de janeiro de 1989 a dezembro de 2006. Os participantes no o conjunto COH consistiu de 51 brancos, 2 afro-americanos e 14 asiáticos. No conjunto ZJU, elegíveis 322 pacientes do GC (242 casos com ressecção R0, 67 casos com R1 ressecção e 13 casos com R2 ressecção) foram inscritos. Eles foram obtidos sua operação cirúrgica durante 1997 a 2001. Todos os pacientes do GC no conjunto ZJU foram asiática (chinesa). No conjunto ZJU, 153 de 322 pacientes tiveram pós-operatório quimioterapia adjuvante. Os regimes de quimioterapia de combinação incluídos ácido folínico, 5-fluorouracil e oxaliplatin (FOLFOX6; 73 casos); epirubicina, oxaliplatina e Xeloda (EOX; 12 casos); 5-fluorouracil, epidoxorubicin e mitomicina C (FEM; 9 casos); etoposido, leucovorina e 5-fluorouracilo (ELF; 38 casos); mitomicina C e 5-fluorouracilo (MF; 4 casos); e outros (oral S-1 /x, à base de docetaxel e outros protocolos; 17 casos). Todos os pacientes foram acompanhados até janeiro de 2012. Os detalhes das informações demográficas e clínico-patológico foram atualizados. Os dados do estágio TNM para os participantes foram obtidos a partir dos diagnósticos clínicos e patológicos e determinado de acordo com as diretrizes de NCCN para GC (versão 2, 2011). As amostras de tecidos humanos examinados neste estudo foram obtidos a partir de cirurgia e armazenado à temperatura ambiente depois fixadas em formalina e parafinização. resultado de correlação tempo de armazenamento exibido não afetou a expressão RRM1 em significância estatística (

p Art 0,05).

Estudo Design by

Este foi um estudo de resultados retrospectiva. O tamanho da amostra foi estimado usando nQuery Advisor 6.01 (Statistical Solutions Ltd, Saugus, MA, EUA) software. Com base neste cálculo, um tamanho de amostra de 300 participantes atinja 95% da potência do estudo (α de dois lados = 0,05). As informações demográficas e clínico-patológico foram extraídos através de cuidadosa revisão de prontuários. Todos os pacientes foram acompanhadas periodicamente para dados de sobrevivência; pacientes com operações curativas também foram acompanhados por sobrevida livre de recorrência. O período de acompanhamento foi calculado a partir da data da cirurgia até a data do último contato. A sobrevivência livre de doença foi definida como o tempo desde a cirurgia inicial a recorrência do tumor. Metástase ou recorrência local foi considerado evidência de recorrência tumoral. Somente mortes por GC foram considerados o ponto final da sobrevivência específica da doença. As variáveis ​​analisadas incluíram a data de nascimento, sexo, data do diagnóstico, data e tipo de operação, tipo de quimioterapia, fase TNM, recidiva /status metástase, data de recidiva /metástase e estado clínico no último seguimento.

a imuno-histoquímica (IHQ) foi utilizado para determinar a expressão da proteína, em RRM1 (FFPE) amostras de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina humanos. Para evitar desvios sistémicos, os anticorpos foram validados, e as condições de IHC foram optimizadas utilizando uma placa de tecido de controlo. Para normalizar as condições de reacção, todas as amostras de tecido FFPE do conjunto ZJU foram reagrupados em várias matrizes de tecido. Além disso, uma placa de controlo de múltiplos tecidos FFPE foi incluída para cada coloração IHC. Para reduzir o viés leitor de imagem, um sistema de imagem automatizado foi usado para obter imagens digitais dos cortes corados para análises quantitativas subseqüentes. Cada amostra foi avaliada por dois investigadores independentes, de forma duplo-cego.

Todos os dados demográficos, informações clínico-patológico, e os resultados IHC foram codificados e entrou em um banco de dados GC. duplo controlo de entrada de dados e de lógica foram utilizados para a redução de erros. Microsoft Office Access® foi usado para criar as bases de dados. Os casos omissos foram marcados com o código apropriado “em falta”. JMP Software 8.0 (SAS Institute, Cary, NC, EUA) e o GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc, La Jolla, CA, EUA) foram utilizados para a análise estatística e trama curva de sobrevivência. modelos de regressão logística multivariada foram usados ​​para ajustar os efeitos covariáveis ​​sobre a razão de chances (OR). A análise de Kaplan-Meier e um modelo de riscos proporcionais de Cox foram aplicadas para a sobrevida global (SG) e sobrevida livre de progressão (PFS) analisa. Multivariada e estratificação foram aplicados para reduzir o impacto dos efeitos de confusão na estimativa de taxas de risco (HR).

quantitativos IHC Ensaios

IHC foi utilizado para investigar a expressão da proteína RRM1. A precisão de IHC foi validado por RT-PCR quantitativo (qRT-PCR) em duas amostras paralelas. Resumidamente, após desparafinização, a actividade da peroxidase endógena foi bloqueada com 3% H

2O

2 (peróxido de hidrogénio). As lâminas de matriz foram depois incubadas com soro de cabra normal durante 20 minutos, e em seguida aplicou-se o anticorpo primário durante 20 minutos à temperatura ambiente. Após 7 minutos de H

2O

2 tratamento, as lâminas de matriz foram incubadas com anticorpos correspondentes peroxidase marcados para 30 minutos. DAB (3,3′-diaminobenzidina, DAB 0,05 g e 100 mL de 30% de H

2O

2 em 100 ml de PBS) foi aplicado durante 5 minutos e novamente por 10 minutos. Cada lâmina foi então contrastadas com hematoxilina (DAKO). PBS foi usado como um controlo negativo.

Anticorpos

Um anticorpo monoclonal de rato produzido comercialmente foi usado contra RRM1 humana no presente estudo. A produção de anticorpos foi RRM1 base para o nosso protocolo padrão anterior [33]. Anti-hRRM1 hibridomas produtores de anticorpos foram rastreados primária por ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA). Os clones foram escolhidos com base na sua actividade em tecidos humanos embebidos em parafina. RRM1 expressão foi quantificada por um sistema de classificação visual com base na extensão da coloração. Ambos imunorreactividade no núcleo e no citoplasma foram avaliados. Cada imagem foi avaliada com base nas seguintes categorias: a localização subcelular (por exemplo, vs citoplasma núcleo), a intensidade da coloração (por exemplo, densidade óptica integrada), e /ou a percentagem de células coradas (por exemplo, área total e percentagem de células positivas). Com base na intensidade do sinal, expressão RRM1 foi classificada como negativa (0), fracamente positivo (1), positivo (2) ou fortemente positiva (3). Uma pontuação RRM1 de 0 ou 1 foi designado RRM1-baixa, e uma pontuação de 2 ou 3 foi classificada como RRM1-alta. Porque os nossos dados produziu resultados consistentes entre RRM1 citoplasmática e RRM1 nuclear, considerou-se tanto uma alta nuclear ou de uma alta pontuação citoplasmática como RRM1 de alta na Kaplan-Meier e Cox analisa.

Os anticorpos contra p-MEK, p -ERK, NF-kB, Ras, Sp-1 e de Ki67 foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology, Santa Cruz, Invitrogen, Millipore, Abcam e BD Bioscience, respectivamente.

Construção e transfecção de plasmídeo

O plasmídeo hRRM1 (pEBG-RRM1) foi construído e consta em nosso estudo anterior [34]. O plasmídeo foi transfectado com X-treme GENE HP ADN Transfection Reagent (Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante para as células AGS. Resumidamente, 2 ^ g de plasmídeo foram misturados com 6 uL de X-treme HP gene em 200 uL de meio isento de soro, após incubação à temperatura ambiente durante 15 minutos. A mistura foi adicionada a 2 x 10

5 células pré-plaqueadas AGS em uma placa de 6 poços. Após a transfecção de 48 horas, as células foram recolhidas.

Cultura celular e ARN de interferência

O GC humano linhas celulares AGS e NCI-N87 foram obtidas da American Type Culture Collection e cultivadas em F- forma 12K (AGS) ou meio RPMI-1640 (NCI-N87) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (MP Biomedicals, Costa Mesa, CA, EUA) e 1% de penicilina e estreptomicina numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2 a 37 ° C.

RRM1 siRNA (SC-37640) e precipitação siRNA (SC-44233) foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology Inc. As transfecções foram realizados com Lipofectamine ™ RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), de acordo com as instruções do fabricante.

In vitro

Ensaio de Proliferação

o

in vitro

ensaio de proliferação foi realizada de acordo com o nosso estudo anterior [15]. Resumidamente, 0,5 × 10

4 AGS e 2,0 × 10

4 células NCI-N87 foram pré-plaqueadas em poços de um dispositivo de 16 poços compatíveis com uma detecção electrónica de células em tempo real W200 (RT-CES) analisador e 16 × estação (ACEA Biosciences, San Diego, CA, EUA). O “índice de células” (impedância normalizada) foi calculado periodicamente (tipicamente, a cada 30 minutos) de acordo com o crescimento das células em cada poço. A menos que indicado de outra forma, quatro réplicas foram feitas para cada grupo de tratamento com siARN. inibição RRM1 foi medida por western blot.

In vitro

Invasion Ensaio

câmaras de invasão Matrigel foram adquiridos da BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, EUA). Em primeiro lugar, uma membrana de policarbonato de 8 mm de porosidade foi coberto com 1 ml de meio isento de soro contendo 1 × 10

5 células por poço. As placas foram então incubadas com um quimio-atractor (20% de meio de FBS) durante 24 horas a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora. O meio foi então removido, e as células não invasoras foram suavemente raspadas com um raspador de células. O filtro foi então lavado duas vezes com PBS e coradas com 0,5% de azul de metileno durante 4 horas. As células que passaram através do filtro e aderidas à superfície inferior foram contadas utilizando microscopia óptica.

Gelatina zimografia

Um ensaio de zimografia de gelatina foi realizada para investigar a influência de RRM1 sobre a secreção de activa MMP-9. Resumidamente, as células foram cultivadas até 70% de confluência, lavou-se duas vezes com 1 x PBS, e incubadas em meio isento de soro. Após 24 horas, o meio condicionado foi recolhido e concentrado com um filtro de centrífuga (Millipore, MA, EUA) sob a 6000 g durante 15 minutos. As amostras concentradas foram preparados na redução não-tampão de amostra (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Proteínas (20 uL /​​pista) foram separados utilizando SDS-PAGE em géis contendo 1 mg /mL de gelatina (Novex 10% de gelatina de gel, Invitrogen). Os géis foram renaturadas durante 1 hora à temperatura ambiente em 1 × tampão de renaturação (Invitrogen). Em seguida, os géis foram incubados durante a noite a 37 ° C em 1 × tampão de desenvolvimento (Invitrogen). O gel foi corado com azul de Coomassie. O brilho das bandas claras, onde MMP9 foi localizado e a gelatina foi degradada, foi analisada por meio da densitometria.

Ensaio de Actividade de Ras

actividade

Ras foi medida utilizando um kit de Ensaio de Actividade de Ras (Millipore, MA, EUA). Em primeiro lugar, activa Ras (Ras de GTP-ligado) foi ligada ao domínio de ligação Raf-1-Ras (RBD) conjugado com esferas de agarose através da incubação de lisados ​​de células a 4 ° C durante 45 minutos. Em seguida, a Ras activado foi libertado para o tampão de amostra de SDS-PAGE após extensa lavagem das pérolas de agarose (três vezes) com tampão de lavagem (HEPES 25 mM (pH 7,5), 10 mM de MgCl

2, 150 mM de NaCl, 1 mM EDTA, 1% de Nonidet P-40, 1 mM de Na

3VO

4, 10% de glicerol, 10 ug /mL de leupeptina, 10 ug /ml de aprotinina e 25 mM de NaF). A quantidade de Ras foi detectada com anticorpo pan-Ras monoclonal.

Medição da Piscina dNTP

Este ensaio foi realizado de acordo com o método de Sherman e Fyfe [35]. O volume reaccional total foi de 50 ul. A mistura de reacção continha 10 mM de MgCl

2, 0,25 pM molde /iniciador, Tris-HCl a 50 (pH 7,5), DTT 5 mM, 1,25? M [

3H] dATP (para o dCTP, dGTP, e dTTP ensaio) ou [

3H] dTTP (para o ensaio de dATP) e 0,2 unidades de Sequenase (2.0). A mistura de reacção foi incubada à temperatura ambiente durante 20 minutos, e, em seguida, a reacção foi parada com gelo. Após a reacção, 40 uL alíquotas foram removidas e manchados em circulares (diâmetro de 2,4 cm) papéis Whatman DE81 de permuta iónica. Os papéis foram secos, lavado (3 x 10 minutos) com 5% de Na

2HPO

4, e lavadas uma vez com água destilada e mais uma vez com etanol a 95%. Cada papel foi seco e depositado num tubo de ensaio pequeno; 7 ml de Ecolume foi então adicionada a cada tubo. Um contador de cintilação líquida (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, EUA) foi utilizado para contar os dNTP marcado com trítio. As amostras padrão foram 0,25, 0,5, 0,75 e 1,0 pmol.

Resultados

Validação da especificidade dos anticorpos RRM1 nas amostras gástrica Adenocarcinoma

A especificidade do RRM1 anticorpos foi validado por um ensaio de bloqueamento de péptidos. Os anticorpos foram diluídos (1:1000), pré-incubadas com o péptido RRM1 recombinante (1 ng /mL) a 4 ° C durante a noite, e então visualizadas por análise de Western. Na Fig. 1

A

, um sinal dominante de um anticorpo RRM1 elegíveis poderia ser visto por western blot e foi diminuiu com knockdown RRM1 nas células AGS. Entretanto, o sinal foi especificamente bloqueada por RRM1 péptido recombinante, o que indica a especificidade dos anticorpos RRM1.

Um

. ensaio de bloqueamento do péptido foi realizado com os anticorpos RRM1 para coloração IHC, todos os anticorpos foram em 1:1000 diluição e incubadas com o péptido RRM1 recombinante (1 jig /ml) a 4 ° durante a noite. Antibody # 2 mostrou sinal mais específico e mais forte do que outros anticorpos (dados não mostram), portanto, ele foi usado como o anticorpo para a coloração IHC.

B

. fraccionamento nuclear foi empregue em células AGS. células AGS foram deixados em jejum durante 96 horas e re-suplementado com meio de crescimento normal durante 12 horas. Em seguida, as células foram recolhidas e fraccionadas para a proteína nuclear. Western blot foi aplicado para revelar a localização sub-celular de RRM1, GAPDH e Sp-1 foram utilizados como marcadores nucleares e citoplasmáticos.

C

. A translocação da RRM1 do citoplasma para núcleo foi observado por citoquímica imuno-fluorescência. células AGS foram deixados em jejum durante 48 horas e re-suplementado com meio de crescimento normal durante 12 horas. Em seguida, as células foram fixadas e incubadas com anticorpos primários e secundários. A translocação da RRM1 foi observada por microscopia de fluorescência.

D

. RRM1 foi heterogênea expressa entre tecido normal e histológicos subtipos adjacentes (classificação JGCA V.2011), incluindo papilar, tubular, mucinoso celular e anel de sinete e adenocarcinoma indiferenciado.

Uma vez que diferentes padrões de RRM1 expressão foram relatados , a localização de RRM1 foi adicionalmente investigada. Em células normais, RRM1 foi predominantemente expresso no citoplasma (Fig. 1

B

). Um ensaio de marcação por fluorescência também confirmou que a proteína RRM1 acumulada no citoplasma após 48 horas de privação de soro. No entanto, RRM1 translocado para dentro do núcleo em resposta ao soro re-suplementação durante 12 horas (Fig. 1

C

). Portanto, tomamos tanto citoplasma e coloração nuclear de RRM1 em consideração ao interpretar a coloração IHC.

RRM1 foi heterogênea expressa entre os subtipos de tecido GC (Fig. 1

C

). RRM1 foi preferencialmente expresso em tecido canceroso (47,0% RRM1-alto) ao longo dos tecidos normais adjacentes, em amostras de GC (25,4% RRM1 de alta). De acordo com a classificação JGCA [36], adenocarcinoma gástrico foi classificado em cinco subtipos histológicos. RRM1 foi altamente expressa na papilar (61,9%), tubular (59,6%) e adenocarcinomas indiferenciados (55,4%), mas relativamente menor no mucinoso (34,4%) e subtipos de adenocarcinoma de células em anel de sinete (14,3%).

RRM1 promove o crescimento celular através da Ras /Raf /MAPK via de sinalização em GC

o mamífero RNR grande subunidade R1 (R1) suprime malignidade em Ras transformado rato 3T3 [21]. p-ERK é um componente importante a jusante regulada pela transdução de sinal de Ras /Raf. Portanto, para estudar a relação entre RRM1 e agressividade GC, medimos p-ERK em amostras de parafina 32 dos pacientes do GC. A coloração IHC indicou que a expressão RRM1 foi concordante associados ao nível de p-ERK em amostras de GC (Fig 2

A

,

esquerdo do painel

). A correlação foi estatisticamente significativa (Fig 2

A

,

direito painel

). Além disso, o gene transferência experimento indicaram que maior expressão RRM1 aumento da expressão de p-ERK nas células AGS (Fig 2

B

,

painel superior

) e promoveu o crescimento de células

in vitro

(Fig 2

B

,

painel inferior

). Para determinar se RRM1 regula /Raf sinalização /MAPK Ras, nós regulada para baixo expressão RRM1 por siRNA em células AGS e NCI-N87. Precipitação siARN foi utilizado como um controlo negativo. A análise por Western blot indicou que RRM1 foi especificamente reduzida pelo siARN correspondente (Fig. 2

C

). Juntamente com a redução de RRM1, os sinais para a p-MEK, p-ERK e NF-kB foram diminuiu significativamente; atividade Ras /Raf também caiu notavelmente em ambos os AGS e células NCI-N87. As observações acima ilustram que RRM1 pode promover a proliferação de células GC ativando /sinalização de Ras Raf /MAPK.

A

, RRM1 superexpressão foi encontrado para ser acompanhado com alta expressão de p-ERK no GC pacientes (

p Art 0,01, n = 32), janelas 1-4 mostram imagens representativas de p-ERK e RRM1 corresponsive coloração em 2 tecidos cancerosos de dois pacientes representativos (PIC 1-2: GC No1; pic 3-4: GC NO2).

B

, superexpressão de RRM1 (ambos ectópica e RRM1 endógeno) através da transfecção de pRRM1 (pEBG-RRM1) promove o crescimento celular AGS; p-ERK também foi regulado para cima posteriormente.

C

, RRM1 foi regulada para baixo com siRNA em duas linhas de células de GC, AGS e NCI-N87. As células foram recolhidos e analisados ​​por transferência de Western e kit de actividade de Ras (Millipore, MA). A atividade Ras-Raf foi severamente diminuída e assim foram as proteínas a jusante p-MEK, p-ERK e c-NFkB.

Expression RRM1 está associado com câncer gástrico Agressividade

Para explorar ainda mais as conclusões anteriores, a expressão da proteína RRM1 foi medida nas amostras de GC. Com base na coloração IHC, 22 de 67 GCs no conjunto de COH e 156 322 de GC no conjunto ZJU eram ou citoplasmática ou nuclear RRM1-elevado (Tabela 1). No COH e conjuntos ZJU, RRM1 de alta foi mais freqüente em homens do que mulheres e mais propensos a alcançar significância estatística no conjunto ZJU (

p Art 0,01). Houve mais proximal GC (44,8%) no conjunto de COH, mas mais distai GC (52,5%) no conjunto ZJU. expressão RRM1 foi significativamente maior nos GCs proximais (

p Art 0,05) no conjunto de COH, e uma tendência semelhante foi observada no conjunto ZJU (

p

= 0,31). Enquanto isso, RRM1 foi associado com o número de nódulos linfáticos envolvidos, tamanho do tumor, expressão de Ki67, subtipo histológico e grau histológico no conjunto ZJU (

P

0,05 para cada um). Devido ao pequeno tamanho da amostra, não foi observada significância estatística para os fatores acima no conjunto de COH, mas tendências semelhantes poderia, obviamente, ser visto.

Para investigar se RRM1 foi associada com a agressividade GC, um análise logística multivariada não condicional foi realizado. Aqui, o estágio TNM foi considerada a saída (fase III IV vs. estágio I II), e o odds ratio (OR) para RRM1 (RRM1 de alta vs. RRM1-baixo) foi ajustado para co-fatores, incluindo idade, sexo, localização do tumor e grau histológico. O RRM1 OR ajustado para (IC95% 1,09-2,94) 1,78 no conjunto ZJU. Estes resultados indicam que a expressão alta RRM1 foi associada com o estágio TNM avançado em GC.

RRM1 superexpressão está associada à pior sobrevida em pacientes GC

Porque RRM1 está associada com o estágio TNM avançado de GC, Kaplan -Meier análise e um modelo de risco proporcional de Cox foram empregues para determinar o impacto de RRM1 sobre o resultado de GC. No conjunto COH, o maior tempo de seguimento foi de 228 meses; 53 de 67 pacientes GC morreu de desordens relacionadas com o GC, e 34 pacientes tiveram uma recorrência. No conjunto ZJU, o maior tempo de seguimento foi de 179 meses; um total de 175 dos 322 pacientes GC morreu de GC, e 87 pacientes tiveram uma recorrência. Resultados consistentes com aqueles foram observados para RRM1 citoplasmática (HR = 1,62; IC 95% 1,20-2,20) e RRM1 nuclear (HR = 1,61; IC 95% 1,19-2,18). Portanto, ou alta expressão RRM1 nuclear citoplasmática ou alta foi considerada na análise a seguir.

A Kaplan-Meier análises indicaram que RRM1 de alta foi significativamente relacionado à má OS e PFS na COH e conjuntos ZJU (log rank

p Art 0,01 ou

p

= 0,03) (Fig 3

A Restaurant –

D

).. O tempo médio de sobrevivência para o subconjunto RRM1 de baixa foi de 28 meses no conjunto de COH e 42 meses no conjunto ZJU. Para o subconjunto RRM1-alta, o tempo médio de sobrevivência foi significativamente reduzida para 12,5 e 23 meses no COH e ZJU define, respectivamente. Resultados semelhantes foram obtidos na análise de PFS. RRM1 de alto aumentou significativamente o risco de recorrência GC em ambos os conjuntos (log rank

p Art 0,01 no conjunto COH e

p = 0,03

no conjunto ZJU)

A

. A análise de Kaplan-Meier para OS foi apresentado como RRM1 de alta

vs.

RRM1 de baixa para aumentar o poder do estudo em conjunto COH.

B

, A análise de Kaplan-Meier para OS foi realizado em conjunto ZJU. A análise de Kaplan-Meier para PFS foi realizada em

C

(conjunto COH) e

D

(conjunto ZJU). As análises multivariadas de Cox para OS de GC foram mostrados na

E e

F Compra de COH e ZJU definir respectivamente. A taxa de risco (HR) de RRM1 foi baseada em RRM1 de alta

vs

RRM1-baixo.; localização do tumor foi proximal

vs

. corpo

vs

. distal Todo; Ki67 foi positivo

vs

. negativo; estágio do tumor era Estágio I II

vs

. III IV; o grau do tumor foi baixa

vs

. moderada

vs

. Alto; Sexo era do sexo masculino

vs

. fêmea; A idade foi baseada na per mudanças de unidade. O “*” foi usado para indicar significância estatística (

p Art 0,05)

Para evitar efeitos de confundimento, uma análise multivariada de Cox foi realizada usando o COH e ZJU define (. Fig. 3

e e 3F

). No conjunto COH, os fatores TNM fase, localização do tumor, o grau do tumor, nível de Ki67, sexo e idade foram aplicados para ajustar o HR. Tal como ilustrado nas Figs. 3

E e 3F

, RRM1 e estágio TNM foram significativamente associados com a má OS de pacientes GC na COH e conjuntos ZJU. HRS para RRM1 eram 2,55 (IC de 95% 1,27-5,15) e 1,51 (IC de 95% 1,07-2,13) ​​no COH e ZJU define, respectivamente. Ki67 tem sido amplamente utilizada como um biomarcador proliferação de células de câncer, mas ele não conseguiu prever o resultado de GC na COH e ZJU define.

O desempenho prognóstico de RRM1 em GCs avançadas

Para avaliar melhor o desempenho prognóstico da RRM1 em subgrupos de GC, foi realizada uma análise de estratificação. Aqui, nós não relatar os resultados de estratificação do conjunto de COH por causa do pequeno tamanho da amostra (total de 67 casos). Na Fig.