Abstract

Fundo

O carcinoma hepatocelular (HCC) é o câncer primário de fígado ocorre mais comumente e classifica como o quinto câncer mais frequente, em geral, e a terceira principal causa de mortes por câncer , no mundo todo. No momento, as opções terapêuticas eficazes disponíveis para HCC são limitados; consequentemente, o prognóstico para estes pacientes é pobre. Nosso objetivo no presente estudo foi o de identificar um novo alvo para terapia de anticorpo contra HCC.

Metodologia /Principais Achados

Nós usamos Western blot e citometria de fluxo e imunocitoquímica análises para investigar a regulação do FGFR1 expressão de interferão-α /β em várias linhas de células de cancro hepático humano. Além disso, testou-se a eficácia do tratamento combinado com anticorpo monoclonal anti-FGFR1 e interferão-α /β num modelo de xenoenxerto de carcinoma hepatocelular humano murino. Verificou-se que o interferão-α /β induz a expressão de FGFR1 em linhas celulares de carcinoma hepatocelular humano, e que um anticorpo monoclonal anti-FGFR1 (mAb) a segmentação do FGFR1 induzida pode inibir eficazmente o crescimento e sobrevivência das células de CHC

In vitro

e

in vivo

. Além disso, a combinação de interferão-α, anti-mAb de FGFR1 e células mononucleares de sangue periférico (PBMC) exerceu um efeito anti-tumor significativo em>

Conclusões

Os nossos resultados sugerem que a utilização combinada de um anticorpo anti-FGFR1 e interferão-α /β é uma abordagem promissora para o tratamento de HCC

citação:. Sasaki S, Ishida T, Toyota M, Ota a, Suzuki H, Um Takaoka et al. (2011) Interferon-α /β e Células de Factor de Crescimento anti-Fibroblasto Receptor 1 Anticorpo Monoclonal Cancro Reprimir hepática in vitro e in vivo. PLoS ONE 6 (5): e19618. doi: 10.1371 /journal.pone.0019618

editor: Jovem Nyun Park, Yonsei University College of Medicine, República da Coreia

Recebido: 09 de outubro de 2010; Aceito: 11 de abril de 2011; Publicado em: 09 de maio de 2011

Direitos de autor: © 2011 Sasaki et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado em parte pelas bolsas-in-Aid para a Investigação científica em Áreas prioritárias do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia (17016060 para KI e TI); Grants-in-Aid para a Investigação Científica (C) da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (21.590.853 para SS); Grant-in-Aid para a Investigação exploratória da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (17659218 a SS e KI). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Competir interesses:. A. Ota, M. Maeda, T. Seito são funcionários da Imuno-Biológica Laboratories Co., Ltd. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas sobre a partilha de dados e materiais com outros investigadores.

Introdução

o carcinoma hepatocelular (HCC) é o mais comumente ocorrem câncer primário do fígado e classifica como o quinto câncer mais frequente, em geral, e a terceira principal causa de mortes por câncer, em todo o mundo [1]. Actualmente, a cirurgia, terapias percutâneas, tais como a injecção de etanol e ablação por radiofrequência, e terapias de transcateter como quimioembolização arterial são empregues no tratamento da HCC. Estas abordagens podem remover e matar selectivamente as células cancerosas, o que os torna úteis para o controle do local do tumor; no entanto, eles não são suficientes para melhorar o prognóstico de pacientes com CHC, como a doença facilmente se repete devido a metástases nascidos de sangue (por exemplo, metástase intra-hepática e infiltração vascular) ou o desenvolvimento de novas HCC (carcinogênese multicêntrico). Consequentemente, os 1 ano e 3 anos as taxas de sobrevivência para HCC são apenas 36% e 17%, respectivamente [2]. As fraquezas dos actuais tratamentos HCC incluem a inibição incompleta de carcinogênese multicêntrico, dificuldades em controlar a infiltração intraportal, ea incapacidade de evitar a deterioração da reserva funcional hepática ou promover sua restauração. Assim, o desenvolvimento de novos tratamentos que melhoram o prognóstico dos pacientes com CHC e que também pode ser usado em pacientes em estágio idosos e avançados seria altamente desejável.

Segmentação moléculas da superfície celular utilizando mAbs é uma estratégia emergente na terapia do cancro, e mAbs contra moléculas de superfície relacionadas com o cancro, tais como EGFR, HER2 e CD20 foram empregues com sucesso [3], [4], [5]. No entanto, a expressão à superfície celular de moléculas antigénicas é muitas vezes fraca e heterogénea, o que impede o direccionamento eficaz de tumores [6] e, até à data, apenas alguns estudos-piloto de análise de expressão de antigénios de HCC-associados foram realizadas [7].

os interferões (IFNs), que são amplamente utilizados para o tratamento de neoplasias e doenças virais, aumentar a expressão de várias moléculas da superfície celular, tanto in

in vitro

e em modelos de tumor de xenoenxerto de [8], [9 ]. A indução da expressão do gene por IFN é um fenómeno complexo que envolve a activação de genes alvo através da fosforilação da cinase JAK Estatísticas por [10]. Além disso, o IFN pode induzir a expressão de factores reguladores do interferão (IRFs) e factores de transcrição, que induzem, em seguida, os genes envolvidos na apoptose e respostas imunes [11]. Os IFNs já estão a ser utilizados para tratar a maioria dos pacientes com hepatite, e os seus efeitos sugerem segmentação moléculas de superfície celular induzida por IFN podem ser uma estratégia útil para o tratamento da HCC. Nosso objetivo neste estudo foi a utilização de linhas de células de carcinoma hepatocelular e um modelo de xenotransplante murino de HCC humana para examinar as mudanças na expressão genética induzida por IFN e identificar potenciais alvos para a terapia de anticorpos. Os nossos resultados sugerem /receptor de crescimento de fibroblastos de IFN-α induzida por factor de β 1 (FGFR1) poderia ser um novo alvo terapêutico para o tratamento da HCC.

Resultados

A indução da expressão de IFN-y por FGFR1 α /β em xenoenxertos HCC

Para identificar genes up-regulada por IFN em células de carcinoma hepatocelular, foi realizada uma análise de microarray usando cDNA preparadas a partir de tumores cultivados em ratinhos SCID subcutaneamente administradas células HepG2, uma linha de células de cancro hepático humano. Os resultados da análise de micromatriz encontram-se resumidos na Figura 1A. Entre os genes supra-regulados por IFN foi

FGFR1

, que codifica um receptor da tirosina quinase. a análise por PCR em tempo real confirmou indução de

FGFR1

transcrição por tanto IFN-α e IFN-β (Figura S1), e aumentos correspondentes na proteína de FGFR1 foram observados em células HepG2, Huh-7 e células CHC4 (Figura 1B -D). Em seguida, coloração imuno-histoquímica utilizada para examinar a distribuição de IFN-α /FGFR1 induzida por β dentro dos tumores e descobriram que os níveis de FGFR1 foram aumentadas na membrana celular e no citoplasma de células de carcinoma hepatocelular (Figura 1E).

a, Síntese de genes induzidos por IFN-α em linhas de células de cancro hepático e HepG2-xenoenxertos. A expressão de genes induzidos por IFN-α foi examinada utilizando a análise de matriz de ADN e a expressão de

FGFR1

foi encontrado para ser fortemente induzido. B, mancha de Western mostrando a expressão de IFN-α /induzida por β de FGFR1 em células de cancro hepático humano. Os níveis de proteína relativos são indicados a seguir. C, a análise de citometria de fluxo que mostra o IFN-α /expressão induzida por β de FGFR1 em células de cancro hepático humano: preto e sem anticorpo; verde, sem IFN; Rosa, IFN-α; Azul, IFN-β. D, Western blot que mostra a evoluo no tempo da expressão de FGFR1 após o tratamento com IFN-α /β. Os imunoblots foram feitas utilizando lisados ​​totais de HepG2-xenoenxertos. E, o IFN-α /β induzida por expressão de FGFR1 em tecidos excisados ​​de HepG2-xenoenxertos. FGFR1 foi corado com o anticorpo anti-FGFR1.

Desenvolvimento de um anticorpo monoclonal anti-FGFR1

Nós desenvolvemos romance anti-FGFR1 mAbs através da imunização de camundongos BALB /c com um vector de expressão FGFR1 . Seis anticorpos que reconhecem FGFR1 foram isolados a partir dos ratinhos, dois dos quais, designados A2C9-1 e A2D11-1, mostraram forte afinidade em ELISA e foram caracterizados adicionalmente. Para análises de cinética, o domínio extracelular de FGFR1 foi covalentemente acoplado a um chip sensor CM-5 a uma densidade baixa (215 unidades de resposta de FGFR1), depois do qual foram determinados os valores de Kd para A2C9-1 e A2D11-1 ser 209 nM e 7,03? M, respectivamente (Figura S2a). Assim A2C9-1 mostrou a afinidade mais forte para FGFR1. A análise de citometria de fluxo confirmou que A2C9-1 reage com FGFR1 (Figura 2), e análise de Western blot mostrou que o peso molecular do FGFR1 expressa ectopicamente para ser cerca de 115 kDa (Figura S2B).

análise de citometria de fluxo mostrando a nível de expressão de FGFR1 e especificidade de mAb A2C9-1. Esquerda: os gráficos mostram os resultados obtidos com os lisados ​​de células NIH3T3 em que introduzido ADNc M19B2 (controlo). Direita: os gráficos mostram os resultados com lisados ​​de células NIH3T3 na qual full-length cDNA FGFR1 foi introduzido

Anti-FGFR1 mAbs inibir o crescimento celular HCC in vitro

A seguir examinados. os efeitos de mAbs A2D11-1 A2C9-1 e sobre o crescimento de células de cancro hepático (Figura 3). IFN-α mostrou alguma actividade anti-tumor contra as células de cancro hepático, e supressão do crescimento fraco foi observado quando A2C9-1 ou A2D11-1 foi adicionado a culturas na ausência de IFN-α. Por outro lado, o tratamento com uma combinação de A2C9-1 e IFN-a reduziram significativamente a sobrevivência das células, em comparação com o tratamento com IFN-α sozinho (

P

= 0,01) (Figura 3). O efeito de A2D11-1 em combinação com IFN-α não era maior do que o efeito de IFN-α sozinho.

No gráfico, a taxa de sobrevivência entre células HepG2 cultivadas HCC é mostrada no eixo vertical, e o tempo de incubação após administração dos fármacos indicados é mostrado no eixo horizontal. PBS representa o controlo negativo. Símbolos e barras representam médias ± DP. Note-se que o tratamento com uma combinação de A2C9-1 e IFN-a reduziram significativamente a sobrevivência das células, em comparação com o tratamento com IFN-α sozinho (

P

= 0,01).

Efeitos de A2C9-1 com e sem IFN-α num modelo de tumor de xenoenxerto de ratinho

a seguir testou os efeitos antitumorais de um mAb anti-FGFR1 num modelo de xenoenxerto de ratinho de carcinoma hepatocelular humano (Figura 4A e B). Nos ratinhos tratados apenas com A2C9-1 ou IFN-α, os volumes dos tumores não foi diferente entre o grupo de controlo que se administrou PBS. No entanto, o tratamento com IFN-α + A2C9-1 teve um efeito inibidor sobre o crescimento do tumor, apesar da supressão não foi estatisticamente significativa. Finalmente, nos ratinhos tratados com IFN-a + A2C9-1 + PBMC (células mononucleares do sangue periférico), houve um efeito significativo anti-tumor, em comparação com grupos tratados com PBS (p = 0,026), INF-α (p = 0,03) , A2C9-1 (p = 0,014), as PBMC (p = 0,022) ou IFN-a + PBMC (p = 0,007). Na verdade, o tumor desapareceu em 2 dos 4 animais testados. Durante o curso dos experimentos que detectada nenhuma citotoxicidade contra hepatócitos normais (dados não mostrados). A análise histológica revelou infiltração acentuada pelas células mononucleares dos tecidos tumorais residuais a partir de ratinhos tratados com IFN-a + PBMC A2C9-1 +, mas não foi observada tal infiltração em tecidos de tumor de ratinhos nos outros grupos (Figura S3).

A, fotos representativas de enxertos de tumor em ratos SCID. B, No gráfico, os tamanhos dos tumores de cada grupo (n = 4 ratinhos por grupo) são apresentados no eixo vertical, e o tempo decorrido após o tratamento com os fármacos indicados e as células é mostrada no eixo horizontal. Símbolos e bares são médias ± SD. C, Os volumes dos tumores a seguir ao tratamento com a droga e as células indicados. PBS representa o controlo negativo. Os dados são médias ± DP.

IFN aumenta a acumulação de FGFR1 anti-mAb dentro dos tumores

Para confirmar ainda mais que a regressão observada dos xenotransplantes estava relacionada com o tratamento com A2C9-1 mAb, Alexa Fluor 680 conjugado com A2C9-1 foi injectada na veia da cauda de ratinhos SCID com tumor, após o que o direccionamento do tumor por A2C9-1 foi avaliada nos mesmos animais em diferentes pontos de tempo através de um sistema de imagiologia molecular óptico (Figura 5A e B). Nos ratinhos pré-tratados com IFN-α, A2C9-1 selectivamente e dependente do tempo acumulado dentro dos tumores durante o período de 24 h a 192 h após a sua administração. Em contraste, apenas níveis negligenciáveis ​​de mAb foi detectada em ratinhos de controlo administrados A2C9-1 + PBS. Nós também confirmou que não havia acumulação de um anticorpo de controlo 680 conjugado com Alexa Fluor (dados não mostrados). Parece, assim, que o IFN-α aumenta o acúmulo de anti-FGFR1 mAb

in vivo

, provavelmente por up-regulação FGFR1.

A, SCID foram xenoenxerto com 1 × 10

6 células HepG2, após o que 50 ug de mAb conjugado com Cy5 A2C9-1 foi intravenosamente administrados através da veia da cauda. Os ratinhos foram então fotografadas sob anestesia. B, curso Tempo da intensidade do sinal Cy5.

Discussão

Neste estudo, descobrimos que FGFR1 pode servir como um novo alvo para terapia de anticorpos no HCC. Mais especificamente, o tratamento combinado com IFN-α /β e um anti-FGFR1 mAb (A2C9-1) mostraram efeitos crescimento supressivos fortes em células do CHC humanos

in vitro

e

in vivo

. Cinco isoformas do receptor de transmembrana de FGFR (FGFR1-4 e FGFR5 /1L) são conhecidos a ser expresso em mamíferos [12]. Cada uma consiste de três domínios extracelulares semelhantes a imunoglobulina, um domínio transmembranar, e dois domínios de tirosina-quinase intracelular. FGF liga-se a FGFR através de dois dos domínios semelhantes a imunoglobulina (II e III). Durante a expressão de FGFR, splicing alternativo de

FGFR

transcritos produz múltiplos variantes de processamento com diferentes especificidades de ligando específico dos tecidos [13]. Entre eles, FGFR1 tem sido mostrado para ser expresso no carcinoma hepatocelular e é conhecido por promover o desenvolvimento de HCC em resposta à estimulação cancerígenas [14]. FGFR1 não é expresso em hepatócitos não cancerosas. a sinalização mediada pelo FGFR1 está envolvido no crescimento de células de cancro e infiltração, bem como na angiogénese [15], o que já é um alvo para terapias anti-tumor [16]. Além disso, estudos anteriores mostraram expressão elevada de ligandos de FGFR, incluindo FGF1 e FGF2, em tecidos de carcinoma hepatocelular primário e de linhas de células de cancro hepático [17], [18], [19], [20], sugerindo fortemente a sinalização do FGF desempenha uma tecla papel no desenvolvimento de HCC. Estas características fazem FGFR1 um alvo molecular atraente para o tratamento de HCC.

Um grande problema com a terapia de anticorpos contra o câncer é a expressão fraco e heterogêneo de antígenos de superfície celular. Para ultrapassar este problema, foram examinados os genes supra-regulados por IFN em xenoenxertos de carcinoma hepatocelular. Descobrimos que a expressão de FGFR1 é induzida por IFN-α /β e que o tratamento de células de carcinoma hepatocelular com uma combinação de IFN-α /β e um mAb anti-FGFR1 inibe eficazmente o crescimento e a sobrevivência de células CHC. Assim, uma razão para o efeito terapêutico insuficiente de fármacos anti-cancerígenos de segmentação FGFR1 parece ser é que, sem a indução, expressão de FGFR1 em células de cancro não é suficiente para um tratamento eficaz. Consistente com esta ideia, a nossa análise imuno-histoquímica mostrou expressão de FGFR1 ser muito baixa em células de carcinoma hepatocelular não tratados. Notavelmente, o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) são também sobre-regulada por IFN [21], e esta sobre-regulação de EGFR é um factor crucial subjacente à susceptibilidade das células cancerosas afectados à terapia anticorpo anti-EGFR [22]. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem o tratamento com uma combinação de IFN e um anticorpo pode ser uma estratégia terapêutica eficaz contra vários tipos de cancro.

O mecanismo molecular pelo qual IFN-α /β induz a expressão de FGFR1 permanece desconhecida. Sabe-se, no entanto, que os efeitos antitumorais e antivirais de IFN envolver alterações na regulação da transcrição de vários genes [23], e que os genes de IFN-indutível conter um elemento de resposta ao interferão (ISRE) nas suas regiões promotoras [24]. Usando um programa de busca de factor de transcrição, foram identificados vários ISREs putativos na 5 ‘UTR de FGFR1, sugerindo que FGFR1 poderia ser um alvo directo do IFN tipo I (dados não mostrados). Um estudo mais aprofundado será necessário determinar com precisão como o interferão induz FGFR1.

Nós também ainda não entender completamente o mecanismo molecular pelo qual o nosso anticorpo exerceu o seu efeito anti-tumor, embora existam várias possibilidades. Muitos dos alvos expressos-tumorais de anticorpos terapêuticos são receptores de factores de crescimento. Por exemplo, os anticorpos anti-EGFR, incluindo Cetuximab, têm sido mostrados para bloquear a sinalização do factor de crescimento, impedindo que o ligando se ligue ao seu receptor, ou por prevenção da dimerização do receptor [25]. É altamente provável que A2C9-1 suprime o crescimento de células de tumor através de um mecanismo semelhante, visando induzida por IFN FGFR1. Também foi relatado que a ligação de um anticorpo a um receptor do factor de crescimento resultados na internalização do complexo anticorpo-receptor, e a regulação negativa da sinalização a jusante [26]; No entanto, não se observou a internalização induzida por A2C9-1 em células cancerosas (dados não mostrados). Em terceiro lugar, os anticorpos contra receptores de factores de crescimento também exercem efeitos de crescimento suprimindo através do sistema imunitário [27]. Aqui, por exemplo, que mostrou que o IFN-α /β aumenta a expressão de superfície de FGFR1, talvez permitindo um efeito anti-cancro com base na citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos para acompanhar a ligação do mAb anti-FGFR1 ao receptor. Os resultados do nosso

in vivo

experimento mostrando a importância de PBMC aos efeitos antitumorais de A2C9-1 é consistente com a ideia de que este anticorpo estimula fortemente a citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos.

em resumo, verificou-se que o IFN-α /β induz a expressão de FGFR1 e que o tratamento com uma combinação de IFN-α /β e um mAb anti-FGFR1 suprime o crescimento de células CHC

In vitro

e

In vivo

. Nós também confirmou que o IFN-α /β aumenta a acumulação de FGFR1 o mAb anti-tumores dentro. Este protocolo de tratamento inibe selectivamente o crescimento de células de carcinoma hepatocelular, sem afectar as células normais, o que sugere que poderia ser utilizada no tratamento do HCC, sem reduzir o desempenho preliminar hepática. Assim, sugerimos que os nossos resultados podem fornecer a base para uma nova abordagem para o tratamento do HCC, para a qual não existe uma terapia eficaz no momento.

Materiais e Métodos

linhas celulares e experimental animais

linhas celulares de cancro hepático humano (HepG2, Huh-7 e CHC4) foram obtidos a partir da coleção japonesa dos recursos biológicos de investigação (Tóquio, Japão) e cultivadas como recomendado. As células foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com 10% de soro bovino fetal e penicilina /estreptomicina a 37 ° C sob uma atmosfera de ar humidificado com 5% de CO

2. As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram isoladas a partir de voluntários saudáveis, utilizando Ficoll-Paque (GE Healthcare Life Science, Uppsala, Suécia) e utilizado como células efectoras em ratinhos SCID. Todos os doadores fornecidos consentimento informado por escrito antes da colheita em conformidade com a Declaração de Helsínquia, e todos os protocolos utilizando amostras humanas foram aprovadas pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade Médica de Sapporo. PBMC inteiro (1 × 10

7) suspenso em 0,2 ml de meio RPMI 1640 foram intraperitonealmente injectadas em cada ratinho SCID. Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com os padrões aceitos de cuidados com os animais e aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal do University Medical Sapporo.

Microarray análise

Para a análise de microarray, as células HepG2 (1 × 10

6 células) foram inicialmente xenoenxerto em grave imunodeficiência combinada) ratos (SCID. Três semanas mais tarde, quando o tumor resultante tinha atingido 6-7 mm de diâmetro, o IFN-α (OIF®; Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd., Tokushima, Japão) foi injectada subcutaneamente a uma dose de 2000 U /rato. As amostras de tecido de tumor foram recolhidos antes e 24 h após injecção de IFN-α. O ARN foi extraído a partir de tecidos recolhidos utilizando Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e reversamente transcrito em ADNc utilizando Superscript III (Invitrogen). O cDNA foi, em seguida, feito reagir utilizando ADNc Navigator Gene matriz de filtros-humana do cancro (Toyobo, Osaka, Japão) e submetido a análise de DNA usando uma matriz Fluor-S multi Imager (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA).

em tempo real de RT-PCR a análise

HepG2 (1 × 10

6 células), as células foram xenoenxertados subcutaneamente nas costas de ratos SCID. Quando o tumor atingiu inoculados com 10 mm de diâmetro, o IFN-α (OIF®) ou IFN-β (Feron®; fabricado por Toray Industries, Inc., Tóquio, Japão), foi administrado por via intravenosa a uma dose de 2000 U /ratinho, e amostras de tecido de tumor foram recolhidos 0, 1, 3, 8, 24 e 48 h após a administração. O ARN total foi purificado a partir das amostras utilizando um kit RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemanha), e o cDNA de cadeia simples foi sintetizado a partir de 1 ug de ARN total utilizando um kit de primeiros-Strand cDNA Synthesis (GE Healthcare Life Science, Uppsala, Suécia) . análise quantitativa em tempo real foi realizado utilizando SYBR Green I (Roche, Basileia, Suiça) com um sistema de PCR em tempo real LightCycler (Roche). Níveis de expressão de FGFR1 e OAS1 (controlo) de ARNm foram normalizados para a expressão de ARNm de GAPDH. Os conjuntos de iniciadores para FGFR1 (sentido, 5′-GGA CGA TGT ACG GAG CAT CAA CTG-3 ‘; anti-sentido, 5′-AAC TTC ACT GTC TTG GCA GCC GG-3′), OAS1 (sentido, 5’-CAT CCG CCT AGT CAA GCA CTG-3 ‘; anti-sense, 5′- CCA CCA CCC AAG TTT CCT GTA-3′) e GAPDH (sentido, 5’-GAA GGT GAA GGT CGG AGT C-3 ‘; anti-sense , 5’-GAA GAT GGT GAT GGG ATT-TC-3 ‘) foram sintetizados em Greiner Bio-One (Tóquio, Japão).

análise de Western blot

HepG2, Huh-7 ou células CHC4 foram incubadas durante 48 h na presença de IFN-α ou IFN-β (1000 UI /ml), após o que as células foram lisadas em tampão de amostra (50 mM Tris-HC1, pH 6.8, 6% de 2-mercaptoetanol, 2% de SDS, 0,004% de azul de bromofenol e glicerol a 10%). As proteínas em amostras de lisado foram separados por electroforese em gel de poliacrilamida a 7,5% e depois transferidos para uma membrana de nitrocelulose (Bio-Rad Laboratories). Depois de bloquear a membrana com albumina de soro bovino a 2% (BSA) em PBS durante 1 h à temperatura ambiente, incubou-se com anticorpo de FGFR1 anti-humano (sc-121, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA) durante 1 hora à temperatura ambiente. A mancha foi então desenvolvido com 0,005% H

20

2-3, 3′-diaminobenzidina usando um kit ABC imunoperoxidase (kit Vectastain ABC, Vector Labs, Burlingame, CA, EUA).

A análise de citometria de fluxo

Quarenta e oito horas após a administração de IFN-α, expressão de FGFR1 foi avaliada utilizando citometria de fluxo. As células em suspensão (4 × 10

5 células /tubo) foram lavadas com 2 mL de tampão de lavagem (0,2% de albumina de soro bovino, 0,1% de NaN

3/10 mmol /L de solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4) e centrifugou-se a 300

g

durante 5 min a 4 ° C, após o que o sobrenadante foi removido. O sedimento de células remanescente foi fixado em 0,25% de paraformaldeído durante pelo menos 15 min no escuro à temperatura ambiente, lavou-se duas vezes com 2 mL de tampão de lavagem, incubaram-se durante 1 h em 70% de metanol, a 4 ° C, e, em seguida, lavou-se novamente. Para examinar a expressão de FGFR1, as células fixadas foram incubadas primeiro com o anticorpo anti-FGFR1 (1:100 diluição) durante 1 h a 4 ° C. As células foram então lavadas duas vezes e incubadas durante 30 min em 4 mL de IgG conjugado com isotiocianato de fluoresceína de cabra anti-ratinho em gelo no escuro. Depois de novo a lavagem das células duas vezes, eles foram suspensos em 1 mL de tampão de lavagem para análise utilizando um FACScan (Becton Dickinson Immunocytometry Sistema, San Jose, CA, EUA).

A análise da expressão de FGFR1 em xenoenxertos de cancro hepático humano

células HepG2 (1 × 10

6 células) foram xenoenxerto em ratinhos SCID. Quando o tumor resultante atingiu 10 mm de diâmetro, o IFN-α (OIF®) ou IFN-β (Feron®) foi administrado por via intraperitoneal ou por via intravenosa a uma dose de 100 U /g, e 24 h depois tecidos de tumor foram recolhidas. As análises de Western blot e imuno-histoquímicos foram então realizada utilizando um anticorpo anti-humano de FGFR1. (SC-121; Santa Cruz Biotechnology)

Preparação de Anticorpo Anti-FGFR1

Um polinucleótido que codifica a região que se estende desde aminoácidos 1-822 de FGFR1 e representada por SEQ ID NO. 1 foi amplificado por PCR utilizando-FGFR1 comprimento total (No. de Acesso NM_000604) como um modelo com os iniciadores 5′-No. 3 [(SEQ ID NO: 3.): 5′-ACGGGATCCAGGACCCTGGCTGGAGAGACA-3 ‘] e N ° 3′ 3 [(SEQ ID NO 4.): 5’-AAGCTCGAGCCGCCGGAACCGCGGCCGGA-3 ‘]. O polinucleótido amplificado foi inserido no pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) para construir um vector de expressão que foi administrado como antigénio imunizante a uma dose de 50 ug /murganho num volume de 50 uL em-1- ou 2- intervalos de uma semana. O antigénio para a imunização inicial foi misturada com adjuvante completo de Freund, enquanto os antigénios para o segundo e subsequentes administrações foram misturados com o adjuvante incompleto de Freund. As células do baço de monócitos a partir do ratinho imunizado e um parceiro de fusão, foram fundidas utilizando polietilenoglicol a fusão das células mediada X63-Ag8-653, que foi seguido por selecção de um hibridoma utilizando o método de Kinebuchi et ai. [28]. As células que tinham reagido com o FGFR1 imobilizada foram cultivadas em meio isento de soro GIT (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japão) para produzir mAbs até 80% das células tinha morrido. As células foram então removidas a partir deste meio por centrifugação (1000 rpm, 15 min), e sulfato de amónio foi adicionado a uma saturação de 50% e deixado durante a noite a 4 ° C. Os precipitados resultantes foram recuperados por centrifugação (1000 rpm, 30 min) e dissolveu-se em duas vertentes diluída tampão de ligação (Proteína AMAPS kit II), após o que a IgG foi adsorvido sobre uma coluna de proteína A (GE Healthcare Life Science). Após eluição dos mAbs a partir da coluna, o eluato foi dialisado contra PBS durante a noite para purificar os anticorpos, que produziu um número de mAbs que reconhecem FGFR1. Um desses mAbs foi designado A2C9-1 e foi confirmado para reconhecer FGFR1 por Western blot e FACS, utilizando amostras de FGFR1 expressa em células NIH3T3.

Affinity medição

A afinidade do anti FGFR1-mAbs para FGFR1 foi determinada com base em ressonância de plasmon de superfície (SPR), utilizando um dispositivo Biacore 3000 (Biacore AB, Uppsala, Suécia). O domínio extracelular de FGFR1 foi covalentemente acoplado a um chip sensor CM-5 a uma densidade baixa (215 unidades de resposta de FGFR1). cinética de ligação foram, em seguida, avaliada utilizando diluições em série duplas de anticorpo em concentrações que variam de 500-0,08 nM em tampão de corrida (PBS, pH 7,4, 0,005% (v /v), polissorbato 20 – filtrado e desgaseificado) a 25 ° C e um fluxo de taxa de 25 ml /min. O procedimento de regeneração consistiu de três injecções de 10 ml de cloridrato de guanidina 2,5 M, após o que o chip sensor foi purgado durante 5 minutos com tampão de corrida. Estatísticas e processamento de dados foram realizados utilizando BIA software de avaliação 4.0.1 e GraphPad Prism 4.02 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA). Todas as experiências SPR foram efectuadas à Biaffin GmbH Co. KG (Kassel, Alemanha).

Avaliando o efeito de FGFR1 anti-mAb em células de câncer hepático viabilidade

Para examinar o efeito da administração de IFN-α (OIF®) em combinação com FGFR1 mAb anti-(A2C9-1 ou A2D11-1) a células de carcinoma hepatocelular, avaliou-se a taxa de sobrevivência de células HepG2, na presença e ausência de IFN-α e /ou o mAb anti-FGFR1. As células HepG2 foram semeadas em poços de uma placa de 24 poços a uma densidade de 1 x 10

4 células /poço, após o que anti FGFR1-mAb, foi adicionado IFN-α ou anti-FGFR1 mAb + IFN-α, e a cultura foi continuada durante 0 a 6 dias. As células foram depois destacadas utilizando tripsina, e a taxa de sobrevivência foi avaliada utilizando ensaios MTT. meio de cultura isento de anticorpo foi adicionada como controlo negativo, e as células a que se adicionou nada foram utilizadas como um controle adicional.

experiência terapêutica com células de cancro hepático-xenoenxertados humanos rato

(células HepG2 5 × 10

6 células /rato) foram xenoenxerto subcutaneamente nas costas de camundongos CB17-SCID /SCID. Quando os volumes dos tumores atingiu 100 mm

3, os ratinhos foram divididos em 7 grupos de tratamento: 1) Os ratinhos no grupo PBS recebeu injecções intravenosas de PBS (250 uL) e IgG de murganho normal (100 ug). 2) O grupo de IFN-α receberam injecções intraperitoneais de IFN-α (OIF®: 2000 L) e IgG de murganho normal (100 ug). 3) O grupo de anticorpo recebeu injecções intravenosas de PBS e FGFR1 mAb anti-(100 ug; A2C9-1). 4) O grupo de IFN-α + anticorpo receberam injecções intraperitoneais de IFN-α (2,000 L) e as injecções por via intravenosa de mAb anti-FGFR1 (100 ug). 5) O anticorpo do grupo + PBMC IFN-α + receberam injecções intraperitoneais de IFN-α (2000 L), injecções intravenosas de anti-FGFR1 mAb (100 ug) e a administração intravenosa de PBMC (1 × 10

7 células). 6) O grupo de CMSP + IFN-α receberam injecções intraperitoneais de IFN-α (2,000 L) e a administração intravenosa de PBMC (1 × 10

7 células). 7) O grupo de PBMC receberam administração intravenosa de PBMC (1 × 10

7 células). Os tratamentos foram administrados 5 vezes no total, começando no dia 0 e, em seguida, uma semana mais tarde (W1), 2 semanas mais tarde (W2), 5 semanas mais tarde (W5) e 6 semanas mais tarde (W6). Apenas em w6, a dose de anticorpo foi aumentada para 200 ug /rato. Cada grupo continha 4 animais, e o tamanho do tumor foi medido, como x (eixo maior) (eixo menor) x 2 semanais após a administração inicial. Os tumores foram colhidas 1 semana após o tratamento final.

Immunophotodetection em ratos portadores de tumor

HepG2 células de carcinoma hepatocelular humano (1 × 10

6 células) foram xenoenxertado para os dorsos de ratinhos SCID . Três semanas mais tarde, quando o tumor inoculados tinham atingido cerca de 10 mm de diâmetro, o IFN-α (OIF; Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) a uma dose de 20000 U /ratinho ou PBS (controlo) foi administrada por via intraperitoneal. Após 24 h, a 50 ug de Alexa Fluor 680 conjugado com anti-FGFR1 mAb foi administrado por via intravenosa através da veia da cauda. Os ratos foram então fotografadas sob anestesia utilizando um sistema de imagem IVIS LUMINA (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, EUA).

Informações de Apoio

Figura S1.

Indução de

FGFR1

transcritos por IFN-α e IFN-β. As células HepG2 (1 × 10

6 células) foram xenoenxertados subcutaneamente nas costas de ratos SCID. Quando o tumor atingiu inoculados tinham 10 mm de diâmetro, o IFN-α ou IFN-β foi administrado por via intraperitoneal ou por via intravenosa a uma dose de 2000 U /rato. Os tecidos tumorais foram então recolhidos 0, 1, 3, 8, 24 e 48 h após a administração. A, tempo de curso de FGFR1 e OAS1 (controlo) após a administração a expressão de ARNm de IFN-α. FGFR1 ARNm (linha azul) foi aumentada 3 h (151%), 8 h (202%) e 24 h (119%) após a administração. OAS1 ARNm (linha vermelha) foi aumentada 3 h (162%), 8 h (133%) e 24 h (150%) após a administração. São mostrados os meios de duas repetições do tempo real de RT-PCR. B, tempo de curso de expressão de ARNm de FGFR1 e OAS1 após a administração de IFN-β. FGFR1 ARNm (linha azul) foi aumentada 8 h (348%) e 24 h (337%) após a administração, enquanto OAS1 ARNm (linha vermelha) foi aumentada 3 h (262%) e 8 h (511%) após a administração. Os níveis de expressão de ARNm foram normalizados ao do ARNm de GAPDH.