Sumário
Pennogenyl saponinas são os compostos activos do grande número de espécies de plantas e, consequentemente, muitas formulações fitoterápico. Por isso, um grande interesse tem sido mostrado na sua caracterização e na análise das suas propriedades farmacológicas e biológicas, especialmente anti-cancro. O presente estudo relata a avaliação dos efeitos citotóxicos e explicação dos mecanismos moleculares de ação das duas saponinas pennogenyl (PS 1 e PS 2) isoladas de
Paris quadrifolia
L. rizomas na linha de células de adenocarcinoma cervical humano HeLa . Para determinar a viabilidade das células tratadas com os compostos foram utilizados em tempo real A análise de proliferação celular e observaram que as saponinas pennogenyl PS 1 e PS 2 inibiu fortemente o crescimento de células tumorais com valores IC50 de 1,11 ± 0,04 ug /ml e 0,87 ± 0,05 ug /ml, respectivamente. A análise de citometria de fluxo indicou que os dois compostos induziu apoptose de um modo dependente da dose e diminuíram o potencial de membrana mitocondrial em células HeLa na fase inicial da apoptose. PCR quantitativa e análise de Western Blot demonstrou que as duas saponinas aumentou significativamente a expressão do ARNm de FADD e BID, bem como de caspase-8 induzida por aumento da pro-caspase-8 de transformação nas células tratadas. Os resultados deste estudo sugerem que tanto o receptor de morte extrínsecos e intrínsecos vias mitocondriais estão envolvidos na morte celular programada
Citation:. Stefanowicz-Hajduk J, Bartoszewski R, S Bartoszewska, Kochan K, Adamska A, Kosiński I, et al. (2015) Pennogenyl saponinas de
Paris quadrifolia
L. Induzir extrínseca e via intrínseca da apoptose nas células do colo do útero humano Cancer HeLa. PLoS ONE 10 (8): e0135993. doi: 10.1371 /journal.pone.0135993
editor: Boris Zhivotovsky, Karolinska Institutet, SUÉCIA
Recebido: 16 de abril de 2015; Aceito: 28 de julho de 2015; Publicação: 21 de agosto de 2015
Direitos de autor: © 2015 Stefanowicz-Hajduk et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes . estão dentro do papel
Financiamento: Esta pesquisa foi apoiada pelo Ministério da Ciência e do Ensino Superior polaco, sob concessão Nr N N405 669.140 (a JR Ochocka) e da qualidade – bonificação de promoção sob o Centro Nacional de investigação Liderando programa (Saber) para os anos de 2012-2017. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decicion de publicar ou preparação do manuscrito
Competir interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução saponinas
esteróides são o grupo de metabolitos secundários que são encontradas em grande número de plantas monocotiledóneas. Consequentemente, eles são componentes de muitos medicamentos de plantas e medicamentos populares, especialmente de origem Orient [1], onde fontes comuns de saponinas são as espécies do
Liliaceae
família. Um dos importantes género saponina-bearing desta família é
Paris
, que inclui mais de vinte espécies de plantas. Estas espécies contêm principalmente pennogenyl e diosgenyl glicosídeos [2], que são fisiologicamente compostos activos [3, 4] e desempenham um papel importante no tratamento de neoplasias, distúrbios hemostáticos, inflamação e infecção fúngica [5-7]. Na medicina popular, eles são benéficos no tratamento de lesões traumáticas, picada de cobra, abcesso, parotidite e mastite.
É dada muita atenção à atividade citotóxica de pennogenin saponinas isoladas de
Paris polyphylla
[8-10]. Estes componentes mostram atividades antiproliferativos significativos no fígado, mama e próstata células cancerosas [11, 12]. Dados recentes indicam que os glicosídeos pennogenyl possuem um efeito anti-metastáticos em células de melanoma [13] e
In vivo
actividade anti-cancerígena em direcção carcinoma hepatocelular [14]. A força destes efeitos sobre as células tumorais é muito variada e está estritamente ligada à estrutura química dos compostos de saponina que é mais bem conhecido [10, 15-17].
Apesar dos numerosos estudos fitoquímicos, há muito poucas pesquisas que tentam explorar os mecanismos de ação saponinas pennogenyl sobre células tumorais, principalmente devido aos seus baixos teores nas plantas [9, 13, 14].
o presente estudo investiga o mecanismo de efeitos citotóxicos das duas saponinas pennogenyl (PS) isolado a partir de
Paris quadrifolia
L. em células de adenocarcinoma cervical humano (HeLa). As saponinas foram obtidos a partir da
Paris
rizomas e quimicamente identificados em nosso estudo anterior [18]. A estrutura do composto PS 1 foi determinada como pennogenin 3-
O
-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucopyranoside
and PS composto 2 como pennogenin 3-
O
-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucopyranoside. Estes compostos têm fortes propriedades anti-tumor nas células testadas. No entanto, os mecanismos da sua acção citotóxica, de acordo com o nosso conhecimento, permanecem parcialmente elucidada [19]. Um dos possíveis mecanismos que desempenha um papel na inibição da proliferação de células HeLa é a indução de apoptose através da activação de caspases relacionados com a via de sinalização intrínseca [19]. Em nosso estudo, postulamos que ambas as saponinas pennogenyl induzir a apoptose também através da activação da via mediada pelo receptor de morte.
Materiais e Métodos
Materiais
Dulbecco Modified Eagle de Médium (DMEM), penicilina, estreptomicina, L-glutamina, DMSO, PBS, 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) corante foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA).
o isolamento e características químicas dos dois examinou saponinas pennogenyl de
P
.
quadrifolia
rizomas foram realizados e descrito anteriormente [18]. Os compostos liofilizados foram dissolvidos em DMSO a uma concentração de 1 mg /ml.
A linha celular de cultura
A linha de células de adenocarcinoma cervical humano (HeLa S3) e queratinócitos humanos (HaCaT) foram obtidos a partir de a American Type Culture Collection (ATCC, EUA). As linhas celulares foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% (v /v) de FBS, 100 unidades /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, e foram mantidos a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO
2 incubadora.
ensaio MTT
a viabilidade das células foi determinada utilizando o ensaio de MTT. As células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 2×10
3 células /cavidade e tratadas durante 24 h com o compostos PS 1 e PS 2 no intervalo de concentração de 0,1-10,0 ug /ml. DMSO foi adicionado às células de controlo, a uma concentração final de 1,0% (v /v), que foi relacionada com a concentração máxima dos compostos de solventes utilizados na experiência. Após o tratamento, o MTT (0,5 mg /ml) foi adicionado ao meio e as células foram incubadas durante 3 h a 37 ° C. A absorvância da solução de formazano foi medida a 570 nm com um leitor de placas (Epoch, BioTek Instruments, USA). Os resultados são expressos como valores médios de CI50 (± SD, desvio padrão) de pelo menos duas experiências independentes.
xCELLigence ensaio de proliferação de células
Para a monitorização em tempo real da viabilidade celular, utilizou-se o xCELLigence sistema (ACEA Biosciences, EUA). As células foram semeadas a uma densidade de 2×10
4 /poço em placa de E-16 (ACEA Biosciences, EUA) contendo 100 ul de meio por poço. Quando as células entraram na fase logarítmica, os compostos PS 1 e PS 2 foram adicionadas em concentrações finais de 0,1-10,0 ug /ml. A concentração final de DMSO nos poços não excedeu 1,0% (v /v). As células foram incubadas com os compostos e monitorizados durante 24 h a 37 ° C em 5% de CO
2 atmosfera. O software RTCA v. 1.2.1 foi usado para calcular os valores de semi máximas concentração inibitória (IC50). Todas as experiências foram realizadas em duplicado, em três repetições independentes.
azul de Tripano ensaio
As células (1×10
5 células /poço) foram incubadas com os compostos testados a uma concentração de 1,0 -5,0 g /ml. Após 24 h, a viabilidade celular foi determinada utilizando 0,2% (v /v) de solução de azul de tripano (concentração final) e contador de células (contador celular automatizado condessa, Life Technologies, EUA). As experiências foram repetidas pelo menos duas vezes.
coloração Hoechst para análise apoptose
O efeito apoptótica dos compostos foi analisada utilizando o azul fluorescente Hoechst 33342 dye (Life Technologies). As células HeLa foram semeadas em placas de 6 poços a uma densidade de 5×10
5 /poço. As células foram tratadas com os compostos PS 1 e PS 2 dissolvidos em DMSO a uma concentração final de 1 ug /ml. concentração de DMSO não excedeu 0,1% (v /v). Após 24 horas, as células foram coradas com uma concentração final de 0,5 ug /ml de corante em PBS durante 25 minutos a uma
2 incubadora de CO e, em seguida, observado sob um microscópio de fluorescência (Leica, Suíça).
extracção de ADN e o ensaio de fragmentação
células HeLa foram semeadas a uma densidade de 5×10
6 células em placas de cultura de 100 mm e tratadas com os compostos a uma concentração final de 1,0 ug /ml. Após 48 h as células foram colhidas e lisadas em tampão de lise (1% de NP-40 em 20 mM de EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5). Após a lise celular, o sobrenadante foi recolhido e tratado com 1% de SDS e RNase A (Sigma-Aldrich) a uma concentração final de 50 ug /ml. As células foram incubadas durante 2 h a 56 ° C. Em seguida, de proteinase K (2,5 ug /ml) foi adicionada ao sobrenadante e as amostras foram incubadas durante 2 h a 37 ° C. O DNA foi precipitado com acetato de amónio 3 M e etanol gelado a uma concentração final de 70% (v /v). O sedimento de DNA obtido foi dissolvido em tampão TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) e sujeito a electroforese em gel de agarose a 1,5% com brometo de etídio.
Ensaio de Apoptose
Indução de apoptose foi avaliada pela ligação de anexina V-ficoeritrina /7-amino-actinomicina (PE /7-AAD) de fosfatidilserina celular. As células (1×10
5) foram tratados com os dois compostos a uma concentração de 0,5-5,0 ug /ml durante 24 h. Estes valores de concentração das saponinas foram escolhidos para mostrar alterações significativas no número de células apoptóticas. A concentração de DMSO como uma amostra de controlo não excedeu 0,5% (v /v). As células foram colhidas e coradas utilizando Musa Anexina V e inoperante celular Assay Kit (Millipore Merck, Alemanha), seguindo o protocolo fornecido pelo fabricante. As células apoptóticas foram então analisadas por Musa celular Analyzer (Merck Millipore). As experiências foram repetidas pelo menos duas vezes.
Avaliação do potencial de membrana mitocondrial
células
Hela foram semeadas a uma densidade de 1×10
5 células /cavidade e tratados com os dois compostos a uma concentração de 1,0-10,0 ug /ml. Estes valores de concentrações foram escolhidas para a indicação da disfunção mitocondrial na fase inicial do tratamento de células. A concentração de DMSO como uma amostra de controlo não superior a 1% (v /v). Após 3 h de exposição, as células foram colhidas e preparado usando Musa MitoPotential Kit (Merck Millipore) de acordo com o protocolo do fabricante. A percentagem de células despolarizadas /ao vivo foi determinada por Muse celular Analyzer. Todas as experiências foram repetidas pelo menos duas vezes.
-PCR em tempo real
A síntese de ADNc e as reacções de PCR em tempo real foram realizados como descrito anteriormente [20]. Resumidamente, o ARN total foi isolado utilizando o RNeasy Mini Kit (Qiagen, The Netherlands) seguindo as instruções do fabricante. A concentração de ARN foi medida e a síntese de cDNA foi realizada usando Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante.
em tempo real de expressão de genes por PCR matrizes.
cDNA obtido a partir das células tratadas com os compostos, bem como a partir das células tratadas com veículo de controlo, foram aplicados sobre a TaqMan da Applied Biosystems matriz apoptose humano as placas de 96 poços (Life Technologies 4414072). Cada placa contém 88 ensaios para genes de apoptose associada e 4 ensaios para genes de controle endógenos candidato. As reacções de PCR foram definidas de acordo com as instruções do fabricante e realizada no sistema ABI7500 PCR em Tempo Real. Os dados resultantes foram analisados com o software ABI 2,05 com base no método de transformada discreta de cosseno comparativa [21]. Para validar matrizes resultados, foram analisados de forma independente (com RT-PCR) transcrições todos significativamente alterados, bem como genes com níveis inalterados.
Medição de expressão usando quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR).
Para confirmar ainda mais a expressão de genes específicos, utilizamos sondas TaqMan específicas (BAX id ensaio Hs00180269_m1; ensaio BCL2 id Hs00608023_m1; GAPDH ensaio id Hs02758991_g1; 18S rRNA ensaio id Hs99999901_s1; FADD ensaio id Hs04187499_m1; BID ensaio id Hs00609632_m1; TNFSF10 ensaio ID Hs00921974_m1; ensaio DEDD2 ID Hs00370206_m1; BAD ensaio ID Hs00188930_m1) e TaqMan One-Step RT-PCR mestre MixReagents (Life Technologies) tal como descrito anteriormente [22]. Os dados obtidos foram analisados com ABI 2,05 software baseado no método comparativo padrão relativo curva [23].
Análise Western Blot
As células HeLa foram tratadas com os dois compostos PS 1 e PS 2. após o tratamento, as células foram colhidas e lisadas em tampão de RIPA (NaCl 150 mM, 1% de NP-40, 0,5% de desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS, Tris-HCl a 50, pH 8,0). A concentração total de proteínas foi determinada pela Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, USA). As amostras foram separadas por electroforese usando prestained géis de SDS-PAGE (Bio-Rad Laboratories) e transferido para um fluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas. As membranas foram mantidas a 4 ° C durante a noite em 3% de BCA (Sigma-Aldrich) em PBS /Tween-20 e, em seguida, incubadas com os anticorpos primários em um dos seguintes: p-actina (ab 1801, Abcam, Reino Unido), Bid (AB 32060, Abcam), Bcl-2 (AB 59348, Abcam), caspase-8 (SC-81661, Santa Cruz Biotechnology, EUA). Após lavagem com PBS /Tween-20, as membranas foram incubadas com IgG de cabra anti-coelho ou com anticorpos de cabra anti-IgG de ratinho conjugado com HRP secundário (Bio-Rad Laboratories). A imunodetecção foi realizada com um kit de detecção de quimioluminescência aumentada (ECL) (Bio-Rad Laboratories). As marcas de proteína foram analisados usando o sistema ChemiDoc equipado com software Image Lab v. 4.1 (Bio-Rad Laboratories).
A análise estatística
Todos os dados são expressos como valores médios ± desvio padrão (SD) . As comparações estatísticas dos resultados foram avaliados através do teste t de Student.
Resultados
A saponina compostos PS 1 e PS 2 diminuiu HeLa e HaCaT viabilidade das células
O efeito da
P
.
quadrifolia
pennogenyl saponinas sobre a viabilidade de células foi examinada por o sistema xCELLigence que se baseia na medição de impedância electrónica dos eléctrodos do sensor em poços de placas de E-e permite a monitorização contínua, quantitativa de células [24]. Alterações na viabilidade das células, o número, a morfologia e o grau de adesão afecta a impedância de eléctrodo que é descrita por um parâmetro chamado Índice celular (CI) [25, 26]. O IC é usado para calcular o valor de IC50 em cada ponto de medição do experimento.
células HeLa foram tratadas com os compostos PS 1 e PS 2 (0,1-10,0 ug /ml) durante 24 h. O sistema foi deixado para avaliar os valores de IC50 para cada um dos compostos. A exposição de células HeLa para as saponinas resultou num decréscimo significativo na viabilidade das células. Após o tratamento com o composto PS 1 e PS 2, os valores de IC50 obtidos foram de 1,11 ± 0,04 ug /ml e 0,87 ± 0,05 ng /ml, respectivamente (Tabela 1).
Os valores de IC50 a partir da sistema xCELLigence foram obtidos com base na fórmula de dose-resposta sigmoidal e calcularam a partir de experiências repetidas (n = 3). Para confirmar os resultados do sistema de xCELLigence, foi realizado um ensaio MTT, utilizando o mesmo intervalo de concentração das duas saponinas (0,1-10,0 ug /ml) para células HeLa e HaCaT. As células foram tratadas durante 24 h e os valores de IC50 para os compostos registados foram obtidos a partir de três experiências independentes (Tabela 1).
A amostra de controlo com DMSO utilizado não teve qualquer efeito de inibição sobre as células. Os nossos resultados mostram que as duas saponinas pennogenyl tinha uma actividade dependente da dose e dependente do tempo (Fig 1 e Fig 2). A viabilidade das células HeLa diminuiu durante a incubação das células com os compostos. Altera significativamente na adesão de células foram observadas após 5 h de tratamento das células com as saponinas. A viabilidade celular também reduziu em conjunto com as concentrações mais elevadas de PS 1 e PS 2.
As células foram incubadas com as saponinas pennogenyl PS 1 (A) e PS 2 (B) a diferentes concentrações durante 24 h. As etiquetas numéricas nas curvas representam os valores de concentração crescente dos compostos (0,1, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 10,0 ug /ml, respectivamente).
Os valores de IC50 das saponinas foram calculados com base nas curvas de dose-resposta do índice de células pelo sistema xCELLigence. As barras de erro representam os desvios padrão.
As mesmas experiências foram realizadas na linha de queratinócitos humanos de células de controlo não-tumorais. Os valores de IC50 foram de 1,01 ± 0,01 ug /ml para o composto do PS 1 e 0,94 ± 0,04 ug /ml para PS 2 (Tabela 1).
em tempo real e análise celular ensaio MTT indicaram forte efeito citotóxico do saponina PS 2 nas células estudadas. Além disso, este efeito foi confirmado por ensaio de exclusão de azul de tripano.
Efeito da apoptose celular induzida
-saponinas
Para confirmar o efeito apoptótico dos dois compostos pennogenyl, células HeLa (depois de serem tratados para 24 h) foram coradas com anexina V-PE /7-AAD e analisados pelo analisador de musa. A percentagem de células apoptóticas aumentou de uma forma dependente da dose. As taxas totais apoptóticas (a percentagem total de células apoptóticas precoces e tardios) para o composto 1 PS foram 10,71%, 41,35% e 62,48% para concentrações de 0,5, 3,0 e 5,0 ug /ml, respectivamente. As taxas de apoptose para o composto PS 2 foram 13,80%, 57,37%, 76,12% para concentrações de 0,5, 3,0 e 5,0 ug /ml, respectivamente (Figura 3).
As células foram analisadas por citometria de fluxo utilizando anexina V -PE /7-AAD método de coloração. A distribuição das células apoptóticas foi determinado na amostra de células não tratadas (A) e após incubação das células com 0,5% de DMSO (B), o composto PS 1 (CE) e PS 2 (FH) a uma concentração de 0,5, 3,0 e 5,0 ug /ml, respectivamente. As células foram tratadas durante 24 h e a extensão total de apoptose (taxa de apoptose) foi determinada em comparação com o controlo de DMSO (I). Cada amostra foi executado em triplicado. As barras de erro representam os desvios padrão. diferenças significativas em relação ao controlo estão marcados com um “*” (p 0,05).
Para estimar as alterações na distribuição da cromatina dentro das células tratadas com os dois compostos, fizemos a visualização do núcleos celulares com corante Hoechst 33342. Após a coloração, a condensação de cromatina e fragmentação nuclear em células HeLa foram observadas em comparação com as células de controlo incubadas com DMSO (Figura 4). A experiência confirmou a indução da apoptose em células tratadas com as saponinas.
estado da cromatina nuclear foi avaliada com a Hoechst as células a 1 ug /ml do composto PS 1 (A) e PS 2 33342 coloração após a exposição ( B) durante 24 h (o valor da concentração em relação aos valores de IC50 das saponinas). As células tratadas com as saponinas mostram cromatina condensada em relação às células de controlo incubadas com DMSO a 0,1% (C). As setas representam células em apoptose.
Além disso, os resultados presentes na figura 5 mostram o DNA danificado nas células de controle enquanto os compostos células tratadas exibiram DNA fragmentação característico para núcleos apoptóticos.
Lanes 1 e 1 representam um ADN de células não tratadas; pistas 2, 2a – células tratadas com 0,1% de DMSO (ctrl); pista 3 – células tratadas com o composto PS 1; pista 4-células tratadas com o composto PS 2. As células foram incubadas com os compostos a uma concentração de 1 ug /ml durante 48 h (o valor da concentração em relação aos valores de IC50 dos compostos). escada de ADN-M (Thermo Scientific).
O pennogenyl compostos PS 1 e PS 2 modulada potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) de células HeLa
A perda do potencial de membrana mitocondrial interna é um indicador fiável da disfunção mitocondrial e saúde celular. Este efeito é muitas vezes observado para ser associada com as fases iniciais de apoptose. Após o tratamento das células HeLa com os compostos estudados, o estado de membranas mitocondriais das células foi estimada pelo sistema de Musa. As células de controlo apresentaram elevada fluorescência devido à acumulação do corante fluorescente no interior de membrana interna de mitocôndrias intactas. As células incubadas com concentrações crescentes de as saponinas demonstrou um decréscimo na fluorescência. A percentagem de células vivas /despolarizadas tratados com o composto 1 PS foi 9,20%, 14,48%, 35,52% para concentrações de 1,0, 5,0 e 10,0 ug /ml, respectivamente. Os valores para o composto PS 2 foram 8,98%, 35,82%, 47,26% para concentrações de 1,0, 5,0 e 10,0 ug /ml, respectivamente (Figura 6). Os resultados obtidos mostram que as mitocôndrias desempenham um papel na indução de apoptose em células tratadas com os dois examinados saponinas.
A distribuição das células que sofrem a perda de potencial mitocondrial foi determinada após incubação das células não tratadas (A), as células com 1,0% de DMSO (B), o composto PS 1 (CE) e PS 2 (FH) a uma concentração de 1,0, 5,0, 10,0 ug /ml, respectivamente. As células foram tratadas durante 3 h e a extensão da despolarização celular mitocondrial foi determinada em comparação com o controlo de DMSO (I). Cada amostra foi executado em triplicado. As barras de erro representam os desvios padrão. diferenças significativas em relação ao controle são marcadas com um “*” (p 0,05).
As duas saponinas pennogenyl aumento da expressão do mRNA de FADD e BID em células HeLa
Para determinar a extensão dos compostos testados em vias apoptóticas, a expressão de 88 genes relacionados foi testada com qPCR (qPCR matriz apoptose humano). Entre os ensaios examinado a partir desta matriz, para outras experiências dois grupos de genes foram escolhidos-os genes cuja expressão foi alterada de forma significativa e as com expressão comparável com o controlo. Para confirmar os resultados das matrizes de PCR, foi utilizado o PCR em tempo real quantitativa. As análises mostram mudanças de expressão de mRNA de domínio Fas-associada de morte (FADD) e BH3 interagindo agonista morte de domínio (BID) após o tratamento com as duas saponinas (Fig 7). Além disso, o nível de ARNm de BCL2 proteína X associada (BAX) aumentou significativamente em células HeLa incubadas com o composto PS 1 durante 24 h. Além disso, como se mostra na figura 7, a expressão de ARNm de domínio efector de morte contendo 2 (DEDD2), proteína do linfoma de células B 2 (BCL2), antagonista BCL2 de morte celular (BAD) e factor de necrose tumoral (ligando) super família, membro 10 (TNFSF10) era comparável com o controlo.
as células foram estimuladas com o compostos PS 1 e PS 2 a uma concentração de 1,0 e 0,5 ug /ml, respectivamente, e incubou-se durante 24 h. Os níveis de ARNm foram medidos em tempo real experiências de PCR. Cada amostra foi corrida em duplicado, e a quantidade relativa de ARNm foram normalizados para o teor de 18S rRNA e expressa como uma dobra-mudança em relação ao controlo (DMSO a 0,1%). As barras de erro representam os desvios padrão. diferenças significativas em relação ao controle são marcadas com um “*” (p 0,05).
Efeitos das saponinas sobre a expressão das proteínas Bcl-2, Bid e pro-caspase-8
Para melhor elucidar o mecanismo de apoptose em células HeLa tratadas com os compostos, examinámos a expressão de proteína Bcl-2, Bid e pro-caspase-8. As células foram incubadas com as saponinas, a uma concentração de 1 ug /ml e a amostra de controlo (0,1% DMSO) durante 5 h (ponto de tempo em que as alterações nos níveis de proteína foram significativos). A expressão de proteínas foi detectado por Western blot.
β
-actina foi utilizada como um controlo de carga interna. Os resultados obtidos mostram que o tratamento saponinas diminuiu o nível de proteína Bcl-2 (figura 8A), enquanto que a expressão Bid foi aumentada em comparação com a amostra de controlo (Figura 8B). Para confirmar o papel da via extrínseca da apoptose induzida pelos compostos, foram detectadas as alterações de pro-caspase-8 nível de expressão. Figura 8C mostra a diminuição significativa no nível da proteína em células HeLa tratadas.
células HeLa foram incubadas com o composto PS 1 e PS 2 a uma concentração de 1,0 ug /ml (a concentração valor relacionado com o IC50 valores das saponinas) durante 5 horas e a expressão de proteínas nas células tratadas foi determinado por análise de Western blot. PS 1 e PS 2 diminuiu a Bcl-2 (A) e pro-caspase-8 (55 kDa) (C) os níveis de proteína e aumento no lance de expressão (B) proteína nas células. As experiências foram repetidas três vezes, e cada nível de proteína foi relacionada com a amostra de controlo de DMSO de 0,1%. As barras de erro representam os desvios padrão. diferenças significativas em relação ao controle são marcadas com um “*” (p 0,05).
Discussão
Paris
rizomas têm sido muito utilizados por pessoas chinesas como um remédio para a hemorragia, infecções microbianas e inflamação [27, 28]. Além disso, os rizomas têm sido largamente aplicado na prevenção do cancro e terapia em medicina tradicional [29]. Os numerosos estudos demonstraram que os extratos de
Paris
espécies e seus principais componentes esteróides ativos saponinas possuem propriedades antitumorais contra diferentes linhas celulares [11, 19, 29-34]. No entanto, apenas alguns papéis, que tentam explorar os mecanismos de efeito citotóxico de saponinas pennogenyl, foram publicados até agora [11, 14, 19].
Neste estudo, nós examinamos o efeito dos dois
P
.
quadrifolia
pennogenyl saponinas na linha de células de câncer cervical humano HeLa. Os compostos testados exibiram uma actividade antiproliferativa significativa contra as células humanas. Os resultados obtidos na experiência com o sistema RTCA mostram que ambas as saponinas demonstrar um efeito inibidor dependente do tempo-dependente da dose, e sobre a proliferação de células HeLa. O composto PS 2 tem uma actividade ligeiramente mais forte do que PS 1, que pode ser provocada por diferenças nas estruturas de moléculas de saponinas (um resíduo ramnose adicional na cadeia de açúcar PS 2 A Fig. 9). As análises da relação entre a bioactividade de saponinas e estrutura química indicam que uma parte do açúcar desempenha um papel na actividade da molécula de esteróide [32, 35, 36]. Saponinas com o mesmo grupo esteróide exibem efeito anticancerígeno diferente. Os compostos com mais porções de açúcar tem uma actividade mais forte contra células [12].
As experiências levadas a cabo para determinar o tipo de morte celular que indicam as duas saponinas pennogenyl induzida apoptose. A apoptose é caracterizada por características morfológicas e bioquímicas típicas, incluindo encolhimento celular, fragmentação de ADN nuclear e de vesículas de membrana [37]. Todas estas alterações foram observadas nas células incubadas com as duas saponinas pennogenyl testados. A análise das células tratadas com os compostos e coradas com o corante fluorescente mostra fragmentação nuclear e a formação de núcleos condensados. Os dados obtidos na experiência com separação electroforética de DNA extraído a partir das células tratadas apoiar estas observações.
marca precoce da apoptose é a perda de assimetria de membrana de plasma, onde as moléculas de fosfatidilserina são translocados a partir do interior para a superfície externa da membrana celular de modo a que uma proteína de ligação ao fosfolípido dependente (anexina V) pode facilmente ligar-se-lhes [38-40]. No nosso estudo, observou-se aumento significativo no número de população de células HeLa apoptóticas incubadas com as saponinas examinados e este efeito exibiu um padrão dose-dependente.
As principais vias de induzir apoptose são a via do receptor de morte extrínseca e intrínseca mitocôndrias via [41-43]. As vias de sinalização extrínseca estão relacionados com os receptores de morte de membrana que pertencem à superfamília de factor de necrose tumoral gene do receptor (TNF) [44, 45]. Até à data, a sintetase de ácido gordo ligando /receptor (FasL /fasr) e modelos de TNF-α /TNFR1 são melhores caracterizados. A ligação do FasL ao fasr resultados na indução de apoptose em células sensíveis através do recrutamento de FADD adaptador molecular e um pro-caspase-8-FADD associado ao receptor de morte [45-49]. A morte induzir sinalização formas DISC complexas, levando à morte celular [50]. Os nossos dados mostram que os dois compostos pennogenyl aumentou significativamente a expressão do ARNm de FADD nas células tratadas. Além disso, o composto PS 1 e PS 2 induzida por caspase-8 como mostrado através do aumento da pro-caspase-8 de processamento nos compostos tratados células HeLa. A activação da caspase-8, gerado no disco é por vezes insuficiente para gerar uma cascata de sinalização da caspase forte o suficiente para a execução de morte celular. Neste caso, o sinal requer amplificação por meio das vias apoptóticas dependente de mitocôndrias [51]. A proteína que liga a cascata de sinalização caspase e as mitocôndrias é a Bcl-2 membro da família Bid. A forma ativada de Bid (tBid) transloca para as mitocôndrias onde atua com as proteínas pró-apoptóticos Bax e Bak para iniciar a liberação de fatores pró-apoptóticos da mitocôndria [52]. Em nosso estudo, observou-se aumento no nível de mRNA BID e expressão da proteína em células HeLa incubadas com os compostos testados. Curiosamente, a expressão de ARNm de BAX era muito mais elevada para as células tratadas com um PS.
A acção de proposta e Bax é contrariada pelo anti-apoptótico membro da família Bcl-2, tais como Bcl-2, que pode inibir a acontecimentos pró-apoptóticos mitocondriais [53]. A família Bcl-2 de proteínas influências sobre a permeabilidade da membrana mitocondrial [41, 45, 53] e participa na formação de poros na membrana. Transição de permeabilidade (PT) é sempre seguido pela interrupção da transmembrana interior ΔΨm potencial mitocondrial [54, 55]. A perda do potencial é frequentemente observada para ser associada com as fases iniciais de apoptose [56-58]. A análise mostra que a expressão da proteína Bcl-2 diminuiu nas células tratadas para ambos os compostos.
Além disso, as experiências mostram que as duas saponinas pennogenyl despolarizada significativamente o potencial de membrana em células HeLa de uma maneira dose-dependente . Isto confirma o envolvimento da via intrínseca mitocôndria na apoptose celular.
Neste estudo, analisou-se os mecanismos de acção anti-tumoral das duas saponinas e concluir que, tanto a via de receptor de morte e extrínseca via intrínseca desempenha um papel no efeito apoptótico dos compostos em células HeLa. As vias de sinalização específicas da morte celular requer uma investigação mais aprofundada, especialmente porque os dois componentes pennogenyl isoladas de
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rizomas poderia ser uma droga potencial para o tratamento do cancro do colo do útero humano.