Sumário

O câncer de pulmão é um dos tipos mais comuns de câncer e faz com 1,38 milhões de mortes por ano, a partir de 2008 em todo o mundo. Identificação de agentes anti-câncer de pulmão naturais tornou-se muito importante. ácido Gambogenic (GNA) é um dos compostos activos de Gamboge, uma medicina tradicional, que foi utilizado como um purgante drástico, emético, ou para o tratamento de vermífugo ténia. Recentemente, evidências crescentes indicou que a GNA exerce efeitos anti-tumorais promissoras; No entanto, o mecanismo subjacente permanece obscura. No presente trabalho, descobrimos que GNA poderia induzir a formação de vacúolos, que estava ligada a autofagia nos A549 e as células HeLa. Outros estudos revelaram que a GNA desencadeia o início de autofagia com base nos resultados de coloração MDC, coloração AO, acumulação de LC3 II, a activação de um beclin e fosforilação de p70S6K. No entanto, a degradação da p62 foi interrompido e GFP livre não poderia ser lançado em GNA células tratadas, o que indica um bloqueio no fluxo de autofagia. Outros estudos demonstraram que GNA bloqueia a fusão entre autofagossomas e lisossomos inibindo acidificação nos lisossomos. Este autofagia disfuncional desempenha um papel pro-morte em células tratadas com GNA através da activação de p53, Bax e caspase-3 clivada, enquanto diminui a Bcl-2. Beclin um knockdown diminuiu significativamente a morte celular induzida por GNA e os efeitos sobre a p53, Bax, caspases-3 e Bcl-2 clivada. Foram obtidos resultados semelhantes utilizando um modelo de xenoenxerto. Nossos resultados mostram, pela primeira vez, que a GNA pode causar autofagia aberrante para induzir a morte celular e pode sugerir o potencial de aplicação GNA como uma ferramenta ou drogas viável em terapias anticâncer

Citation:. Mei W, Dong C , Hui C, Bin G, Y Fenggen, Jingjing S, et al. (2014) As células Ácido Gambogenic Kills do cancro do pulmão através aberrante autofagia. PLoS ONE 9 (1): e83604. doi: 10.1371 /journal.pone.0083604

editor: Eric Asselin, Universidade de Quebec em Trois-Rivieres, Canadá |

Recebido: 18 de junho de 2013; Aceito: 05 de novembro de 2013; Publicação: 10 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Mei et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China, No. 81173600 (Q.-L. Li); a National Science Foundation Natural da província de Anhui, China, No. 11040606M190 (Q.-L. Li) e Projeto chave na National Science Tecnologia Programa Pillar 2009ZX09103-399 (Q.-L. Li, Co-PI). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão tem sido um dos tipos mais comuns de câncer por várias décadas e é responsável por 15-20% de todas as mortes relacionadas com cancro em todo o mundo [1] – [2]. Até 2008, estima-se que 1,61 milhões de novos casos por ano foram notificados em todo o mundo. O cancro do pulmão é a causa principal de morte no mundo desenvolvido e o cancro mais comum na China [3]. A ressecção cirúrgica é o principal método de tratamento para câncer de pulmão. No entanto, a terapia de quimioterapia /radiação ainda é o tratamento eficaz para pacientes com cancro avançado não pequenas do pulmão (NSCLC) ou cancro do pulmão de pequenas células [4]. Consequentemente, novas estratégias terapêuticas e drogas são urgentemente necessárias para o tratamento de câncer de pulmão.

A autofagia é um processo de auto-digestivo fisiológico que degrada componentes citoplasmáticos para sustentar o metabolismo celular durante a privação de nutrientes e /ou estresse metabólico. Durante a autofagia, macromoléculas, proteínas de longa duração e organelas danificadas (como o retículo endoplasmático e mitocôndrias) estão cercados por autofagossomas. Os autofagossomas então se fundem com os lisossomos, onde os conteúdos sequestradas sofrem degradação e reciclagem por hidrolases residentes. A autofagia é importante em todas as células para a remoção de proteínas de longa duração ou organelas danificadas. Isto faz com que a capacidade autofagia para ser um candidato promissor para um mecanismo de sobrevivência em resposta a várias tensões [5]. No entanto, vários estudos recentes têm sugerido que a autofagia também funciona como um mecanismo de pró-morte causados ​​por terapia anti-tumoral [6] – [9]. Na verdade, a morte celular autophagic é considerado para ser programado de morte celular tipo II, ao passo que a apoptose é programado de morte celular tipo I [10]. Estes dois tipos de morte celular têm sido descritos como formas distintas de morte celular; No entanto, muitos estudos mostram conversa cruzada entre os dois tipos. Por exemplo, o p53, o que é um potente indutor de apoptose, também podem induzir autofagia através do aumento da expressão de

DRAM

, um gene alvo directo p53 [11]. Beclin 1 /Atg 6 faz parte de um complexo de quinase PI3 Tipo III que é necessário para a formação das vesículas autofágicos. A interferência com beclin 1 pode prevenir a indução de autofagia. A interrupção da interacção entre o domínio BH3 dos beclin 1e Bcl-2 conduz a um aumento da autofagia [12] – [13].

ácido Gambogenic (GNA, C38H46O8, PM 631,32) (Figura 1A) é um dos mais principais componentes activos de Gamboge, uma resina de exsudado a partir da árvore de Garcinia hanburyi [14]. Gamboge é uma medicina tradicional que foi usado como um purgante drástico, emético, e vermífugo para tratar tênia. Gamboge tem sido utilizado no tratamento de cancro, incluindo cancro da mama, cancro do pulmão, sarcoma e carcinoma linfático cutaneum [15], numa clínica na China e mostrou efeitos excitantes [16]. Recentemente, evidências acumuladas demonstrou que a principal GNA componente activo tem um espectro mais alargado de efeitos anti-tumorais e mais baixa toxicidade [17] – [19]. Os efeitos bioquímicos e moleculares da GNA incluem a indução de apoptose em várias linhas celulares de cancro e em modelos animais de carcinogénese [20] – [24]. Yu et al. descobriram que GNA pode causar parada G1 dependente de GSK3b em células de câncer de pulmão, e sugeriu que GNA pode induzir a morte celular através de autofagia em vez de apoptose [25]. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes aos efeitos da GNA permanecem obscuros. Os presentes estudos revelam o mecanismo molecular eo papel da autofagia na morte das células tumorais induzida GNA.

A, A estrutura química do GNA. B, a GNA inibe o crescimento e inibe a morte celular em células cancerosas. As células A549 e HeLa foram tratados com várias concentrações de GNA para os períodos de tempo indicados, e a proliferação das células foi analisada pelo ensaio de MTT. C, as células não tratadas (controlo) ou células tratadas com GNA 3 uM durante 24 horas foram directamente observados sob um microscópio de contraste de fase (à esquerda) e vacuolização das células foi quantificada (direita); foram observados, pelo menos, 600 células. Significa ± SEM, n = 3.

Materiais e Métodos

Os ratos foram mantidos em um ambiente específico isento de patógeno. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo comité consultivo bem-estar animal da Universidade de Ciência e Tecnologia da China (Permit Number: 2010-11). foram tomadas as medidas adequadas para minimizar a dor e desconforto em conformidade com os regulamentos nacionais.

1. Reagentes e anticorpos

ácido Gambogenic (GNA) (Figura 1A), isolado de Gamboge, foi fornecido por laboratório do Prof. Xiaoshan Wang. A pureza GNA foi de 99%, a qual foi determinada por HPLC-DAD. MTT, monodansylcadaverine (MDC), iodeto de propídio (PI), anexina V, laranja de acridina e Hoechst 33342 foram adquiridos da Sigma. Rapamicina e trealose foram presentes amáveis ​​do Prof. Guanghui Wang. MitoTracker Vermelho, Lyso Tracker vermelho e verde LysoSensor DND-189 foram obtidas de Invitrogen. Os anticorpos foram adquiridos a LC3 Novus (NB100-2220), anticorpos de p62 eram de Biomol (PW9860), p70S6K (1494-1), p-p70S6K (3204-1) e p-p38 (1229-1) foram os anticorpos do Epitomics. GAPDH foi adquirido anticorpo da Chemicon (MAB374). GFP (sc-9996), caspase-3 (sc-7148), p53 (sc-6243), Bax (sc-7480), beclin um anticorpos (SC-11427), e Bcl-2 (SC-7382) foram adquiridos de Santa Cruz Biotechnology. Os reagentes foram dissolvidos em solução salina tamponada com fosfato (PBS), excepto a GNA e rapamicina, que foram preparadas em DMSO.

2. cultura de células

A linha de células A549 adenocarcinoma de pulmão humano foi comprado a partir do celular Bank of Shanghai Institute of Cell Biology. A linha celular de carcinoma epitelial humano HeLa e células GFP-LC3 /HeLa estabelecidas foram fornecidas pelo Prof. Guanghui Wang [26]. Para o estabelecimento de uma linha celular estável expressando EGFP-LC3 fundido, células Hela foram transfectadas com EGFP-LC3, e os clones individuais que expressam estavelmente GFP-LC3 foram seleccionados utilizando 0,2 mg /ml de G418. Um clone de expressão moderada resistentes a G418 foi seleccionado para outras experiências. SPC-A-1, H460, GIC-82 e 16-HBE foram fornecidas pelo Prof. Guang Biao Zhou [25]. As células foram cultivadas em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) (Sigma) contendo soro de bovino fetal a 10% (FBS) (Invitrogen), 100 U /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina a 37 ° C sob 5% de CO

2.

3. Ensaio de viabilidade celular

ensaio MTT.

As células foram plaqueadas em placas de 96 poços a uma densidade de 1 x 10

4 células em 100 ul de meio por poço a 24 h antes da experimentar. Em seguida, as células foram então incubadas com várias concentrações de GNA, a 37 ° C durante a duração de tempo indicado. solução de MTT foi adicionado ao meio de cultura (500 ug /ml de concentração final) em 4 h antes do fim do tratamento. A reacção foi parada pela adição de SDS a 10% acidificado (100 ul) a cada poço. O valor de absorvância (A) a 490 nm foi medida utilizando um leitor de microplacas (Automated 800uv Bio-Tek elx, Bio-Tek Instrument Inc, Winooski, VT, EUA). A viabilidade celular foi expressa como (Asample – Ablank) /(Acontrol – Ablank) x 100%, em que A é a absorvância. Para as células tratadas com os reagentes, as células tratadas com o veículo foram utilizados como controlo. A peça em bruto representada MTT adicionado ao meio.

PI ou anexina V /PI ensaio de citometria de fluxo.

As células foram tratadas com as concentrações indicadas de GNA por 24 horas, colhidas por tripsinização, em seguida, lavada duas vezes com PBS, incubadas com PI sozinho ou em conjunto com anexina V-isotiocianato de fluoresceína, durante 10 minutos ao abrigo da luz e avaliadas por citometria de fluxo (Becton Dickinson, EUA). A percentagem de células mortas foi determinado com base na permeabilidade da membrana plasmática para PI.

ensaio de coloração com azul de Trypan.

As células (2 x 10

5 células por poço) foram semeadas em 24 -bem placas de fundo plano. Após cultura durante 24 horas, 3? M GNA foi adicionado para os períodos de tempo indicados. As células foram, em seguida, separada do substrato por tripsinização e coradas com azul de Tripano solução (0,4% em PBS). O número de células mortas foi contado com um hemocitómetro sob um microscópio de luz (Olympus, Japão). Pelo menos 400 células foram contados para cada uma das amostras, e a experiência foi repetida três vezes.

4. Autophagic marcador de coloração

GFP-LC3 /células HeLa que tinham sido tratados com 3 uM de GNA para os períodos de tempo indicados foram incubadas com 10 uM monodansylcadaverine ou 75 nM Lyso Tracker vermelha durante 15 minutos. Depois de lavar duas vezes com PBS, as células foram examinadas por microscopia de fluorescência (Olympus, Japão).

5. Quantificação de organelos vesiculares ácidos com laranja de acridina

Após o tratamento com os reagentes indicados, as células foram coradas com laranja de acridina, a uma concentração final de 1 ug /ml durante 15 minutos ao abrigo da luz, em seguida, observado sob um microscópio de fluorescência ou colhidas por tripsinização e analisadas por citometria de fluxo.

6. microscopia electrónica de transmissão

As células foram colhidas por tripsinização e tecido de tumor foi ressecado, em seguida, lavada duas vezes com PBS e fixadas com paraformaldeído a 2% /2% de glutaraldeído em tampão de fosfato 0,1 M (pH 7,4), seguido de 1% de OsO

4. Após a desidratação, seções finas foram coradas com acetato de uranilo e citrato de chumbo para observação ao microscópio eletrônico JEOL TEM-100SX (JEOL, Japão).

7. A análise de imunotransferência

células ou tecidos de tumor foram lavadas em solução salina tamponada com fosfato frio (PBS) a 4 ° C, em seguida, foram preparadas as proteínas, separadas por 12% SDS-PAGE e transferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (Millipore) . A membrana foi incubada durante 1 h em PBS-Tween 20 (0,05%) contendo 5% de leite desnatado. Os anticorpos primários foram detectados utilizando carneiro anti-IgG de ratinho-HRP ou anti-IgG de coelho-HRP anticorpos secundários (Amersham Pharmacia Biotech). As proteínas foram visualizadas utilizando um kit de detecção ECL (Amersham Pharmacia Biotech). Um anticorpo anti-GAPDH (gliceraldeído-3-fosfato; Chemicon). Foi utilizado para assegurar a carga de proteína igual

Para re-sonda da membrana com um outro anticorpo primário, a membrana foi incubada primeiro com tampão de decapagem (50 Tris-HCl, pH 6,8, β-mercaptoetanol 0,1 mM, e SDS a 20 mM) durante 30 min a 50 ° C, depois sujeito a análise western blot, seguindo o protocolo padrão.

8. ARN de interferência

oligonucleótidos de cadeia dupla 5′-segmentação CCACUCUGUGAGGAAUGCACAGAUA-3 ‘de um ARNm humano beclin foi sintetizado por Shanghai GenePharma (Xangai, China), e um oligonucleótido irrelevante serviu como um controlo negativo. A transfecção foi efectuada utilizando Lipofectamina 2000 reagente (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, o siARN e Lipofectamine 2000 (Invitrogen) foram misturados em meio Opti-MEM (Invitrogen) e incubou-se durante 30 min à temperatura ambiente para permitir a formação do complexo. Em seguida, as células foram lavadas com meio Opti-MEM (Invitrogen), e a mistura foi adicionada. Ao fim de 12 h após a transfecção, o meio de cultura foi substituído com meio completo fresco. As células foram colhidas 72 horas após a transfecção e analisadas.

9. mouse modelo de xenotransplante

ratinhos nus BALB /CA (30-40 dias de idade e pesando 18-20 g) foram divididos em grupos contendo seis ratos por grupo. As células A549 foram injectadas s.c. (2 × 10

6 células por rato) na pata traseira direita dos ratos. Após os tumores foram estabelecidos (~ 50 mm

3), os ratinhos foram i.v. injectados com ou sem 16 mg /kg duas vezes por GNA semana durante três semanas. Ao fim de 24 horas após a última i.v. injeção, os tumores foram isolados por microscopia eletrônica de transmissão e análise de transferência de western.

10. Avaliação do pH nos lisossomas

Após o tratamento de células A549 com GNA 3 mM para os períodos de tempo indicados, as células foram incubadas com 1 mM LysoSensor verde NI-189 durante 15 min. As células foram lavadas duas vezes com PBS, em seguida, examinadas por microscopia de fluorescência (Olympus, Japão).

Resultados

1. GNA inibe o crescimento e induz a morte celular em células cancerosas

O efeito da GNA sobre o crescimento celular foi investigada utilizando um ensaio de MTT em várias linhas celulares de cancro humano. Em primeiro lugar, examinou o efeito da GNA sobre a viabilidade celular de A549 e células HeLa. Como mostrado na Figura 1, a GNA inibiu o crescimento de células HeLa e A549 de forma e concentração-tempo-dependente (Figura 1B). Para confirmar os efeitos da GNA em células de cancro do pulmão, o ensaio de MTT foi repetido em várias outras linhas celulares de cancro de pulmão (H460, SPA-c-1, GLC-82 e a linha de células epiteliais brônquicas normais 16-HBE). H460, SPA-C-1 e GLC-82 foram todos sensíveis a GNA, ao passo que 16-HBe era menos sensível a GNA (Figura S1A). Estes resultados indicam que GNA pode eficazmente matar células de câncer de pulmão com baixa toxicidade.

Curiosamente, quando foi realizada uma luz ensaio de cinética de microscopia, descobrimos que as células tratadas com GNA mostrou uma acumulação progressiva de vacúolos intracitoplasmáticos que eram semelhantes para os que muitas vezes observada em células que sofrem autofagia (Figura 1C). Enquanto isso, foi observado um aumento da percentagem de células com vacúolos grandes visíveis nas células tratadas com GNA em comparação com as células de controlo (Figura 1C), consistente com um mecanismo relacionado-autofagia.

2. GNA aumentar marcadores autofágicos em A549 e células HeLa

Uma série de experiências foram realizadas para determinar se é induzida por autofagia GNA. Primeiro, usamos monodansylcadaverine (MDC), um composto conhecido lysosomotropic para rotular endossomas ácidas, lisossomos e autofagossomas [27]. Como mostrado na Figura 2A, as células A549 tratadas com GNA mostrou um aumento dramático no número de vesículas MDC-marcadas, indicando que a GNA poderia induzir a formação de organelos vesiculares ácidas (AVO), que é uma característica da autofagia. Para quantificar estes Avos, acridina laranja coloração vital foi realizada e analisada por FACS. Descobrimos que a acridina laranja-avos positivo aumentado em células A549 tratadas com GNA em relação às células de controlo (Figura 2B, 2C); rapamicina foi usada como um controlo positivo.

A, Imagens representativas da coloração de MDC. As células A549 foram tratadas com 3 uM GNA durante 24 horas, em seguida coradas com 10? M monodansylcadaverine (MDC) e observados sob um microscópio de contraste de fase. B e C, laranja de acridina coloração. As células foram expostas às concentrações indicadas de GNA durante 24 horas, em seguida, coradas com 1 ug /mL de acridina laranja (B, C) e observados sob um microscópio de contraste de fase (B) ou analisados ​​por citometria de fluxo (C). As células que foram tratadas com 50 ug /ml de rapamicina foram utilizadas como um controlo positivo. Os resultados apresentados são representativos de pelo menos 2 experiências independentes. D, imagens de microscopia eletrônica representativos de células A549 tratadas com GNA. As células foram tratadas com 3 GNA mM para os períodos de tempo indicados e analisados ​​por microscopia eletrônica. As setas indicam os vacúolos contactar com vesículas que foram densamente cheios de estruturas multi-lamelares.

A presença de autofagossomas, os quais apresentam estruturas de dupla membrana de vesículas, é considerado como sendo a marca de autofagia. Nós examinamos se esta estrutura formada em células A549 tratadas com GNA sob um microscópio eletrônico (EM). Como se mostra na Figura 2D, as células tratadas com GNA mostraram aumento da formação de autofagossomas relativos às células de controlo.

3. GNA desencadeia a formação de marcadores autofágicos em A549 e células HeLa

para confirmar a indução mediada por GNA de autofagia, examinámos a expressão de marcadores autophagy, incluindo LC3. Durante a autofagia, LC3 é convertido de forma livre (LC3-1) para uma forma menor proteoliticamente processada (LC3-II). GFP-LC3 /células HeLa que expressam de forma estável GFP-LC3, foram tratados com as concentrações indicadas de GNA para 24 horas; estas células tratadas com GNA exibiram um aumento dramático na distribuição pontuada de GFP-LC3 de um modo dependente da concentração, enquanto que as células não tratadas apresentaram uma aparência GFP-LC3 difusa. A determinação quantitativa indicou que o número de células que continham pelo menos 5 GFP-LC3 pontuam pontos também aumentou de uma forma (Figura 3A), dependente da concentração. análise de transferência de Western de células A549 tratadas com GNA mostrou um aumento notável no nível de LC3-II de um modo da sua concentração e tempo-dependente (Figura 3B). Resultados semelhantes foram obtidos em H460, SPA-C-1 e linhas de células de Glc-82 do cancro do pulmão, ao passo que a linha celular de pulmão normal 16-HBe era menos sensível a GNA (Figura S1B).

A, Efeitos de GNA sobre a distribuição dos pontua GFP-LC3. GFP-LC3 /células HeLa foram tratados com várias concentrações de GNA ou 50 ng /ml de rapamicina durante 24 horas, em seguida, detectadas por microscopia de fluorescência. A percentagem de células com, pelo menos, 5 GFP-LC3 pontuam pontos foi calculado; Foram observados pelo menos 600 células, médias ± SEM, n = 3, ** significa p 0,01, ANOVA de uma via. B, Efeitos da GNA em proteína LC3. As células A549 foram tratadas com várias concentrações de GNA durante 24 horas ou GNA 3 mM para os períodos de tempo indicados e em seguida analisados ​​por transferência de Western utilizando anticorpos anti-LC3. proteína GAPDH foi usada como controlo de carregamento. O gráfico de barras mostra as intensidades das bandas de LC3-II em relação aos de GAPDH. Média ± SEM, n = 3, * significa p 0,05, ** p 0,01, ANOVA de uma via. C, Efeitos da GNA em proteína Beclin1. As células A549 foram tratadas com 3 uM GNA para os períodos de tempo indicados e em seguida analisados ​​por transferência de Western utilizando anticorpos anti-Beclin1. proteína GAPDH foi usada como controlo de carregamento. O gráfico de barras mostra as intensidades das bandas de beclin 1 em relação aos dos GAPDH. Média ± SEM, n = 3, * significa p 0,05, ** p 0,01, ANOVA de uma via. D, os efeitos da GNA em p70S6K fosforilação. As células A549 foram tratadas com 3 uM GNA para os períodos de tempo indicados, em seguida, analisadas por western blotting utilizando anticorpos anti-p-p70S6K anti-p70S6K e. proteína GAPDH foi usada como controlo de carregamento. O gráfico de barras mostra as intensidades das bandas de p-p70S6K relativos aos de GAPDH. Média ± SEM, n = 3, * significa p 0,05, ** p 0,01, ANOVA one-way

Os níveis de beclin 1, um produto de gene ATG que é essencial para a autofagia [. ,,,0],28], aumentou claramente ao longo do tempo em células A549 tratadas com GNA (Figura 3C). O Ser /Tre cinase mTOR age como um gatekeeper no processo autofagia, e actividade reduzida de mTOR tem sido associada com níveis elevados de autofagia. P70S6K é um substrato de mTOR e a sua fosforilação é dependente da actividade da mTOR. Descobrimos que p70S6K fosforilação claramente diminuiu ao longo do tempo após o tratamento GNA (Figura 3D), indicando atividade de mTOR reduzida. Juntos, estes resultados sugerem fortemente que a GNA desencadeia o início de marcadores autofágicos em A549 e células HeLa.

4. GNA inibe a fusão entre autofagossomas e autolysosomes

Porque GNA desencadeou o início de marcadores autofágicos, nos perguntamos se GNA poderia desencadear fluxo autofágica. Para resolver esta questão, avaliamos se as mudanças ocorreram em GFP-LC3, que também tem sido usada para monitorar o fluxo autofágica. Quando GFP-LC3 é entregue para um lisossoma, a porção LC3 da quimera é sensível à degradação, ao passo que a proteína GFP é relativamente resistente à hidrólise. Portanto, a medição dos níveis de GFP clivado por Western blotting pode monitorizar o fluxo de autofagia. Como mostrado na Figura 4A, o nível de GFP livre ligeiramente alterada mediante tratamento GNA, enquanto a GFP-LC3-II claramente aumentou ao longo do tempo. Muito diferentes resultados foram observados após tratamento com trealose (um indutor autofagia normal), o qual foi utilizado como um controlo positivo. Monitorou-se ainda mais o nível de p62 endógena /SQSTM1 mutada, um substrato autofagia-lisossoma que está associada com a degradação da proteína autofagia-lisossomal. A acumulação de p62 é considerado como um marcador para a inibição da autofagia ou interrupção da degradação autophagic. GNA bloqueou a degradação de p62 numa forma e concentração-tempo-dependente (Figura 4B), o que sugere que a GNA prejudica degradação autophagic. Resultados semelhantes foram obtidos em H460, SPA-C-1 e linhas de células de Glc-82 do cancro do pulmão, ao passo que a linha celular de pulmão normal 16-HBe era menos sensível a GNA (Figura S1B).

A, Efeito de GNA no fluxo de autofagia. células GFP-LC3 /HeLa foram cultivadas na ausência (controlo) ou na presença de 3 uM de GNA para os períodos de tempo indicados, e o nível de GFP foi clivado analisadas por western blotting utilizando um anticorpo anti-GFP; trealose 100 mM foi usado como um controlo positivo. proteína GAPDH foi usada como controlo de carregamento. O gráfico de barras mostra as intensidades das bandas de GFP-LC3-II ou clivada GFP em relação aos de GAPDH. Média ± SEM, n = 3, * significa p 0,05, ** p 0,01, ANOVA de uma via. B, dose e efeitos dependentes do tempo de GNA sobre a degradação de p62. As células A549 foram tratadas com várias concentrações de GNA durante 24 horas ou 3 a GNA mM para os períodos de tempo indicados, e os níveis de proteína p62 foram analisadas por western blotting. proteína GAPDH foi usada como controlo de carregamento. O gráfico de barras mostra as intensidades das bandas de p62 em relação aos de GAPDH. Média ± SEM, n = 3, ** p 0,01, ANOVA de uma via. C, inibição da fusão entre autofagossomas e lisossomos no tratamento com GNA. GFP-LC3 /células HeLa foram tratados com 3 uM GNA para os períodos de tempo indicados e subsequentemente corados com 75 nM de Lyso Tracker vermelho (LTR) durante 15 min. As imagens de microscopia de fluorescência representativos são mostrados. D, a inibição da acidificação lisossoma após tratamento com GNA. As células A549 foram tratados com 3 GNA mM para os períodos de tempo indicados ou 500 mm de bafilomicina A1 durante 8 horas e posteriormente coradas com 1 mM LysoSensor Verde DND-189 para 15 min. As imagens de microscopia de fluorescência representativos são mostrados.

Em conjunto, estes resultados sugerem fortemente que a GNA pode interromper a degradação da autofagia numa fase tardia.

A seguir, questionou qual o processo é afetado por GNA. Foi examinado o efeito da GNA sobre a co-localização de autofagossomas e lisossomos. Tal como mostrado na Figura 4C, numerosos pequenos intensamente coradas pontos de GFP-LC3 (autofagossomas) e Lyso Tracker vermelho (LTR) pontos -stained (lisossomas) foram co-localizada dentro de 6 horas após o tratamento a GNA. No entanto, esta co-localização foi interrompida após 12 e 24 horas após o tratamento GNA; as pequenas e intensamente coradas pontos GPF-LC3 parecia acumular e se tornou grandes, regiões intensamente coradas, o que sugeria que a fusão entre autofagossomas e lisossomos foi bloqueado. Estudos anteriores mostraram que algumas drogas, tais como a bafilomicina CQ e A1, pode elevar o pH de lisossomas para inibir a fusão com autofagossomas. Nós questionaram se GNA tem efeitos semelhantes. Foi avaliado o efeito da GNA na acidificação lisossoma através da coloração com LysoSensor Verde DND-189, uma sonda fluorescente acidotropic que pode ser preso em organelas ácidas. Bafilomicina A1 foi utilizada como um controlo positivo. Como mostrado na Figura 4D, rotulagem lisossoma foi interrompida no prazo de 12 horas após o tratamento e GNA foi muito mais obviamente afectados às 24 e 36 horas (semelhante aos efeitos de bafilomicina A1), indicando inibição de acidificação lisossoma. Esta observação pode explicar a inibição mediada pelo GNA da fusão entre autofagossomas e lisossomos. Portanto, embora a GNA desencadeia a formação de autofagossomas, GNA também bloqueia a progressão do processo de autophagic por supressão de fusão entre os autofagossomas e lisossomas, inibindo deste modo a degradação do conteúdo.

5. O knockdown de beclin 1 diminui induzida por GNA cancro morte celular

Os dados anteriores indicam que a GNA pode induzir a morte celular por apoptose. Para determinar se a morte celular causada por GNA se correlaciona com a autofagia disfuncional, nós ainda empregada pequeno RNA de interferência (siRNA) para derrubar a expressão de beclin 1, um gene essencial para a autofagia. A transfecção de ARN dos oligonucleótidos contra Beclin1 (beclin um siARN) em células A549 suprimiu com sucesso o nível de proteína endógena beclin 1 em comparação com células transfectadas com ARNsi de controlo, indicando que a beclin um siRNA é eficiente (Figura 5A). Após 24 ou 36 horas de tratamento com 3 uM GNA, as células beclin um knockdown exibida significativamente menor morte celular em comparação com células de controlo (Figura 5B), sugerindo que a morte celular induzida por GNA está relacionada com autofagia disfuncional.

, oligonucleotídeos de RNA contra beclin 1 (beclin 1 siRNA) efetivamente reprimir beclin 1 expressão. As células A549 foram transfectadas com ARNsi contra beclin 1 ou um controlo negativo, e o nível de proteína de Beclin1 foi analisada por Western blotting. proteína GAPDH foi usada como controlo de carregamento. O gráfico de barras mostra as intensidades das bandas de Beclin1 relativos aos de GAPDH. Média ± SEM, n = 3, ** p 0,01, ANOVA de uma via. B, células A549 foram transfectadas com ARNsi contra beclin 1 ou um controlo negativo. As células foram, em seguida, tratada com 3 uM GNA para os períodos de tempo indicados, corados com Hoechst 33342 2 ^ M e observados sob um microscópio de fluorescência; a percentagem de células mortas foi quantificado por coloração com azul de Tripano. A média ± SEM, n = 3, * significa p 0,05, ** p 0,01, ANOVA one-way

6.. GNA induz alterações nos níveis de proteínas relacionadas à apoptose

Em seguida, investigou-se a via pela qual a autofagia morte celular induzida disfuncional ocorre após o tratamento GNA. Evidências crescentes indicou que a conversa cruzada entre autofagia e apoptose é especialmente complicado pelo facto de que estes processos compartilham muitas moléculas reguladoras comuns, tais como o p53 e os membros da família Bcl-2 [29] – [30]. GNA causou um aumento nos níveis de proteína de Bax e caspase-3 clivada e um decréscimo nos níveis de Bcl-2 e LC3-II ao longo do tempo, o que sugere que o tratamento GNA activa da Bax. Porque Bax é um dos alvos a jusante mais proeminentes da p53, que avaliou o efeito da GNA em p53. Como mostrado na Figura 6A, a GNA causou um aumento notável no nível de p53. Porque p38 MAPK contribui para a activação de p53, também monitorizados os níveis de p38. GNA causou um aumento notável no nível de p38 fosforilada (Figura 6A). Além disso, a análise de citometria de fluxo utilizando coloração com iodeto de anexina V /propídio indicaram que o tratamento GNA aumentou claramente a fracção de células mortas e células apoptóticas tardias em comparação com NC. Assim, concluímos que a GNA pode induzir apoptose em células A549, pelo menos, parcialmente por essa via.

A, células A549 foram transfectadas com ARNsi contra beclin 1 ou um controlo negativo. As células foram, em seguida, tratada com 3 uM GNA para os períodos de tempo indicados. O nível de proteína relativa foi analisada por Western blotting. proteína GAPDH foi usada como controlo de carregamento. O gráfico de barras mostra as intensidades das bandas de proteína indicado em relação aos de GAPDH. Média ± SEM, n = 3, * significa p 0,05, ** p 0,01, ANOVA de uma via. B, células A549 foram transfectadas com ARNsi contra beclin 1 ou um controlo negativo. As células foram, em seguida, tratada com 3 uM GNA para os períodos de tempo indicados, e as células foram coradas com iodeto de anexina V /propídio e submetido a análise de citometria de fluxo. A percentagem no quadrante superior esquerdo indica a proporção de células marcadas com iodeto de propídio (células mortas), enquanto que a percentagem no quadrante superior direito indica a população de células marcadas por ambas anexina V e iodeto de propídio (células final apoptóticas e mortos).

7. GNA inibe a autofagia in vivo

GNA mostrou eficácia em tumores de crescimento em ratinhos nus. O nosso laboratório já anteriormente demonstrado que os volumes relativos dos tumores (RTV) em ratinhos tratados com 16 e 32 mg /kg GNA foram 12,16 ± 7,39 e 7,65 ± 2,84, respectivamente, enquanto o RTV em controlos negativos tratados com veículo foi de 26,36 ± 14,10; as proporções de crescimento relativo do tumor (T /C,%) foram de 46,1% e 29,0%. Para determinar o mecanismo pelo qual GNA prejudica o crescimento do tumor

in vivo

, foi estabelecido um modelo de tumor de pulmão de rato xenotransplante. Como mostrado na Figura 7, a GNA induzido a acumulação de vesículas autofágicos (Figura 7A), aumentou os níveis de LC3-II (Figura 7B) e bloqueou a degradação de p62 (Figura 7B) em tumores. Estes resultados sugerem fortemente que o mecanismo pelo qual GNA atua

in vivo

é também autofagia-relacionados.

As células A549 foram injectadas s.c. (2 × 10

6 /ratinho) em ratinhos nus machos BALB /CA 30-40 dias de idade. Depois de estabelecidos os tumores tinham formado (~ 50 mm

3), os ratinhos foram i.v. injectados com ou sem 16 mg /kg duas vezes por GNA semana durante três semanas.