Abstract

Aproximadamente 50% dos pacientes com carcinoma colorretal primário desenvolvem metástases hepáticas. Entender as diferenças genéticas entre câncer de cólon primário e suas metástases para o fígado é essencial para a concepção de uma melhor abordagem terapêutica para esta doença. Foi realizada a sequenciação exome e cópia de análise de número inteiro para 15 trios, cada tecido colorectal normal, compreendendo, carcinoma colorectal primário, e sua síncrona combinado metástase hepática. Foram analisadas as semelhanças e diferenças entre carcinoma colorretal primário e metástases hepáticas compensadas em relação à mutações somáticas e número de cópias somática alterationss. O perfil genômico demonstrado mutações em APC (73%), KRAS (33%), e ARID1A PIK3CA (6,7%) entre os genes colorrectal primário e tumores hepáticos metastáticos.

TP53

mutação foi observada em 47% das amostras primárias e 67% em amostras metastáticas do fígado. Os pares associados, em agrupamento hierárquico mostrou alteração no número de cópias padrões semelhantes somáticos, em contraste com os pares desagrupados. Muitas mutações (incluindo os de genes motorista câncer chave conhecida) foram partilhados nos pares agrupados. Os pares não agrupadas exibiram padrões de mutação distintas sem mutações comuns em genes-chave do controlador. Quatro amostras de metástases hepáticas desagrupados tinham mutações em genes de reparação de emparelhamentos incorrectos do ADN, juntamente com hypermutations e um número substancial de alterações no número de cópias. Os nossos resultados sugerem que cerca de metade dos casos de carcinoma colorrectal metastático teve a mesma origem clonal com as suas carcinomas colorectais primários, enquanto que os casos restantes foram geneticamente distintos dos seus carcinomas primários. Estes resultados sublinham a necessidade de avaliar as lesões metastáticas separadamente para terapia otimizada, ao invés de extrapolar a partir de dados de tumor primário

Citation:. Lee SY, Haq F, Kim D, Jun C, Jo HJ, Ahn SM, et ai. (2014) Comparative Genomic Analysis of Primária e Synchronous metastático Colorectal cancros. PLoS ONE 9 (3): e90459. doi: 10.1371 /journal.pone.0090459

Edição: Harriet Wikman, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Alemanha |

Recebido: 30 de setembro de 2013; Aceito: 30 de janeiro de 2014; Publicação: 05 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Lee et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado pelo Programa de Pesquisa em Ciência básica através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), financiado pelo Ministério da Ciência, TIC Planejamento Futuro (No. 2012R1A1A1013369). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O conceito emergente de policlonalidade está a ganhar importância na biologia do câncer [1]. A evolução monoclonal de um tumor a partir de uma única célula de cancro tem sido extensivamente estudado, e é geralmente considerado o envolvimento da expansão clonal selectiva de clones tumorais dominantes. Mais recentemente, o conceito alternativa da evolução policlonal emergiu. Este modelo consiste de dois conceitos fundamentais: a hipótese auto-semeadura e o modelo modificador fenótipo. O primeiro propõe que os clones de tumor deixar o local principal, entra na circulação sistémica através da vasculatura do tumor, e colonizar um local distante, estabelecendo assim uma nova subpopulação [2], [3]. O modelo fenótipo mutador propõe um pequeno número de clones de células altamente diversos tumores (policlonais) em vez de um concorrentes alguns sub-populações clonais; Na verdade, vários tipos de tumores sólidos, incluindo cancros do cólon, foram sugeridos para ser altamente policlonal [4].

A identificação da origem do câncer é fundamental na compreensão dos eventos genéticos envolvidos na iniciação e progressão tumoral [5] . Tal como acontece com cancros primários, metástases também podem ter origem quer um único ou policlonal [6], [7]. Geralmente, metástases realizar mutações semelhantes aos dos cancros primários de que são originários, mas mutações adicionais ocorrem após a transformação [6], [8]. A incidência contínua, e muitas vezes a aceleração de mutações resulta em heterogeneidade genética entre cânceres primários e metastáticos; isso principalmente aumenta a resistência à terapia no segundo, que é a causa predominante de morte relacionada ao câncer em todo o mundo [6], [9].

carcinoma colorretal (CCR) é a terceira neoplasia maligna mais comum ea segunda causa de mortes por câncer de liderança em muitos países [10], [11]. Cerca de 50% dos pacientes com CCR desenvolver metástase colorectal fígado (CLM) [12]. Sem tratamento, os pacientes com CLMS têm uma sobrevivência média de apenas 5-10 meses, com menos de 0,5% de sobrevivência de 5 anos para além [13]. Vários estudos têm abordado a origem clonal e heterogeneidade genética das CRCs [14], [15]. Sem consenso claro emergiu deste como, embora um relatório conclui que os tumores se originam, principalmente, a partir de um único clone de [15], os resultados de outros estudos sugerem que a maioria dos tumores têm uma origem policlonal [16], [17]. Recentemente, a sequenciação do genoma total de combinações de melanoma acral primário e metastático também revelou heterogeneidade genética considerável entre os tumores primários e metastáticos, como evidenciado por

de novo

, variação único nucleótido não sinónima [18]. metástases do cancro do pâncreas também foram sequenciados para avaliar as relações entre clonais cancros primários e metastáticos, que conduz à identificação de populações clonais que deu origem a metástases distantes [19], [20]. Portanto, é vital para compreender diferentes conceitos relativos à origem do câncer e da heterogeneidade genética entre um tumor primário e as suas metástases distantes para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas eficazes [21], [22].

A fim de avaliar a policlonalidade e heterogeneidade genética no CRC, foi avaliada a relação genética e clonal entre CRCs primários e suas CLMS combinados através da realização de sequenciamento exome alvo e análise de alta resolução variação do número de cópia (SCNA) de 15 trios de tecido colorectal normal, CRC primário, e combinados CLM amostras. Nossos resultados fornecem informações valiosas sobre a relação clonal e diferenças genéticas entre os CRCs primários e suas CLMS correspondentes, e, consequentemente, ajudar na definição alvos potenciais para terapias sistémicas.

Resultados

descrição do paciente coorte

a idade média dos pacientes no estudo foi de 61 (Tabela 1). A coorte incluiu um estágio T2, 10 T3 fase, e 4 tumores T4 CRC, todos os quais são espécimes de ressecção primários. Seis pacientes tiveram única metástases hepáticas, enquanto 9 pacientes tinham dois ou mais metástases hepáticas na ressecção. As informações clínicas e histo-patológicas para o conjunto de coorte utilizada no estudo é apresentado na Tabela 1.

SCNA análise

Foram realizadas análises SCNA em 15 trios de tecido colorectal normal, CRC e amostras de CLM. Usando a análise emparelhada (isto é, o tecido colorectal normais vs. CRC ou tecido colorectal normais vs. CLM), identificamos SCNAs somáticas tanto no CRC ou amostras CLM (Tabela 2 e Figura S1). CRC e CLM pares de 11 pacientes mostraram um número semelhante de SCNAs (Tabela 2); No entanto, os restantes 4 pares (# 250, # 262, # 526 e # 721) mostrou um aumento substancial do número total de SCNAs nas amostras CLM, especialmente aqueles envolvendo perda de cópia homozigóticos e perda de heterozigosidade (LOH) (Tabela 2).

Realizamos agrupamento hierárquico não supervisionado dos dados SCNA somáticas de 15 pares de amostras de CRC e CLM, a fim de avaliar a diversidade genética entre os CRCs primários e metastáticos. agrupamento hierárquico não supervisionado de dados SCNA foi usado anteriormente para determinar as relações genéticas entre os cânceres primários e metastáticos [23]. A presente análise foi baseada na suposição de que CRCs geneticamente semelhantes, e suas CLMS combinados serão estreitamente relacionados no agrupamento hierárquico. Cinquenta e três por cento (8 de 15) dos CRCs primários estavam intimamente relacionadas com as suas CLMS combinados, indicando semelhança clonal e genética nestes pares CRC-CLM. Os 47% restantes (7 de 15) dos pares de CRC-CLM foram apenas distantemente relacionado, sugerindo relações genéticas distintas entre estes CRCs e seus CLMS combinados (Figura 1).

Em 8 pares CRC-CLM (53 %), cada par é o mais estreitamente relacionado na árvore hierárquica (vermelho); em 7 pares CRC-CLM (47%), cada par é remotamente relacionado, indicando que CRCs primários e suas CLMS combinados têm características genéticas distintas (azul). As mutações somáticas em genes relacionados com o cancro também são mencionados.

De nota. padrões SCNA de 8 pares estreitamente relacionadas foram semelhantes ao passo que as 7 pares CRC-CLM distantemente relacionados eram distintos (Figura S2). Nós também calculados e comparados os números médios de uma cópia ganhos, perdas uma cópia, ganhos de cópia de alta, perdas homozigotos e LOH entre agrupadas e não agrupadas pares CRC-CLM (figura S3). comparação exaustiva de agrupamento hierárquico e semelhanças genéticas são descritas na próxima seção dos resultados.

exome sequenciamento

Realizamos todo exome seqüenciamento em 15 trios de tecido colorretal, amostras normais CRC, e CLM . Utilizando um ensaio de microssatélites com base em PCR, confirmou-se que todas as 15 amostras de CRC primários foram microssatélite-estável. As mutações foram detectados e filtrados de acordo com o nosso fluxo de trabalho-casa em bioinformática (Figura S4). No total, 1079 e 4366 foram identificadas mutações nas amostras de CRC e CLM, respectivamente (Tabela S1). Os espectros de mutação observada nas amostras de CRC e CLM foram consistentes com observações anteriores em tumores sólidos e não foram significativamente diferentes entre as amostras de CRC e CLM (Figura S5) [24].

Hipermutação e SCNA

Quatro amostras CLM (# 250, # 262, # 525 e # 721) foram hipermutada (Tabela S2). A fim de identificar a causa de hipermutação, avaliou mutações nos genes DNA polimerase (POLN, votação, POLQ, POLH, pólo, POLD1 e Polg) e genes da via DNA mismatch reparação, incluindo

MLH1

,

MLH3

,

MSH2

,

MSH6

,

PMS2

,

PMS6

,

ERCC2

,

ERCC5

,

ERCC6

,

MUTYH

,

RAD9A

,

EXO1

,

SLX4

,

ATR

e

BLM

. Os resultados revelaram que apenas as quatro amostras hipermutada CLM (# 250, # 262, # 526 e # 721) tinham uma ou mais mutações missense nos genes DNA polimerase e genes de reparo do DNA (Tabela S3). Estas quatro amostras hipermutada também mostrou um alto grau de SCNAs comparação com os seus CRCs primários combinados (Tabela 2), e foi particularmente notável que hipermutação foi significativamente associada com uma alta frequência de LOH (

P

= 2,782 × 10

-9) (Figura 2).

As amostras com hipermutação também contêm alta frequência LOH (P-value = 2.782e-09).

perfis de mutação somática e significativamente percursos alterados

Nós descobrimos que 2.224 genes tinham pelo menos 1 não sinónima, splicing, ou mutação frameshift nos CRCs ou CLMS (Tabela S5). Estes dados foram então usados ​​para investigar o estado mutacional das principais vias de sinalização alterados em CRC (isto é, aqueles centrados em P53, Wnt, TGF-beta, e VEGF), por comparação das frequências com as quais os genes envolvidos nestas vias foram mutados (Figura 3). Este revelou que

APC

foi mutado em 73% de ambas as amostras de CRC e CLM,

TP53

em 47% das amostras de CRC e 67% das amostras de CLM, e

KRAS

em 33% de ambas as amostras de CRC e CLM.

SMAD4

,

FAT4

, e

BRAF

também foram mutados nas amostras de CRC e CLM com frequências variadas. Na via de sinalização VEGF, encontramos mutações no

KDR

(0% e 27%),

FLT1

(7% e 7%), e

FLT4

( 0% e 7%) genes do CRCs e CLMS, respectivamente (Figura 3). Mutações em genes da via VEGF foram confinados principalmente para as amostras CLM, o exemplo mais flagrante dos quais sendo o

KDR

gene que só foi mutado nas amostras CLM hipermutada (Tabela 3).

Avaliando relações genéticas com base em mutações e SCNA

Para avaliar as relações genéticas entre os 15 pares de amostras de CRC e CLM, avaliou-se as mesmas alterações genotípicas e mutações nos genes dos principais motores do câncer ocorreu em cada par. Esta avaliação baseou-se no pressuposto de que CRC e CLM pares com alterações genéticas semelhantes poderão partilhar mutações nos genes principais do controlador. Em oito casos, o par CRC-CLM, de fato, mutações de acções nas principais genes relacionados com o CRC (

APC

,

KRAS

,

TP53

,

SMAD4

,

BRAF

, e

FAT4

) (Tabela S4). Nestes pares, não se observou qualquer diferença significativa no número de mutações entre as amostras e CRC (CLM

P

= 0,28) (Tabela 4). Por outro lado, nos restantes sete casos, nenhum dos pares de CRC-CLM compartilhado uma mutação nos principais genes relacionados com o CRC; no entanto, o número total de mutações diferiram significativamente entre as amostras de CRC e CLM (

P Art 0,05) (Tabela 4 e Tabela S4)

É importante salientar, análise de concordância do. dados de mutação reconciliados com a análise de dados SCNA. Todos os pares CRC-CLM, que foram estreitamente relacionados no agrupamento hierárquico não supervisionado de dados SCNA, mutações comuns nos principais genes relacionados com o CRC (53%). No entanto, as sete pares CRC-CLM que foram apenas remotamente relacionados no agrupamento hierárquico dos dados SCNA, não compartilham uma mutação em genes relacionados com o CRC-chave (47%).

No seu conjunto, estes resultados indicam que em 53% dos casos, cada par CRC-CLM tinham alterações genéticas semelhantes, enquanto aqueles nos restantes 47% dos casos tinham alterações genéticas distintas.

Discussão

ao comparar a SCNA dados e mutação perfis de 15 amostras duplas de CRC e CLM, descobrimos que aproximadamente metade deles, mostrou heterogeneidade genética no que diz respeito ao seu correspondente CRC primário. Para o melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro estudo abrangente de usar perfil genômico de CRCs primários e suas metástases combinados e definir as características distintas das lesões metastáticas em termos da sua mutação e perfis SCNA.

Fifty -Três por cento dos pares de CRC-CLM no grupo de cluster compartilhado um elevado número de mutações, incluindo alguns no

APC

,

KRAS

,

TP53

, e

SMAD4

genes (Tabela 4, Figura 1). A presença de muitas mutações em comum (30-65%) indicaram que as mutações somáticas podem acumular-se dentro do microambiente de um cancro primário antes de comunicar às suas metástases, algo comumente referido como o modelo de progressão linear da evolução do tumor [22]. Os restantes 47% dos pares de CRC-CLM, que foram agrupados de forma independente um do outro, mostrou diferenças significativas nos seus perfis de mutação e de dados SCNA. Eles não tinham mutações comuns em genes de câncer de início e que não houve diferenças significativas nos perfis SCNA (Figura 1). A relação distinta e heterogeneidade genética proeminente nestes pares indicam que os CLMS pode ter se originado a partir de um grupo de clones CRC primárias geneticamente distintas que interagem em estreita proximidade com o modelo policlonal da progressão do tumor.

Seis pares CRC-CLM teve somática mutações KRAS em pelo menos uma amostra. Três pares tinha as mesmas mutações KRAS, e as outras três não. Portanto, a taxa de mutação KRAS discordância entre pares CRC-CLM foi de 50% (06/03) (Figura 1 e Tabela S4). Knijn e colaboradores [25] relataram alta taxa de concordância de mutações KRAS entre tumores CRC e CLM primários. Em contraste, uma série de estudos demonstrou elevada taxa de discordância, entre os pares de CRC-CLM, de mutações KRAS variando de 8% -60% [26] – [28]. Em nosso estudo, esses três pares CRC-CLM com estado de mutação KRAS discordantes também foram agrupadas distintamente por análise SCNA. A discordância de mutação KRAS, juntamente com padrões de agrupamento SCNA distintas, entre estes pares de CRC-CLM suporta nossa hipótese de que CRCs primários e suas CLMS correspondentes podem ter diferentes origens clonais nestas amostras.

O modelo de progressão do tumor policlonal pode ajudam estratégias terapêuticas directas [4]. A principal desvantagem de um modelo de origem do tumor monoclonal é o pressuposto de que a maioria dos eventos iniciais que levaram ao cancro primário também será encontrado nas células metastizados, com vista a possibilidade de que pequenas populações de células tumorais com características genéticas diferentes em estreita proximidade uns com os outros podem ser responsáveis ​​para a metástase [4]. Tais células metastáticas, que se originam a partir de tumores primários, pode ter uma diferente resposta à terapia.

Hipermutação causada pela perda de actividade de reparação de emparelhamentos incorrectos do ADN é denominado MSI [29]. Descobrimos que quatro amostras CLM foram microssatélites instáveis, resultando em hypermutations. O

KDR

gene, um marcador de prognóstico significativo na carcinoma colorectal [30], foi mutado apenas nas amostras hipermutada. É também de salientar que houve uma aparente relação entre hipermutação e instabilidade cromossômica. Recentemente, um número de cópias do estatuto distinto do gene de reparação de emparelhamentos incorrectos do ADN

MLH1

foi mostrado estar associado com níveis elevados de mutação no cancro pancreático [31]. Estudos anteriores mostraram contradizendo evidências sobre tumores MSI e instabilidade cromossômica em cânceres colorretais. Alguns estudos relataram que os tumores MSS apresentam maior taxa de instabilidade cromossômica que os tumores MSI [32] – [35]. Outros estudos relatam a sobreposição substancial entre tumores MSI e cromossomo instabilidade [32], [35] – [38]. De nota, todos estes estudos foram feitos utilizando amostras de CRC primários, e da relação do MSI e instabilidade cromossômica em amostras CLM ainda está para ser revelado. Descobrimos que os tumores MSI foram associados com um grande número de genes deleções /amplificações e aumento da frequência de PDH, por outras palavras, a instabilidade cromossómica em tumores CLM. Mais investigação é necessária para revelar a relação entre a MSI, a instabilidade dos cromossomas e a metástase de CRCs primárias.

A angiogénese é regulado principalmente por interacções entre factores de crescimento endotelial vascular e receptores de VEGF e desempenham um papel central no crescimento e metástase [cancro ,,,0],39], [40]. Vários estudos têm relatado o polimorfismo genético do gene KDR implicando o risco de doenças da artéria coronária [41], [42]. No entanto, o papel de clara indivíduo KDR SNPs e as suas funções fisiológicas em progressão e prognóstico do cancro continua a ser desconhecido. No presente estudo, todos os pacientes com KDR SNPs (isto é, rs187037 e rs2305948) tiveram recidiva após a ressecção curativa de CRC e do fígado (p = 0,925; dados não mostrados). No entanto, devido à pequena amostra mutação KDR não foi estatisticamente significativa. Um número maior de amostras são necessários para validar a mutação KDR e seu papel característico na recorrência do tumor.

O tempo médio de sobrevivência de pacientes com câncer colorretal metastático aumentou de 6-8 meses a mais de 2 anos, devido à surgimento de tratamento específicos e melhorados ressecções cirúrgicas. No entanto, a opção terapêutica para não-respondedores a oxaliplatina ou a quimioterapia à base de irinotecano, com ou sem cetuximab ou bevacizumab, é muito limitado. Assim, melhores estratégias de tratamento para câncer colorretal metastático têm de ser desenvolvidas. Um corpo emergente de evidências sugere que CRC primária pode apresentar-se como policlonal na natureza e que as metástases resultantes podem, portanto, ter um geneticamente diferente da maior parte do tumor primário. Em tais casos, a biologia e perfil genético do tumor primário pode ser significativamente diferente das metástases. Esta seria uma preocupação importante na terapia-alvo, personalizado. Os nossos resultados sugerem que os padrões de mutação de aproximadamente 50% dos tumores metastáticos do fígado pode ser diferente da do tumor primário, que sublinha a necessidade de avaliar metástases separadamente para a identificação de potenciais alvos para terapia sistémica.

Materiais e Métodos

população do estudo

Entre Junho de 2009 e Junho de 2011, 53 pacientes foram submetidos à ressecção curativa do CRC e metástases hepáticas em Gachon Universidade Gil Hospital (Incheon, Coreia do Sul). Os critérios para inclusão no estudo foram os seguintes: (1) metástases hepáticas do CRC confirmado por tomografia computadorizada espiral abdominopelvic; (2) a metástase do fígado como a primeira manifestação da doença M1 sem qualquer doença disseminada documentada, tal como determinado por imagem pré-operatória; (3) sem história prévia de chemoradiation ou quimioterapia neoadjuvante, incluindo agentes direcionados moleculares; (4) ressecção curativa realizada para ambas as lesões colorretais e fígado primárias; (5) os espécimes ressecados deve ser tumores síncronos (ressecção simultânea,

N

= 11; ressecção de duas fases no prazo de 6 meses,

N

= 4); e (6) microssatélites CRCs primárias estáveis. Foram selecionados 15 pacientes com CRC e combinados metástase hepática com base nesses critérios de inclusão. As características básicas dos pacientes são mostradas na Tabela 1. Todos os tumores foram revistos por um único patologista, e apenas amostras com 70% de conteúdo de tumor foram incluídos na análise. Os protocolos de estudo foram aprovados pelo Institutional Review Board of Gachon Universidade Gil Hospital (número de aprovação IRB: GIRBA 2535). consentimento informado por escrito foi exigido de todos os participantes. Informações, como sexo, idade, estágio do tumor, foi extraído da base de dados clínicos para este grupo.

baseada em PCR ensaio microssatélites

Um conjunto de marcadores microssatélites consistem em dois marcadores mononucleótido de repetição ( BAT25 e BAT26) e três marcadores dinucleótido de repetição (D2S123, D5S346, e D17S250), como recomendado pelo Instituto do Câncer Consenso Grupo Nacional, foram utilizados para determinar tumor estatuto da instabilidade de microssatélites (MSI). Alíquotas contendo 50 ng de ADN foram amplificadas em misturas reaccionais de 20 ul contendo 2 ul de tampão 10 x (Roche, Mannheim, Alemanha), 1,7-2,5 mmol /L de MgCl

2, 0,3 uM de cada par de iniciadores, 250 uM de desoxinucleótidos trifosfatos , e 2,5 U de DNA polimerase (Roche, Mannheim, Alemanha). A PCR foi realizada com um passo de desnaturação inicial de 94 ° C durante 5 min, seguido de 30 ciclos de 1 min a 94 ° C, 1 min a 55 ° C e 1 min a 72 ° C e um passo final de prolongamento de 10 min a 72 ° C. As amostras foram analisadas num ABI Prism 3100 Genetic Analyzer utilizando 0,7 uL de amostra amplificada combinada com 0,3 mL de GeneScan 500 tamanho padrão e 9 mL de Hidi formamida de acordo com as orientações do fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Os dados foram analisados ​​usando o software ABI Prism 3100 Coleta de Dados (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA).

extracção do ADN, preparação da biblioteca, e orientada exome sequenciamento

O DNA foi extraído usando um DNeasy Blood Kit de tecido (Qiagen, Valencia, CA, EUA). qualidade do ADN foi verificada por electroforese em gel de agarose a 1%, e a concentração de ADN foi medida utilizando um ensaio de PicoGreen dsDNA (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). bibliotecas SureSelect sequenciação foram preparados de acordo com as instruções do fabricante (Agilent SureSelect Todos Exon Kit 38 Mb; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA), utilizando um manipulador de líquidos Bravo automatizado. A qualidade das bibliotecas amplificadas foi verificada por electroforese capilar (Bioanalyzer; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA), após o que emparelhado-end sequências de ADN foram obtidos a partir das bibliotecas usando a plataforma Illumina HiSeq (Illumina, San Diego, CA, EUA).

Bioinformatics análise

os dados da seqüência foram alinhados ao genoma de referência humano GRCh37 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/assembly/grc/humana /index.shtml) usando o Burrows-Wheeler alinhador [43] com os parâmetros predefinidos. Nós sequenciado na profundidade média de 52.44X para regiões-alvo. As duplicatas PCR foram removidos usando o algoritmo Picard (https://picard.sourceforge.net). Foi realizada realinhamento e recalibração de qualidade para os dados sequenciados usando o Genome Analysis Toolkit (GATK) [44]. Após o alinhamento, foram utilizados Varscan [45], Strelka [46], e Mutect [47] para chamar mutações, incluindo inserções e deleções (indels), para cada posição cromossómica e é também utilizado GATK [44] para a detecção indel com 15 espécimes tripleto consistindo de tecido normal colorectal, CRC primária e CLMS combinados. Nós anotado as mutações usando ANNOVAR [48] com o banco de dados da anotação Gene Ensembl de genoma humano construir 37 (https://www.ensembl.org/) e procurou partidas na dbSNP137 (http: //www.ncbi.nlm. nih.gov/projects/genome/assembly/grc/human/index.shtml), 1000 genomas de dados [49], e banco de dados COSMIC [50]. Nós filtrado as mutações das regiões visadas e selecionados não sinónima, sinónimo, o ganho ou perda do códon de parada, indels frameshift, indels non-quadro de leitura, e mutações no local splicing.

análise SCNA

foi utilizada a matriz de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) de CytoScan ™ HD (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA, EUA). análise SCNA da Matriz CytoScan ™ HD foi realizada utilizando software BioDiscovery Nexus Copiar Número 6.1 (https://www.biodiscovery.com/software/nexus-copy-number/). O Adaptive Unidos Segmentação Técnica 2 algoritmo SNP-Fast segmentação foi usado com parâmetros predefinidos.

Clustering

Foi realizado ligação completa agrupamento hierárquico para avaliar a concordância entre as amostras de CRC e CLM primários. ligação média e único agrupamento hierárquico também foram aplicados; no entanto, todos os métodos de agrupamento produziu resultados semelhantes. Emparelhado

t

-teste e de duas amostras

t

-test foram utilizados para análises estatísticas, e

P

. 0,05 foi considerado para indicar significância estatística

Data link

Os dados exome sequenciamento completo: Sequência Recuperar Archive (SRA) número de acesso é SRP034161

Cytoscan de dados de matriz:.. o número de acesso GEO é GSE53799

Apoiando informações

Figura S1.

fluxo de trabalho para análise da variação do número de cópias (CNV)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090459.s001

(TIF)

Figura S2.

padrões SCNA de pares de CRC-CLM. Os ganhos são representados em azul, as perdas em vermelho e LOH em marrom. 8/15 CRC-CLM pares agrupados mostrou alta similaridade nos padrões SCNA comparação com o resto dos pares de não agrupadas 7/15 CRC-CLM

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090459.s002

(TIF)

Figura S3. frequências

Média SCNA de pares de CRC-CLM agrupadas e não agrupadas. (A) alta de cópia ganhos, perdas homozigotos e LOH são altamente variáveis ​​em pares CRC-CLM não agrupadas. elevados ganhos de cópias em agrupados CRC-CLM também mostrou variabilidade. (b) As perdas de uma cópia em pares CRC-CLM não agrupadas apresentaram variabilidade

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090459.s003

(TIF)

Figura S4.

de fluxo de trabalho para análise exome sequenciamento inteiro de doi:. 10.1371 /journal.pone.0090459.s004

(TIF)

Figura S5.

Mutação espectros de CRCs e CLMS. (A) espectro de mutações de CRCs e seus correspondentes CLMS excepto amostras hipermutada. espectro (B) A mutação de quatro amostras CLM hipermutada

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090459.s005

(TIF)

Tabela S1. .

Número de mutações somáticas no CRCs e CLMS

doi: 10.1371 /journal.pone.0090459.s006

(DOCX)

Tabela S2. .

Número total de mutações em cada pares de CRC-CLM

doi: 10.1371 /journal.pone.0090459.s007

(DOCX)

Tabela S3. estatuto

mutacional de incompatibilidade de DNA genes de reparação da via e genes DNA polimerase em CRCs e CLMS

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090459.s008

(DOCX)

Tabela S4.

mutacional concordância entre pares de CRC e CLM. Todos os pares CRC-CLM estreitamente relacionados em mutações compartilhadas hierárquicos nos principais genes relacionados com o CRC

doi: 10.1371. /Journal.pone.0090459.s009

(DOCX)

Tabela S5.

Mutações e genes mutados nos CRCs e CLMS (a tabela é fornecida como arquivos Excel)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090459.s010

(XLSX)