Abstract

identificar novos biomarcadores de câncer é importante para a detecção precoce do câncer, uma vez que pode reduzir as taxas de mortalidade. O secretoma cancro, a recolha de todas as macromoléculas secretadas por uma célula de tumor, altera a sua composição em comparação com o tecido normal, e esta mudança desempenha um papel importante na observação da progressão do cancro. A recolha e análise precisa de secretomes câncer pode levar à descoberta de novos biomarcadores, melhorando assim os resultados do tratamento do câncer. Nós inesperadamente descoberto que a auto-montagem instruído a enzima (EISA) de uma D-peptídeo resultados hydrogelator em nanonets /hidrogel ao redor células cancerosas que superexpressam ectophosphatases. Aqui mostramos que estes nanonets são capazes de recolher rapidamente proteínas no espaço pericelular (isto é, próximo da superfície) de células cancerosas. Uma vez que as substâncias de secreção são os mais elevados de concentração próximo da superfície da célula, a utilização de nanonets pericelulares para recolher o cancro secretoma maximiza o rendimento e a qualidade das amostras, reduz variações pré-analíticos, e permite que o perfil de dinâmica de amostras secretoma. Assim, esta nova abordagem tem um grande potencial na identificação da sinalização heterotípica no microambiente do tumor, melhorando assim a compreensão do microambiente do tumor e acelerar a descoberta de biomarcadores potenciais na biologia do câncer. Os dados estão disponíveis via ProteomeXchange com PXD003924 identificador

Citation:. Zhou R, Kuang Y, Zhou J, Du X, Li J, Shi J, et al. (2016) Nanonets Recolha Cancer secretoma do espaço pericelular. PLoS ONE 11 (4): e0154126. doi: 10.1371 /journal.pone.0154126

editor: Matthew Bogyo, Universidade de Stanford, Estados Unidos

Recebido: 31 de agosto de 2015; Aceito: 09 de abril de 2016; Publicação: 21 de abril de 2016

Direitos de autor: © 2016 Zhou et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho é parcialmente financiado pelo National Institutes of Health (R01CA142746), Kenneth Rainin Foundation, e uma concessão do National Science Foundation (DMR-1420382). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Como o câncer é uma das doenças mais dispendiosas e fatais para a saúde pública (por exemplo, NIH estima que os custos globais de câncer em 2008 foi de 201.500.000.000 $ [1]), a detecção precoce do câncer, geralmente resultando em tratamento menos extensa e melhores resultados globais, é uma solução ideal para minimizar significativamente o custo e salvar vidas. Com efeito, os esforços consideráveis ​​têm-se centrado na descoberta de biomarcadores de cancro. Enquanto o secretoma é definido como o conjunto de todas as macromoléculas secretadas por uma célula, o cancro secretoma difere em composição a partir do secretoma de tecidos normais, devido a mutações genéticas específicas em células cancerosas. Em princípio, o secretome câncer é um tesouro de biomarcadores de câncer. [2] No entanto, a identificação definitiva de biomarcadores de câncer continua sendo um grande desafio, porque as proteínas em secretome câncer, os componentes solúveis chave de microambientes tumorais, [3,4] são

dinâmico e complexo

. Infelizmente, os métodos convencionais (por exemplo, meios condicionados (CM)) de coleta de câncer secretome têm os seus limites e não pode acomodar a dinâmica ea complexidade do secretome câncer. Durante a nossa investigação sobre a formação catalisada por enzimas de nanofibrilas supramoleculares, [5-12] se inesperadamente descoberto que nanonets /hidrogel de um pequeno péptido D-formar selectivamente no espaço pericelular de certas células do cancro devido à sua sobre-expressão de ectophosphatases [12,13 ]. Porque D-péptidos resistir a digestão por proteases, o nanonets baseado D-péptido /hidrogel é estável e pode interceptar moléculas secretada (Figura 1A-1C). Assim, a formação pericelular de nanonets base D-peptídeos /hidrogel oferece uma nova oportunidade no processo de amostragem, tirando partido das diferenças biológicas entre câncer e células normais.

(A) A desfosforilação do precursor se transformando em hydrogelator perto superfície da célula (isto é, espaço pericelular) por ectophosphatases. (B) A auto-montagem de hydrogelators formando redes de nanofibrilas. (C) Ilustração do sequestro do câncer secretoma por nanonets /hidrogéis formados no espaço pericelular das células cancerosas. (D) Fluxograma do uso do nanonets pericelulares /hidrogel para recolher proteínas no secretome câncer.

O nosso estudo mostra que dentro de 2-4 h, o nanonets pericelular /hidrogel não só recolhe mais do total de proteínas segregadas a partir das células HeLa de meios condicionados não (por exemplo, meios cultivados com células cancerosas, durante 24 horas), mas também reduz as variações pré-analíticos e permite que o perfil temporal das amostras secretoma cancro. Como uma técnica poderosa para a recolha rápida e selectiva de secretoma do cancro, o uso de nanonets de D-péptido, portanto, serve como um método de amostragem geral muito necessária no espaço pericelular, em que as substâncias de secreção são os mais elevados concentrações. Dentro desta abordagem utilizando nanonets pericelulares, a nossa investigação dos perfis temporais de secretoma cancro também oferece perspectivas perceptivas sobre a natureza dinâmica da secretoma cancro, que pode ser uma ferramenta útil quando usado em conjunto com outros métodos de quantificação (por exemplo, SILAC), e eventualmente revelando biomarcadores de câncer clinicamente válido para a detecção e tratamento do câncer. Além disso, a abordagem estabelecida neste trabalho poderia ajudar a desenvolver novos métodos de recolha de substâncias de sinalização de secreção (por exemplo, exosomes [14] e miRNAs [15])

in vitro

e

in vivo

, em última análise, trazendo novo entendimento da biologia do câncer e cuidados clínicos.

Procedimentos experimentais

blocos de construção de nanonets /hidrogel

com base em nossa pesquisa anterior sobre a formação das nanofibras pericelulares /hidrogel em células cancerosas, [12] foi utilizado um par de precursor /hydrogelator para a formação enzimática de nanonets pericelular /hidrogel através de auto-montagem. O precursor do hydrogelator é um naftaleno (NAP) tripéptido tampado que consiste de D-amino de resíduos de ácido e é fosforilada no resíduo de tirosina, a NAP-D-Phe-D-Phe-D-Tyr (PO

3H

2) (1

p). Após desfosforilação, o precursor se transforma em Nap-D-Phe-D-Phe-D-Tyr (1), que se auto-organiza em fase aquosa para formar um hidrogel. [16] A sobre-expressão de ectophosphatases de células cancerosas permite a auto- montagem de uma em torno das células de modo a formar redes de nanofibrilas (isto é, nanonets). No nosso trabalho anterior [12] que demonstraram que nanonets pericelulares formar na superfície de células HeLa no interior 2h da incubação com 1

p (400 ug /mL). Seguimos o nosso procedimento anterior dissolvendo precursor 1

p em DDH

2O com ajuste de pH para 7,4 por adição de NaOH 1N para produzir a solução estoque.

Recolha de nanonets /hidrogéis ou médio completa

médio

3 × 10

5 de células HeLa em 2 ml de meio MEM completo foram semeadas numa placa de Petri de 35 mm. Após 24 h de incubação, o meio foi removido, e as células foram lavadas com 2 mL de meio completo MEM fresco uma vez. Para a recolha de nanonets /hidrogéis, 1 mL de meio MEM completo contendo 1

p a 400 ug /ml (diluído a partir de uma solução 20X de estoque de 1

P em tampão PBS, preparada imediatamente antes da utilização) foi adicionado para substituir o meio de cultura. Após 2 h de incubação a 37, o prato foi colocado em um quarto de 4 ° C durante 5 min. O prato foi inclinado e agitado para recolher os nanonets destacados /hidrogéis em média. Usando uma pipeta de transferência de largura boca, que recolhida do meio para um tubo Eppendorf de 1,5 mL e centrifugou-se a 7500 rpm durante 1 minuto. O meio de suspensão foi cuidadosamente removido usando uma pipeta de 200 uL para se obter os nanonets /hidrogéis (Fig 1D, também dois clipes de vídeo (S1 vídeo e S2 de vídeo) gravando a recolha de nanonets e o meio pode ser encontrada nos ficheiros de apoio) para o gel electroforese. Para recolha do meio, para as células foi adicionado 1 mL de meio MEM completo sem um

P e as células foram incubadas a 37 ° C durante 2 ou 24 horas. 100 ul do meio foi recolhido após a incubação. Para cada uma das experiências, a amostra foi obtida a partir do mesmo lote de células. Ambos os nanonets /hidrogel e o meio foram imediatamente congeladas a -80 ° C após a recolha. O experimento controle adicional 2h_N há células e experimentos de perfis dinâmicos siga o mesmo procedimento para a coleta nanonets /hidrogel. Os detalhes destas experiências são descritos no arquivo S1.

SDS-PAGE

18 uL de cada amostra foi misturada com 12 uL de tampão de carga Laemmli 2X. As soluções foram misturadas e incubadas a 95 ° C durante 5 min. 15 � da solução foi usado para SDS-PAGE. Prefabricados de gel de 4-20% em Tris-HCl (10 bem, 30 ul) foi usado. O gel foi executado em uma tensão constante de 200 V.

análise por espectrometria de massa e banco de dados de pesquisa

Para a análise de massa de proteína, o gel foi corado por Coomassie. Cada pista foi cortada em três secções, com um peso molecular varia em: 250-80 (250-75); 80-40 (80-37); 40-10 kDa. As bandas do gel foram excisadas com tão pouco excesso de gel vazio quanto possível, e foram colocados num tubo de micro centrífuga com DDQ

2O. As amostras foram armazenadas em tubos de eppendorf e enviado para Taplin Espectrometria de Massa Facility (TMSF da Harvard Medical School) para análise. As imagens do gel antes da excisão de bandas de gel foram submetidos (fotocópia e eletronicamente), juntamente com a amostra. A amostra preparada para a espectrometria de massa de proteínas é de 10 ug por pista. Espectrometria de massa e a identificação das proteínas foram realizadas por TMSF.

Todas as proteínas foram identificadas pela SEQUEST (o algoritmo de busca de banco de dados, https://thompson.mbt.washington.edu/sequest) a partir dos resultados de especificação de massa e previu padrão de fragmentação de péptido. A informação de saída SEQUEST foi fornecida por TMSF, incluindo sequências de péptidos, XCorr (correlação cruzada), ΔCn (correlação delta), o número de péptidos únicos e totais e contagem total de espectro. Os arquivos de resultados SEQUEST são convertidos em XML ORGULHO válida para apresentação ao banco de dados do PRIDE à disposição do público pelo conversor PRIDE [17]. Os dados de proteômica espectrometria de massa foram depositados ao Consórcio ProteomeXchange através do PRIDE [18] repositório de parceiros com o PXD003924 identificador de conjunto de dados e 10,6019 /PXD003924.

Resultados

Tempo da compatibilidade recolha e celular dos nanonets

para selecionar o tempo óptimo de incubação para a coleta dos nanonets, as células HeLa foram incubadas com 1

p por 3-9 h e a quantidade de tubulinas (um marcador para a autólise das células) [ ,,,0],19] nos nanonets foi comparado com o mesmo volume (20 mL) de CM recolhidas após 24 h de incubação. Os nanonets recolhidos depois de 3 ou 6 horas de incubação contém menos do que a tubulina recolhidas após 24h CM (Fig A na Fig S1), o que sugere que os nanonets recolhidos no prazo de 6 horas de incubação contêm menos proteínas resultantes da autólise. Numa outra experiência, foi testada a viabilidade das células após a recolha nanonet (4 h de incubação com 1

P) e descobrir que choque de frio e de remoção forma dificilmente induzir qualquer alteração na viabilidade das células (Fig B no S1 figura). Estes resultados confirmam que o choque frio para recolher nanonets dentro de 6 h de incubação com as células é adequado para recolher o secretome.

maior quantidade e qualidade da secretome recolhidos pelo nanonets

Para demonstrar que nanonets pericelulares pode coletar rapidamente proteínas secretoras, realizamos 3 configurações experimentais para o mesmo 2h tempo de incubação: em primeiro lugar, nanonets pericelulares recolhidos a partir de células HeLa tratadas com 1

p em meio de cultura completo (2h_N); Em segundo lugar, o meio completo incubadas com células HeLa (2h_CM) para comparação; e, finalmente, o meio completo tratado com 1

p e 0,1 U de fosfatase alcalina, sem células HeLa (2h_N sem células) como um controlo. Sem processamento adicional, que se aplicam diretamente eletroforese às amostras. Os nanonets auto-montados para dissociar um monomérica após a mistura com tampão de carga Laemmli. Devido ao seu pequeno peso molecular (643 Da), 1 corre para fora do gel e tem pouco efeito adverso sobre a coloração ou a análise posterior de proteínas do gel. Como mostrado na Fig 2A, apesar de ser mascarada por proteínas do soro de bovino (principalmente albuminas), coloração com prata de SDS-PAGE de ambos os ensaios de 2h_N e 2h_CM revela que 2h_N tem mancha mais escura do que 2h_CM faz. Imagem J [20] A análise mostra que, em ambos os ensaios, as bandas a 300, 160, e 13 kDa, têm, obviamente, uma maior densidade em 2h_N que em 2h_CM, que ilustra que há várias proteínas nestas bandas na 2h_N (Fig 2B) . No entanto, a banda a 55 kDa, que consiste principalmente de albumina bovina a partir do meio de cultura, tem uma densidade mais elevada do que em 2h_CM em 2h_N no ensaio I e tem uma densidade semelhante e em 2h_CM 2h_N no ensaio II. Estes resultados sugerem que as proteínas adicionais recolhidos pelos nanonets são as proteínas de secreção a partir de células HeLa, em vez de proteínas de soro do meio de cultura. Como mostrado na Fig 2C, a espectrometria de massa em tandem da proteína mostra mais

péptidos totais

e

péptidos únicos

(péptido que existe apenas em uma proteína no proteoma humano) em 2h_N (1995 e 963 (trial I), 1952 e 990 (trial II)) do que em 2h_CM (1.401 e 603 (trial I), 1593 e 714 (trial II)) e 2h_N nenhuma célula (1209 e 784). Além disso, 2h_N também contém consideravelmente mais

proteínas totais

e

identificaram proteínas

(a proteína com 2 ou mais originais peptídeos) do que 2h_CM e 2h_N há células não (Fig 2D). Estes resultados estão de acordo com a observação na prata manchada SDS-PAGE que 2h N contém mais proteínas do que coleções CM.

(A) prata manchada SDS-PAGE mostrando as proteínas em células HeLa secretoma obtidos a partir dos nanonets pericelulares após 2 h de incubação dos precursores com as células (2h_N) e recolhido por centrifugação do meio condicionado ao fim de 2 h de incubação (2h_CM). Um pedaço de hidrogel (gel) é carregado para SDS-PAGE e coradas como o fundo. (B) densidade relativa de bandas de proteína de 2h_N e 2h_CM nos dois ensaios em peso molecular de 300, 160, 55, e 13 kDa. (C) proteína de acordo com LC-MS /MS, os números de péptido total e péptido original observados a partir de proteínas do HeLa secretoma obtido no 2h_N, 2h_CM, e as proteínas em células não 2h_N. (d) Números de proteína total e a proteína identificada (número único péptido ≥2) [21,22] observaram proteínas de LC-MS /MS no HeLa secretoma obtido no 2h_N 2h_CM e em dois ensaios e proteínas em células não 2h_N. (E) Correlação dos hits peptídicas únicas de proteínas detectadas em 2h_N dos dois ensaios. (F) Correlação dos hits peptídicas únicas de proteínas detectadas em 2h_CM dos dois ensaios. (G) Comparação de proteínas identificadas entre 2h_N e 2h_CM (as proteínas enumeradas são identificados em ambos os ensaios de 2h_N ou 2h_CM). HeLa secretoma relatado na literatura [23] serviu como referência. (H) A análise das 122 proteínas identificadas em ambos os ensaios de 2h_N. A informação sobre a localização subcelular das proteínas foi recolhido a partir de UniProt. Gráficos (I) Pie representando perfis funcionais moleculares das proteínas no secretoma recolhidos por nanonets pericelulares a partir de células HeLa e 2h_N meio de cultura após 2h de 2h_CM incubação. As propriedades secretoras previstos das proteínas foram analisados ​​por secretoma 2,0 e a classificação funcional foi analisada por Panther.

Enquanto ensaios 2h_N tem 161 e 181 proteínas identificadas, apenas 144 proteínas são identificadas no 2h_N não há células julgamento, significativamente menor do que estudos anteriores com células HeLa. A falta de proteínas identificadas é esperado porque a ausência de células HeLa nesta experiência de controlo não iria resultar em secretoma cancro. Os ensaios 2h_CM, por outro lado, tem 128 e 108 proteínas identificadas, que é ligeiramente menor do que 2h_N ensaio sem células. Uma possível explicação para a diferença entre as proteína única nanonets e CM poderia ser o potencial efeito da concentração nanonets. É possível que nanonets têm certa afinidade às proteínas de baixa concentração existentes no espaço pericelular e médio. Este enriquecimento de nanonets pode levar a algumas proteínas identificadas nos resultados. Além disso, analisamos a sobreposição de proteínas identificadas entre 2h_N nenhuma célula, 2h_N e 2h_CM. A sobreposição média entre 2h_N sem células e 2h_N é de 84 proteínas, 30% de proteínas (89, 30% de fuga I e 79 proteínas, 29% de fuga II). A sobreposição média entre 2h_N sem células e 2h CM é de 63 proteínas, 37% (60 proteínas, 37% para a trilha I e 66 proteínas, 36% para trilha II). Esta experiência de controlo adicional demonstra que, embora os nanonets pode ter um efeito de concentração, os nanonets formada na superfície da célula de cancro ainda armadilha secretoma suficiente para compensar a possível influência do meio de enriquecimento.

Para avaliar a pré-analítica variação entre os dois métodos, nanonets e CM, marcamos as proteínas identificadas nos dois estudos (feitos por diferentes operadores) pelo número de peptídeos originais (ou seja, número de iões parentais originais) [24] das proteínas. Como mostrado na Fig 2E e 2F, a regressão linear das proteínas identificadas nos dois ensaios de 2h_N tem um

2 valor R de 0,77, o que é significativamente maior do que a dos dois ensaios de 2h_CM (R

2 valor = 0,47), indicando a reprodutibilidade entre os dois ensaios de 2h_N é muito mais elevada do que a de 2h_CM. Além disso, a comparação do número de péptidos única de proteínas observadas tanto na 2h_N e 2h_CM indica que a maior parte destas proteínas têm mais péptidos únicas detectadas na 2h_N que em 2h_CM, confirmando assim que nanonets pericelulares recolher mais proteínas secretoras de CM faz.

Além disso, 67 do total de proteínas identificadas em ambos os ensaios de 2h_N (122 proteínas) e, em ambos os ensaios de 2h_CM (81 proteínas) (Fig 2G) são idênticos (Tabela a em S1 Tabela). Ao explorar a rede de interação proteína-proteína [25] dessas 67 proteínas (S2 FIG), descobrimos que a maioria (50 proteínas; 75%) são actins, Serpins, colágenos, tubulinas e suas proteínas que interagem. Apesar de ser citosólico na origem, actins, tubulinas e serpins são comumente presente no secretome de células humanas, incluindo células cancerosas, [26,27], que concorda com a característica de secreção de proteínas não-convencionais. [27] Além dessas 67 proteínas, 2h N contém 55 proteínas adicionais (Tabela B em S1 Table), e 45 deles já estariam associados à progressão de certos tipos de cânceres. Entre as 55 proteínas observados somente em 2h N, 50 deles foram observados no secretoma de outras células cancerosas. No entanto, apenas 27 das 55 proteínas foram documentados na secretoma de células HeLa (obtido a partir de CM ultra-filtrado de células HeLa incubadas com meio isento de soro). [23] Por outro lado, 2h_CM tem apenas 14 proteínas adicionais, excepto os 67 proteínas partilhados (Tabela C na Tabela S1). Estes resultados indicam que 2h_N é mais sensível para a recolha de secreção de proteínas 2h_CM. Curiosamente, apenas 34,4% dos 122 proteínas identificadas em 2h_N são proteínas secretoras e a maioria do resto são proteínas intracelulares, como categorizados por UniProt. [28] No entanto, a previsão baseada em recursos mostra que mais de 60% das proteínas são proteínas secretoras, clássica (por SignalP [29]) e não clássico (por SecretomP [30]) (figura 2H). Estes dados são semelhantes aos elementos a partir da observação de fluido corporal cuja secretoma contém proteínas secretoras clássicos e não clássicos, assim como as proteínas intracelulares. [31] Por outro lado, o perfil de proteínas de 2h_N sem células (Tabela I em S1 tabela) mostra apenas 35% do total das proteínas secretoras preditos. Este resultado corresponde em grande medida para o facto de as proteínas apenas meio de cultura são recolhidos sem interferência a partir de células HeLa secretoma. Em seguida, utilizado PANTERA [32] para analisar os dados de espectrometria de massa de proteínas das amostras de 2h_N e 2h_CM. Embora as percentagens da maioria das categorias de as proteínas identificadas são bastante semelhantes nas amostras de 2h_N e 2h_CM, as proteínas secretoma recolhidos por nanonets mostrar percentagens mais elevadas de proteínas para catalítico, antioxidante, e actividades de ligação (Fig 2i). Os resultados acima validar que os nanonets auto-montadas agir como um método mais preciso e sensível para a recolha de secretome câncer do CM.

Total de proteínas do perfil temporal do secretome câncer registrados pela nanonets

O curta tempo de incubação permite que os nanonets pericelulares para registrar a dinâmica do secretome câncer. Como mostrado na Fig 3A, incubando as células HeLa em meio com FBS a-livre para diferentes períodos de tempo e, em seguida, mudando o meio de FBS livre meio contendo 1

P para um 4 h adicional de incubação produz recolheu-nanonet secretoma de HeLa células. A experiência de controlo utiliza CM para recolher o secretoma de células HeLa foram incubadas em meio com FBS a-livre durante 24 h. [33] De acordo com proteína A análise por espectrometria de massa destas amostras (Fig 3B), as quantidades de péptidos totais e péptidos únicos diminuir a partir da N_0 amostra para a amostra antes de a tendência N_8 reverte para a amostra N_12, que tem um valor ligeiramente mais elevado de péptidos do que a amostra N_0. Embora CM fornece os dados cumulativos úteis de HeLa secretoma após o padrão de 24 h de incubação, que é, obviamente, não pode capturar a alteração dinâmica da quantidade de proteínas no secretoma durante 24 h de incubação.

(A) Esquema mostrando a colecção de nanonets a partir de células HeLa em meio com FBS a expostas-livre para diferentes períodos de tempo. Como um controlo, CM foi recolhido a partir de células HeLa expostas em FBS livre médio durante 24 h. (B) Número de peptídeos total de peptídeos e únicos observados em N_0, n_4, N_8, N_12 e CM por espectrometria de massa de proteínas. (C) Número de proteína total e única proteína (número peptídeo única ≥2) [34,35] observada em N_0, n_4, N_8, N_12 e CM pela proteína LC-MS /MS. (D) A alteração no número de péptidos única de várias proteínas essenciais em secretoma observadas nos nanonets. (E) A mudança no número de peptídeo única de várias proteínas representativas (coletado nos nanonets) que têm altos sucessos peptídicas únicas observadas nos perfis de proteínas MS.

Categorias das proteínas permanecem globalmente equilibrada

Embora certas proteínas individuais nas secretomes exibem uma variação considerável, as categorias funcionais das proteínas no secretoma permanecem bastante constantes. Usamos PANTERA para analisar os dados de LC-MS /MS das amostras com tempos de pré-incubação de 0 a 12 h (Figura 4A, Tabela H em S1 Tabela). Os percentuais de cada categoria de proteínas identificadas permanecem quase constante. Oito de dez (FIG 4B) as categorias de secretomes mostram a mesma tendência nas alterações temporais-a quantidade de proteínas inicialmente diminuem em seguida pelo aumento mais tarde. A atividade de fatores de transcrição antioxidantes e proteínas de ligação apresentam respostas diferentes para a privação de nutrientes (isto é, FBS meio livre): proteínas antioxidantes aumentar após um intervalo curto (4 h) de privação de nutrientes; factores de transcrição de ligação de proteína aumenta após um intervalo médio (8 h) de privação de nutrientes. Interessantemente, estes dois tipos de actividades parte relativamente reduzida linhas de base em termos da sua pequena quantidade de proteínas. Uma vez que a tendência geral da composição de proteínas é a permanecer constante a SBF-privação, a grande variação de categorias individuais de pequenas quantidades de proteínas é pouco provável que seja causada por tentativas para manter Proteostase.

(A) Temporal gráficos de pizza representam perfis funcionais moleculares de secretome câncer recolhidas após a FBS-privação para diferentes comprimentos de tempo: 0 (N_0), 4 (n_4), 8 (N_8) e 12 h (N_12). (B) O gráfico representa comportamentos temporais de diferentes categorias de secretoma cancro com base em funções da molécula que, durante a privação de FBS para diferentes períodos de tempo (0, 4, 8 e 12 h) e a incubação em meio condicionado durante 24 h. (C) O enredo apresenta a gama flutuante (como desvio padrão) do comportamento temporal para secretomes categorizados.

Para entender melhor os perfis temporais secretoma durante FBS-privação, também incluímos o resultado de 24 horas de incubação em meio condicionado (CM) como a referência (Figura 4B). Como mostrado na Fig 4B, a quantidade de proteínas em cm, é próximo do valor médio de proteínas nas secretomes durante alterações temporais (0-12 h). Este resultado implica que as atividades celulares globais são susceptíveis de permanecer equilibrado durante a privação de FBS. Além disso, estes resultados indicam que 4 horas de incubação com os nanonets leva a perturbação mínima do secretoma. Para compreender a alteração temporal do secretoma de uma forma mais precisa, também calcular as quantidades relativas de proteínas (S3-S7 figos) e os desvios padrão em cada categoria de proteínas. Como mostrado na Fig 4C, a distribuição dos desvios padrão das variações temporais de cada uma das categorias de proteína difere entre as categorias de proteína. Por exemplo, enquanto o valor do desvio padrão das proteínas secretadas na categoria de actividade molecular estrutural e de ligação é maior do que 20, o valor do desvio padrão das proteínas secretadas na categoria de actividade do factor de transcrição antioxidante e proteína de ligação é menor do que 5. esta distinção na distribuição indica que a extensão das respostas de FBS-privação varia entre cada categoria de proteínas secretoras. Estes resultados, assim, proporcionar uma perspectiva útil para o comportamento de células cancerosas sob privação de nutrientes.

Alterações relativas de proteínas em cada categoria funcional

A mudança relativa da quantidade de proteínas, por por outro lado, mostra uma mudança do perfil de imparcial secretoma usando a diferença definida entre cada ponto de tempo divididos pelos resultados de um grupo de controlo (24 h de incubação em meio de FBS-livre) durante todo o período de tempo experimental. O resultado da variação relativa (valor RC) para cada secretome é calculada utilizando a seguinte fórmula:. A comparação do padrão de mudança temporal com base no valor de RC de 69 proteínas seleccionadas com perfis significativamente mudando é ilustrado na figura 5. Uma vez que determinadas proteínas pode pertencer a mais do que uma categoria, a informação sobre a categoria funcional de cada proteína é incluída no mapa de calor. A gama geral de valores a partir de RC (-86% para 100%) reflectem as tendências gerais da secreção estável de células de cancro durante o estímulo de FBS-privação. Várias proteínas apresentam um valor grande RC (PCBP1, ALDH7A1, PRMT1, CALD1, etc). Este fenómeno é provavelmente devido ao pequeno número de péptidos únicas detectadas no controlo. Este resultado indica ainda que o uso de nanonets no lugar de CM é um método mais poderoso e apropriado para recolher secretome câncer.

De 0 a 4 h, 42 de 69 proteínas (mostrado na cor vermelha para azul ) exibem valores positivos RC (Fig 5), sugerindo um aumento na quantidade de proteína em resposta a uma falta de nutrientes. Depois de mais 4 h, a tendência geral transforma-se uma diminuição da secreção, como evidenciado pelos valores negativos de RC de 38 de 69 proteínas (mostrados a cinzento cor para preto). Durante os períodos de tempo listados de 8-12 h e 12-16 h, a secreção também insinua um padrão decrescente similar, desde a quantidade de secreção exibe valores de RC negativos para 46 e 39 de 69 proteínas, respectivamente, ao longo destes dois períodos. Uma análise categorizados (figura 5) de secretoma cancro revela que a maioria das proteínas dentro da mesma categoria funcional raramente partilham uma tendência comum dos perfis temporais de secreção após estimulação. No entanto, para as proteínas multifuncionais (ou seja, pertencem a diferentes categorias funcionais), os seus perfis temporais normalmente apresentam tendências semelhantes ao longo de todo o tempo de estimulação. Por exemplo, as proteínas agrupados em categorias funcionais de ambas actividade de ligação e catalítica, tais como MCM2, DHX9, DHX15, SNRNP200, todas mostram um decréscimo em abundância, pela primeira 4 h e subsequente aumento para o restante de FBS-privação; mas outras proteínas em apenas uma dessas duas categorias (vinculativo ou categoria catalítica) dificilmente apresentam características comuns. Este personagem é aparentemente única para proteínas “multifuncional”. Por exemplo, GCN1L1, PSMD2, e IQGAP1, que pertencem a ambas as actividades catalíticas e enzimáticos, exibem a mesma quantidade de aumento de secreção para as primeiras 4 h, seguir por redução. Este fenómeno era desconhecida anteriormente, e certamente merece mais estudos.

A mudança dinâmica de certas proteínas específicas

Uma vez que as mudanças dinâmicas do secretome das células cancerosas têm sido anteriormente inatingíveis, embora contendo muito importante informações, analisamos mudanças na abundância de várias proteínas essenciais nas amostras de N_0 para N_12. Comparando os números de acessos peptídicas únicas destas proteínas ajuda a estabelecer seus perfis temporais (Fig 3D e 3E). Como mostrado na Fig 3D, a quantidade de alfa-actina 2 (ACTA2) e da beta-actina (ACTB) exibem pouca alteração ao longo do tempo (0-4 h (N_0) a 12-16 h (N_12)) e a quantidade de alfa-tubulina 1A (TUBA1A) e 2A beta-tubulina (TUBB2A) alterar apenas ligeiramente ao longo do tempo, coincidindo com a observação de que actins tubulinas e ter uma presença constante no secretoma de células de mamíferos. [26,27] Pelo contrário, o quantidades de colagénio alfa-1 (XII) (COL12A1) e fibronectina (FN1) diminuir drasticamente, isto é, o colagénio alfa-1 (XII) desaparece n_4 para N_12, e a fibronectina está ausente em N_8 e N_12. A quantidade de duas enzimas, serpina H1 (SERPINH1) e piruvato cinase (PKM), também diminuirá significativamente a partir N_0 para N_12. Estes resultados sugerem que, para lidar com a fome induzida por FBS-privação, as células HeLa diminuir significativamente ou, eventualmente reabsorver as proteínas da matriz extracelular e as enzimas secretadas para manter Proteostase. [36] Também examinamos várias proteínas com batidas altas peptídicas únicas ( Figura 3E). Notavelmente, a quantidade de plectina (Plec) sofre a maior mudança do N_0 para N_12. Embora a diminuição da plectina de N_0 para N_8 pelas células HeLa é provável para o propósito de manter Proteostase, o aumento repentino de plectina em N_12 indica uma libertação aliviada de exossoma, [37] concordando as células cancerosas comportamento fome que tentar manipular tumoral microambientes (isto é, estimular estromal e as células endoteliais) para auxiliar a sua progressão [38,39] Há uma outra observação interessante:., enquanto a quantidade de todas as outras proteínas diminuir em certa medida em pelo menos uma amostra de nanonets, a quantidade de piruvato