Sumário

como marcador de células estaminais pentaspan CD133 mostrou ligar-se o colesterol e para localizar em protuberâncias da membrana plasmática, foi investigada uma possível função de CD133 em endocitose. Usando o CD133 siRNA estratégia knockdown e câncer de cólon humano não diferenciado Caco-2 células que constitutivamente sobre-expressa CD133, nós fornecemos para a primeira evidência direta de tempo para um papel de CD133 na acumulação intracelular de fluorescente etiquetado compostos extracelulares. Avaliadas utilizando anticorpo monoclonal AC133, CD133 knockdown foi mostrado para melhorar Alexa488-transferrina captação (TF) em células Caco-2, mas não teve impacto sobre FITC-dextrano ou FITC-cólera toxina. Ausência de efeito do knockdown CD133 na reciclagem Tf estabelecido um papel para a CD133 na inibição da endocitose Tf em vez de estimular exocitose Tf. Uso de inibidores previamente identificados de vias de endocitose conhecidos e o impacto positivo da CD133 knockdown na captação celular de nanocápsulas lipídicas sintéticas endocitado por clatrina suportada que CD133 impacto sobre endocitose foi atribuída principalmente à via clatrina. Além disso, a extracção de colesterol com metil-β-ciclodextrina-se a absorção de Tf regulamentada em maior intensidade no CD133

situação alta do que no CD133

baixo situação, sugerindo assim um papel para o colesterol no efeito inibidor de CD133 em endocitose. Curiosamente, o tratamento de células com o anticorpo AC133 regulada negativamente a absorção do TF, demonstrando assim que a ligação a CD133 extracelular direta pode afetar endocitose. Além disso, a citometria de fluxo e microscopia confocal estabelecido que a regulação por diminuição da CD133 melhorada a acessibilidade para o TfR a partir do espaço extracelular, proporcionando um mecanismo pelo qual a absorção de CD133 inibida Tf. Como Tf está envolvido no fornecimento de ferro para a célula, foram investigados os efeitos da suplementação de ferro e privação na expressão CD133 /AC133. Ambas demonstraram uma regulação para baixo dependente da dose aqui discutidos para a luz dos efeitos de transcrição e pós-transcripcional. Tomados em conjunto, estes dados ampliar nosso conhecimento da função do CD133 e sublinhar o interesse de explorar ainda mais a rede CD133-TF-ferro

Citation:. Bourseau-Guilmain E, Griveau A, Benoit JP, Garcion E ( 2011) a importância das células estaminais marcador Prominin-1 /CD133 na captação de transferrina e em Iron Metabolism no cólon humano câncer Caco-2 Cells. PLoS ONE 6 (9): e25515. doi: 10.1371 /journal.pone.0025515

editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 22 Março, 2011; Aceito: 07 de setembro de 2011; Publicação: 26 de setembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Bourseau-Guilmain et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo “Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale”, o “machado Cellules Souches et Cancer” no “Cancéropôle Grand-Ouest” e por “La Ligue Contre Cancer le” através de uma “Equipe Labellisée 2007” concessão . Erika Bourseau foi inicialmente uma bolsa de doutoramento com o “Conseil Général de Maine-et-Loire” e, em seguida, uma bolsa de doutoramento com o “Comité Départemental de Maine-et-Loire de La Ligue Contre Cancer le”. Audrey Griveau era uma bolsa de doutoramento com o “Conseil Général de Maine-et-Loire”. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Seguindo o uso de novos anticorpos monoclonais criados contra neuroepitelial e células estaminais hematopoiéticas, CD133, também conhecido em humanos e roedores como Prominin-1, foi primeiro isolado e clonado em 1997 [1], [2], [ ,,,0],3]. CD133 é uma proteína transmembranar de cinco de domínio, compostas por uma cauda extracelular N-terminal, dois pequenos laços citoplasmáticos, duas voltas extracelulares grandes contendo sete potenciais locais de glicosilação e uma curta cauda intracelular C-terminal que pode ser alternativamente emendados [4] ou fosforilada [5].

Apesar dos esforços de investigação constantes, a função biológica do CD133 permanece em grande parte desconhecido. Entre fenótipos notório, foi demonstrado que um CD133 truncado, que não é transportado para a membrana celular, conduz à degeneração da retina humana [6]. Sublinhando esta importante observação, análise de uma geração de ratos CD133 deficiente revelou que, embora expressa muito cedo durante o desenvolvimento da retina, CD133 agiu como um regulador chave da morfogênese disco e que a perda de CD133 causado degeneração de fotorreceptores e cegueira [7]. Além disso, AC133, um epitopo glicosilada da proteína CD133 inicialmente associado a células estaminais embrionárias [8] e uma variedade de células estaminais somáticas, foi extensivamente descrita como um marcador putativo de células estaminais do cancro no sangue, cérebro, cólon, próstata, pulmão, mama , cancros do fígado, da pele e [9], [10]. Outras investigações revelaram que a CD133 está ligada ao metabolismo celular como um gene responsivo de glucose em miotubos [11], bem como fornecendo evidências para o stress bioenergética [12] e de não exposição à alta tensão de oxigénio em gliomas (Bourseau-Guilmain et ai. , submetido).

ao nível subcelular, CD133 é preferencialmente localizadas na saliências membrana plasmática e microvilosidades [13]. A partir daí, CD133 pode ligar-se o colesterol [14] e interagir com gangliósidos [15]. Como saliências de membrana e microvilosidades permitir a extensão da superfície da membrana, a fim de aumentar a exposição de células para o espaço extracelular, estas observações fornecem indicações importantes para identificar o papel molecular de CD133, nomeadamente, considerando trocas celulares com o microambiente. Na verdade, CD133 foi encontrado em vesículas de membrana distintas de exossomos que foram lançados a partir de células epiteliais durante a diferenciação [16].

Em paralelo a estes sinais de fora para dentro, colesterol e esfingolípidos segregar em microdomínios de membrana jangada lipídica implicados em interior sinalização out e endocitose [17], [18]. Considerando a relação estreita entre CD133 e colesterol, além de sua possível ligação com esfingolipídeos e exposição ao espaço extracelular, a hipótese de que CD133 está envolvido na endocitose: um processo fundamental pelo qual os compostos extracelulares são internalizados e distribuídos aos compartimentos intracelulares

no presente estudo, usando a estratégia de RNA-interferência e câncer de cólon humano indiferenciado Caco-2 células que constitutivamente sobre-expressos CD133 /AC133, nós fornecemos para a primeira evidência de tempo para um papel de CD133 na acumulação intracelular de compostos extracelulares , nomeadamente exemplificado por transferrina (Tf). Para além dos dados que estabelecem um papel para CD133 na endocitose, que também demonstram que se CD133 é regulada por ferro, suportando, assim, a existência de uma rede de Tf-CD133-ferro. Estas novas observações são discutidas à luz do padrão de CD133 de expressão e conhecimento atual no campo.

Materiais e Métodos

cultura celular

carcinoma do cólon humano indiferenciado Caco- 2 células (American Type Culture Collection: HTB-37 ™) foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO

2 em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM; Lonza, Levallois-Perret, França) contendo 4,5 g /L de glucose e de L-glutamina. O meio foi adicionado com 10% de soro fetal bovino (FBS; Lonza, Verviers, Bélgica), 1% de antibióticos (10 unidades /mL de penicilina, 10 mg /ml de estreptomicina, 25 ng /mL de anfotericina B; Sigma-Aldrich, Saint Louis, EUA, MO) e 1% de aminoácidos não essenciais (NEAA; Lonza, Verviers, Bélgica). Quando as células atingiram 80% de confluência, foram dissociados em 0,5% de tripsina porcina e 0,2 g /mL EDTA (Lonza, Verviers, Bélgica) antes de re-plaqueamento em frascos de plástico não revestidas em 15 × 10

3 células /cm

2. Metade do meio foi substituído por meio fresco a cada dois dias.

siRNA knockdown de CD133

células Caco-2 foram semeadas em placas de seis poços com 2,3 × 10

5 células por poço em 2 ml do meio acima mencionado, durante 24 h. O meio foi removido e as células foram transfectadas com 30 nM de duplexes de RNA de oligonucleotídeos (Sigma-Aldrich), utilizando o reagente N-TER acordo com as instruções do fabricante (Sigma-Aldrich). N-TER /complexos de siRNA foram em seguida incubadas em meio de células Caco-2 durante 48 h a 37 ° C numa atmosfera contendo 5% de CO

2. siRNA foram, em seguida, removido e substituído por meio fresco durante 24 h. A disputa sequência foi utilizada como controle negativo: 5′-GUCCGGAAUUACCAUGAGUdTdT-3 ‘. A sequência utilizada para realizar a inibição interferência de ARN segmentado de CD133 foi 5’-CCCUUAAUGAUAUACCUGAdTdT-3 ‘.

AC133 imunomarcação

células Caco-2 expostas a siRNA foram recolhidas e dissociadas utilizando Versene (Lonza) . As células foram incubadas com 5 ug /mL AC133 anticorpo (Miltenyi Biotech, Paris, França) ou controlo de isotipo IgG1K (BD-Biosciences, Le Pont-de-Claix, França) durante 1 h a 4 ° C em PBS contendo 5% de FBS e 0,02% de azida de sódio. As células foram então lavadas três vezes em PBS contendo 5% de FBS e 0,02% de azida de sódio e incubada durante 30 minutos a 4 ° C com cabra conjugado com FITC anti-rato-IgG F (ab ‘) do anticorpo policlonal 2 fragmento (DakoCytomation, Trappes, França) a 20 ug /ml em PBS contendo 5% de FBS e 0,02% de azida de sódio. Após mais três lavagens em PBS contendo 5% de FBS e 0,02% de azida de sódio, as células foram re-suspensas em PBS contendo 2% de formaldeído e 0,02% de azida de sódio.

A citometria de fluxo

BD FACSCalibur ™ fluxo fluorescente citómetro activado e o software CellQuest ™ BD (BD-Biosciences) foram utilizados para a aquisição de citometria de fluxo. A análise foi realizada usando software de WinMDI 2,9 (Scripps Institute, La Jolla, CA, EUA).

Síntese de nanocápsulas Vermelho do Nilo marcado com lípidos (NR-LNC)

50 nm Vermelho do Nilo ( NR) marcado com nanocápsulas lipídicas (LNC) (NR-LNC), que incorporou o composto fluorescente NR foram preparados como anteriormente descrito [19], utilizando um processo de inversão de fase que se segue a formação de uma micro-emulsão de óleo /água contendo triglicéridos (Labrafac® WL 1349, Gattefossé, Saint-Priest, França), um agente tensioactivo hidrofílico não iónico (Solutol® HS 15, GmbH, Ludwigshafen, Alemanha) e lecitinas (Lipoïd® S75-3, GmbH). NR foi dissolvido em acetona a 1% (w /w), e a solução resultante foi NR incorporados em Labrafac® a 1:10 (w /w). Deste modo, 846 mg de Solutol®, 75 mg Lipoïd®, 1,029 mg de Labrafac® contendo NR, 89 mg de NaCl e 2,975 mg água foram misturados e aquecidos sob agitação magnética até 85 ° C. Três ciclos de aquecimento e arrefecimento em progressiva entre 85 ° C e 60 ° C foram então realizados. Eles foram finalmente seguido por um choque irreversível induzida por diluição com 12,5 mL de 0 ° C adicionou água desionizada para a zona de inversão de fase. De exclusão de tamanho e cromatografia líquida de alta pressão (HPLC), ensaios demonstraram um encapsulamento completo e retenção da NR como observado anteriormente [19]. LNC foram analisados ​​quanto à sua distribuição de tamanho utilizando um Malvern Zetasizer® Nano DTS Série 1060 (Malvern Instruments SA, Worcestershire, RU).

Internalização de transferrina (TF), o dextrano (Dx), subunidade B da toxina da cólera (CTB ) e nanocápsulas lipídicas (LNC)

O meio de células transfectadas foi removido e substituído por DMEM suplementado com 1% de meio de N1 isento de soro (Sigma Aldrich) durante 1 h. Os três compostos que se seguem, TF-Alexa 488 a 0,5 e 5 ug /mL (Invitrogen, Cergy Pontoise, França), DX-FITC a 0,5 e 5 mg /ml (Sigma Aldrich) e de CTB-FITC a 1 e 10 ug /mL (Invitrogen), ou em vez disso, a NR-LNC a 1/1000 de diluição da suspensão inicial, o que corresponde a uma concentração de 100 ug /ml, foram então adicionados ao meio durante 1 h. As células foram então dissociados utilizando Versene (Lonza). Para permitir a determinação da fracção de moléculas marcadas ou partículas que foi internalizado eficazmente dentro das células, a fluorescência extracelular foi extinta utilizando 0,4% de azul de tripano (Sigma Aldrich). As células foram então lavadas em PBS e re-suspensas em PBS contendo 2% de formaldeído e 0,02% de azida de sódio. Internalização de fluorescente etiquetado Tf, Dx, CTB e LNC foi monitorizada por citometria de fluxo.

Análise da libertação de Tf a partir de células Caco-2 após a internalização

siRNA

Controle e específicos-CD133 foram utilizados para gerar CD133

células de alta e CD133

baixos transfectadas Caco-2, respectivamente. As células foram então incubadas com Tf-Alexa 488 durante 2 h a 37 ° C /5% de CO

2 antes do meio extracelular foi removida, lavada e substituída por meio fresco isento de Tf-Alexa 488. Depois de uma incubação adicional a 37 ° C /5% de CO

2 durante 1 h, 2 h e 3 h, o restante intracelular Tf-Alexa 488 de fluorescência, que representa a quantidade de Tf-Alexa 488, que não foi reciclada para o compartimento extracelular, foi medida por semi- fluxo quantitativa de citometria tal como descrito acima.

tratamento celular com inibidores químicos de endocitose e a absorção celular de Tf

foram usadas inibidores químicos previamente identificados de vias de endocitose conhecidos como descrito anteriormente [19], [20 ], [21]. Resumidamente, transfectadas células Caco-2 foram pré-tratados com inibidores durante 1 h a 37 ° C em meio N1. A clorpromazina (10 ug /mL; Sigma-Aldrich) foi usado para inibir o transporte mediado por clatrina [22], enquanto Filipin (1 ug /L, Sigma-Aldrich) e dimethylamiloride (DMA, 10 uM; Sigma-Aldrich) foram usadas para inibem a endocitose dependente de caveolae [23] e macropinocitose [24], respectivamente. depleção de colesterol foi obtida através de um pré-tratamento de 2 h com metil-β-ciclodextrina (MβCD, 10 mM, Sigma-Aldrich), na presença de lovastatina (1 ug /mL; Sigma-Aldrich) [25], [26]. Subsequentemente, a absorção celular de 5 ug /mL Tf-Alexa 488 foi monitorada por análise de citometria de fluxo como descrito acima. Para a inibição do colesterol, de 1 ug /mL de lovastatina foi também mantidas no meio durante o tratamento com Tf-Alexa 488.

Análise de captação de Tf por células Caco-2, após o tratamento com o anticorpo AC133

células Caco-2 foram plaqueadas a 2,3 x 10

5 em placas de 24 poços em 400 ul de meio contendo soro. Depois de 24 h de incubação inicial a 37 ° C /5% de CO

2 a forma inicial foi substituído por meio isento de soro N1 antes da incubação com quer 0, 5, ou 10 ug /ml do anticorpo AC133 ou de controlo de isotipo IgG1K . Tf-Alexa 488 foi então adicionada a 5 ug /mL e incubou-se a 37 ° C /5% de CO

2 durante 1 h para estudar o impacto do tratamento com imunoglobulina em TF-Alexa 488 captação. Tf-Alexa 488 captação foi quantificada por citometria de fluxo como descrito acima.

reconhecimento pelo anticorpo do receptor de TF na superfície celular Caco-2, dependendo do nível de expressão de CD133

Caco-2 células exposto a CD133 ou ARNsi de controlo foram recolhidas e dissociadas utilizando Versene (Lonza). As células foram incubadas com /mL CD71 anticorpo 5 ug monoclonal de ratinho que reconhece o receptor de Tf (TfR ou antigénio CD71) (clone M-A712, BD-Biosciences) ou com 5 ng /mL de IgG2a, de controlo de isotipo κ (BD-Biosciences) para prosseguir durante imunomarcação e citometria de fluxo como descrito acima para o reconhecimento da superfície celular AC133.

Immunocytochemisty combinado com microscopia confocal de varrimento laser para a identificação de AC133, CD71 e clatrina cadeia pesada dentro de células Caco-2

células Caco-2 foram colocadas em placas a 4 x 10

3 células por poço em oito poços Lab-Tek slides Secção (Nunc, Roskilde, Dinamarca) em 300 mL de DMEM contendo 10% de FCS durante 24 h. Eles foram, em seguida, expostos a CD133 ou ARNsi de controlo, tal como descrito acima, antes de prosseguir para imunocitoquímica. As células foram então lavadas com PBS e fixadas com paraformaldeído a 4% em PBS (pH 7,4) durante 20 minutos a 4 ° C. Após lavagens em PBS, as células foram expostas durante 60 minutos à temperatura ambiente a uma solução de bloqueio de PBS contendo 4% de albumina de soro bovino (Sigma-Aldrich) e 10% de soro de cabra normal (Sigma-Aldrich). Os anticorpos monoclonais primários contra CD133 (IgG1k, Miltenyi Biotech), de TfR ou CD71 (IgG2aκ, BD-Biosciences) ou da cadeia pesada de clatrina (CHC) (IgG1, BD-Biosciences) foram incubados a 5 ug /ml em PBS /BSA a 4% durante durante a noite a 4 ° C. Note-se que para CHC imunomarcação intracelular, Triton® X-100 foi adicionado a 0,1% durante o procedimento de bloqueio para a permeação celular. Após lavagens, aplicou-se um anticorpo conjugado com biotina anti-ratinho de cavalo secundário (Vector, Burlingame, CA) a 1/100 em PBS /BSA a 4% durante 1 h à temperatura ambiente. Após lavagens adicionais, Estreptavidina Fluo Sonda Alexa 488 (Interchim, Montlucon, França), diluído 1/700, foi usado. As células foram finalmente lavadas e montadas sob lamelas em meio de montagem fluorescente (DakoCytomation). imagens de microscopia confocal foram obtidos usando um 300 confocal a laser sistema de imagens de microscopia de varredura Olympus Fluoview ™ FU (Paris, França).

tratamentos Ferro

células Caco-2 foram semeadas em seis poços placas com 2,3 × 10

5 células por poço em 2 ml durante 24 h. Antes do tratamento de ferro começou, FBS contendo o meio foi substituído por meio isento de soro N1 por um adicional de 24 h. As células foram então tratadas com várias concentrações (50-800 uM) de ácido nitrilotriacético férrico (Fe-NTA) durante 72 h a 37 ° C /5% de CO

2, tal como indicado. Fe-NTA (razão molar 01:04) foi preparado extemporaneamente como um estoque de 20 mM de NTA e hexa-hidrato de cloreto férrico (Sigma-Aldrich). As células foram alternativamente tratados com FeSO

4 (Sigma-Aldrich), um outro doador de ferro [27], [28], em cada 150 ou 300 ^ M durante 24 h.

Ferro privação e tratamento com hipóxia agentes miméticos

Seguindo um procedimento semelhante ao da cultura antes do tratamento com o ferro, as células foram em vez disso tratadas durante 24 h com um quelante de ferro, também conhecido como um agente de hipóxia-mimético, desferrioxamina (DFO, Sigma-Aldrich) a 100 e 150 uM [29], [30]. Alternativamente, eles foram tratados durante 24 h com um agente de hipóxia-mimético que funciona de forma independente da privação de ferro, dicloreto de cobalto (CoCl

2, Sigma-Aldrich) a 100 e 150? M [31].

Banco de Dados , bioinformática

para procurar elemento responsivo ferro putativa (IRE) sequências dentro 3 ‘e 5’ região não traduzida (UTR) do mRNA CD133 humano, as sequências utilizadas neste estudo (entre os quais

Homo sapiens

prominin uma transcrição variante 2, NM_001145847.1) foram obtidos a partir de NCBI GenBank. Todos os alinhamentos de sequências foram realizadas utilizando o programa de computador ClustalW do Bioinformatics Institute Europeia EMBL (Heidelberg, Alemanha). Os touros (procurando por IRES) servidor web (https://ccbg.imppc.org/sires/) também foi utilizado para predição de elementos responsivos de ferro no RNA [32].

A análise estatística

XLSTAT 2006 Versão 2006.3 (Addinsoft Paris, França) foi utilizado para a análise de dados. A significância estatística de cada experiência foi determinada pelo teste de Dunnett. Os testes foram considerados significativos com valores de p . 0,05

Resultados

Impacto da knockdown específica mediada por siRNA de CD133 na acumulação intracelular de Tf, Dx e CTB em Caco não diferenciada -2 células

Para determinar a influência potencial de CD133 na acumulação intracelular de compostos extracelulares, não diferenciada de carcinoma do cólon humano células Caco-2, que expressam naturalmente altos níveis de CD133, foram utilizados. Usando qualquer siRNA que não conduz a transcrição para baixo-regulação (controle de siRNA) ou siRNA que não regulam negativamente alvo mRNA CD133 e expressão da proteína (CD133 siRNA), duas situações foram analisadas: células Caco-2 expressando altos níveis de CD133, e Caco células que expressam níveis baixos -2 de CD133. A Figura 1A mostra que o tratamento de células Caco-2 com 30 nM de ARNsi CD133 eficazmente conduziu a uma redução de 52 ± 11% na expressão da proteína CD133, analisados ​​por citometria de fluxo (anticorpo AC133) imunofluorescência em comparação com o ARNsi de controlo. Para analisar Caco-2 capacidade pinocytic celular nos CD133

altos e CD133

situações de baixa, a acumulação intracelular de marcadores exógenos das vias pinocytic foi então monitorado. Embora as vias de internalização alternativas foram descritas de acordo com os tipos de células e estado de diferenciação (para revisão ver [33]), TF-Alexa 488, DX-FITC e CTB-FITC foram usados ​​como marcadores protótipo do receptor de endocitose mediada [34], em fase fluida endocitose [24], [35] e cavéolas endocitose dependente [23], [36], respectivamente. A citometria de fluxo de medição de fluorescência intracelular após 1 h de exposição de CD133

elevados Caco-2 de células de 0,5 ou 5 mg /mL DX-FITC, 1 ou 10 ug /mL de CTB-FITC e 0,5 ou 5 ^ g /mL Tf -Alexa 488 permitiu a absorção de 100% a ser medido em comparação com a intensidade de fluorescência GEOMEAN basal do veículo sozinho células tratadas representam a absorção de 0%. Embora CD133 knockdown não teve impacto sobre a acumulação intracelular de Dx-FITC (Figura 1B) ou em CTB-FITC (Figura 1C), a captação celular de Tf-Alexa 488 foi significativamente amplificado em CD133

Caco menor 2 células independentemente do concentração testada (Figura 1D). Estes dados portanto estabelecida pela primeira vez que a CD133 actuar como um modulador da acumulação intracelular de compostos exógenos.

A) Imunofluorescência associada análise de citometria de fluxo da expressão de CD133 nas células não diferenciadas Caco-2 tratadas com 30 nM de controlo ou siRNA específico-CD133. Os resultados são expressos como uma percentagem de tratamento de controlo, que representa os níveis de intensidade de fluorescência obtidos após GEOMEAN AC133 imunocoloração de células tratadas com ARNsi irrelevante (CD133

High células Caco-2); observe a regulação para baixo eficaz de CD133 quando se utilizou siRNA (CD133

células de baixa Caco-2) específicos de CD133. B-D) citometria de fluxo e captação intracelular de Dx-FITC (B), CTB-FITC (C) e Tf-Alexa 488 (D) dentro CD133

baixas Caco 2 células de alta e CD133

após 1 h de incubação a 37 ° C /5% de CO

2. Os resultados são expressos como percentagem de controlo, representando, assim, os níveis de intensidade de fluorescência GEOMEAN obtidos para as células tratadas com veículo sozinho. Dados representados ± médios �e.p.m obtido a partir de três experiências independentes. teste de Dunnett: ** p 0,01, *** p 0,001

Efeito do siRNA mediada knockdown de CD133 em Tf exocitose

Em vista do facto de que parecia ser CD133 um inibidor da absorção celular de Tf ao não ter nenhum impacto sobre Dx e CTB, nós ainda mais focado sobre a relação entre a expressão de CD133 e acumulação Tf. portanto, foi investigado o efeito potencial de siRNA knockdown mediado de CD133 em Tf-Alexa 488 exocitose. Para este efeito, CD133

alta e CD133

células de baixa não diferenciadas Caco-2 foram incubadas com Tf-Alexa 488 durante 2 h a 37 ° C /5% de CO

2 antes do meio extracelular foi removido , lavada e substituída por meio fresco isento de Tf-Alexa 488. Após outra incubação durante 1, 2 e 3 h a 37 ° C /5% de CO

2, o valor de a Tf-Alexa 488, que não foi reciclado para o extracelular compartimento foi medida por citometria de fluxo como descrito em Materiais e Métodos. Os dados apresentados na Figura 2 estabelecido que os níveis intracelulares de Tf-Alexa 488 diminuiu com o tempo de incubação. Após 1 h de incubação mais de 80% do internalizado Tf-Alexa 488 permaneceu no interior das células, tanto CD133

alta e CD133

baixo expressando células enquanto que, após 3 h de incubação, 54 ± 9% e 43 ± 4 % do internalizado Tf-Alexa 488 permaneceram dentro CD133

células que expressam elevados e CD133

baixas, respectivamente. No entanto em todos os momentos estudados, não foi observada nenhuma diferença significativa de acordo com os níveis de expressão CD133 (Figura 2). Estas observações enfatizou que, embora Tf reciclagem ocorreu em ambos CD133

alto e CD133

células de baixa não diferenciadas Caco-2, as diferenças de curto prazo na acumulação Tf intracelular são devido essencialmente ao impacto da CD133 em mecanismos de endocitose em vez de exocitose .

CD133

alta (ARNsi de controlo) e células CD133

baixo (CD133 siARN) não diferenciadas Caco-2 foram expostas a Tf-Alexa 488 durante 2 h a 37 ° C /5% CO

2 antes do meio extracelular foi removida, lavada e substituída por meio fresco isento de Tf-Alexa 488. os valores de Tf-Alexa 488 que não foram recicladas para o compartimento extracelular foram medidos por análise de citometria de fluxo, após uma incubação adicional de células em 37 ° C /5% de CO

2 durante 1 a 3 h. Os dados são expressos como uma% de Tf-Alexa 488 inicialmente internalizado. Eles representam ± médios �e.p.m obtido a partir de três experiências independentes.

Efeito de inibidores químicos de vias de endocitose conhecidos na absorção de Tf por células não diferenciadas Caco-2, dependendo do nível de expressão de CD133 sublinhou a importância da via clatrina

depois de ter estabelecido que o nível de expressão de CD133 teve um impacto sobre a absorção de Tf dentro de células não diferenciadas Caco-2, mas não modulam a reciclagem do TF, que, em seguida, dirigiu-se à questão de saber se CD133 está envolvida nas vias pinocytic específicas [ ,,,0],33]. Para este efeito, a captação de Tf-Alexa 488 dentro CD133

células de alta e CD133

baixo expressando foi monitorada após o tratamento com inibidores químicos previamente identificados de vias de endocitose conhecidos. A clorpromazina foi utilizada para inibir o transporte mediado clatrina [22], para inibir Filipin caveolae endocitose dependente [23] e DMA para inibir macropinocitose [24]. A citometria de fluxo demonstrou que o pré-tratamento de controlo CD133

High células Caco-2 com Filipin, clorpromazina e DMA antes da exposição a 5 ug /mL Tf-Alexa 488, conduziram a um 30%, 90% e redução não significativa na incorporação de Tf , respectivamente (Figura 3A). O maior impacto dos clorpromazina combinado com o efeito mais leve de Filipin enfatizado que, assim, a acumulação de Tf no interior das células não diferenciadas Caco-2 foi devido principalmente ao transporte mediado por clatrina [37]. O efeito Filipin poderia ser explicado pela endocitose facto de substratos Protopic para a endocitose mediada por receptores, tais como LDL ou Tf, que geralmente rota para o compartimento intracelular através da via clatrina, poderia alternativamente usar a via caveolae [38], [39] . Além disso, como o colesterol tem sido mostrado para ser envolvida na formação de clatrina revestido vesículas endocíticas [26], filipina, que seqüestra colesterol, também podem ter um impacto indirecto na endocitose clatrina. Interessantemente, quando se considera CD133 knockdown e CD133

células de baixa Caco-2, os dados muito semelhantes foram obtidos com Filipin, clorpromazina e DMA, que conduz a 18%, 85% e redução não significativa na incorporação de Tf, respectivamente (Figura 3A) . Assim, os efeitos quantitativos de CD133 na endocitose Tf parecem estar relacionados principalmente com a via dependente de clatrina. Surpreendentemente, a depleção de colesterol, conseguido através de MβCD combinado com lovastatina [25], [26], o que foi dito para afectar as vias independentes de clatrina e para algumas vias dependentes medida clatrina [26], [40], [41], resultou em uma grande melhoria em Tf-Alexa 488 acumulação dentro CD133

células de alta Caco-2 (+ 49%, Figura 3A). Curiosamente, o impacto da depleção de colesterol no Tf-Alexa 488 absorção dentro CD133

células de baixa Caco-2 foi menos marcado (+ 21%, Figura 3A). Estes últimos dados apoiaram a hipótese de que a interação CD133 com o colesterol intracelular também tem um impacto sobre Tf endocitose. Para corroborar ainda mais uma possível ligação entre CD133 e a via de endocitose dependente de clatrina, o impacto da CD133 knockdown na absorção de nanopartículas sintéticas (LNC) que foram descritos anteriormente para usar a via clatrina na rota para o espaço intracelular de células Caco-2 [ ,,,0],21] foi investigada. Curiosamente, como por Tf fluorescente, absorção de fluorescente etiquetado LNC (NR-LNC) foi significativamente maior no CD133

-Caco 2 células baixas (Controle siRNA) em comparação com CD133

altas células Caco-2 (CD133 siRNA) (Figura 3B).

a) Consequências da knockdown siRNA específico-CD133 para a eficácia de moduladores químicos de vias de endocitose conhecidos na modulação da captação Tf por células não diferenciadas Caco-2. Após o tratamento com veículo sozinho (controlo), filipina, clorpromazina, DMA ou MβCD adicionado com lovastatina (MβCD), CD133

elevadas (ARNsi de controlo) e CD133 células não diferenciadas Caco-2

baixo (CD133 siARN) foram expostas a 5 ^ g /mL Tf-Alexa 488. internalização celular de Tf-Alexa 488 foi, em seguida, monitorizada por citometria de fluxo. Os resultados são expressos como uma% de Tf-Alexa 488 montantes que foram internalizados no controlo tratado com veículo. Note-se a ausência de efeito da CD133-siRNA knockdown na maior inibição de Tf-absorção causada por clorpromazina. Note-se também o reduzido até efeito regulador da extração de colesterol no baixo situação CD133 (MβCD). Dados representados ± médios �e.p.m de um triplicado obtido a partir de uma experiência representativa que foi reproduzido duas vezes. As comparações com o controlo: teste de Dunnett, * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001; comparação entre o ARNsi de controlo e ARNsi CD133: teste de Dunnett: p 0,05. B) siRNA específica mediada knockdown de CD133 dentro não diferenciada células Caco-2 conduziu a um aumento na acumulação intracelular de LNC. análise de citometria de fluxo de captação intracelular de NR-LNC dentro CD133

alta (Controle siRNA) e CD133

baixa (CD133 siRNA) Caco-2 células após 1 h de incubação a 37 ° C /5% de CO

2. Os resultados são expressos como percentagem de controlo, representando, assim, os níveis de intensidade de fluorescência GEOMEAN obtidos para as células tratadas com veículo sozinho. Dados representados ± médios �e.p.m obtido a partir de três experiências independentes. teste de Dunnett:. ** p 0,01

Tratamento de não diferenciadas 2-Caco células com o anticorpo AC133 reconhecer o domínio extracelular de CD133 resultou numa redução da absorção

Tf

tendo estabelecido que a expressão CD133 afetados quantitativamente Tf endocitose, que, em seguida, considerou que uma interação direta entre a proteína CD133 ea maquinaria endocítica Tf teriam sido afetados pela ligação a CD133 ligando extracelular. Como ligando extracelular de CD133 ainda não tinham sido identificadas e uma vez que os anticorpos monoclonais foram já utilizados como activando ou como função de bloqueio de imunoglobulinas, por exemplo, em interacções entre integrinas e da matriz extracelular [42], o anticorpo AC133, que reconhece um glicosilação associada epitopo extracelular CD133 de [43], em seguida, foi testado como ligando CD133 em células vivas de Caco-2. Curiosamente, enquanto que o tratamento de células não diferenciadas Caco-2 com uma imunoglobulina de controlo de isotipo IgG1K não teve efeito sobre a acumulação intracelular de Tf-Alexa 488 avaliadas por citometria de fluxo (Figura 4A), o tratamento com o anticorpo AC133 resultou numa redução significativa da Tf absorção de 38 ± 8% e 75 ± 1% a 5 e 10 ug /mL, respectivamente (Figura 4A). Estes dados estabelecidos que AC133 pode efectivamente exercer efeitos funcionais em células vivas aqui atribuídas a uma interacção entre si e CD133 a maquinaria endocítica Tf em células não diferenciadas, células Caco-2.

Absorção Tf

tratamento de Um anticorpo AC133) inibida.