Abstract

Koelreuteria henryi

Dummer, uma planta endémica de Taiwan, tem sido usado como um medicina popular para o tratamento de hepatite, enterite, tosse, faringite, alergia, hipertensão, hiperlipidemia, e cancro. Austrobailignan-1, um derivado lignana natural isolado de

Koelreuteria henryi

Dummer, possui propriedades anti-oxidantes e anti-câncer. No entanto, os efeitos de austrobailignan-1 em células cancerosas humanas não ter sido ainda estudado. Aqui, mostramos que o crescimento celular austrobailignan-1 inibiu de A549 do cancro do pulmão de células não-pequenas humano e linhagens de células H1299 em ambos os modos da dose e dependente do tempo, o IC

50 valor (48 h) de austrobailignan-1 eram 41 e 22 nm, respectivamente. Os dados da análise de citometria de fluxo indicou que o tratamento com austrobailignan-1 durante 24 h retardou o ciclo celular na fase G2 /M. O evento molecular de prisão fase G2 mediada austrobailignan-1-/M foi associada com o aumento de p21

WAF1 /Cip1 e p27

expressão KIP1, e diminuição da expressão de Cdc25C. Além disso, o tratamento com 100 nM austrobailignan-1 durante 48 h resultou numa libertação de citocromo c pronunciada seguido pela activação da caspase-2, -3 e -9, apoptose e consequentemente induzida. Estes eventos foram acompanhados por aumento de PUMA e Bax, e a diminuição de Mcl-1 e Bcl-2. Além disso, o nosso estudo mostrou também que austrobailignan-1 era um inibidor de topoisomerase 1, como evidenciado por um ensaio de relaxamento e a indução de uma via de sinalização de resposta a danos no ADN, incluindo ATM, e Chk1, Chk2, γH2AX activação fosforilada. Em geral, os nossos resultados sugerem que austrobailignan-1 é um agente de ADN danificar novo e exibe uma topoisomerase I actividade inibidora, provoca quebras da cadeia de ADN, e consequentemente induz a resposta a danos no ADN de sinalização para o ciclo celular G2 M prisão /e apoptose de uma maneira independente de p53.

Citation: Wu CC, Huang KF, Yang TY, Li YL, Wen CL, Hsu SL, et al. (2015) A topoisomerase 1 Inhibitor Austrobailignan-1 isolada a partir de

Koelreuteria henryi

induz uma G2 /M-Phase Detenção e morte celular independente de p53 em Non-Small Cell Lung Cancer Cells. PLoS ONE 10 (7): e0132052. doi: 10.1371 /journal.pone.0132052

editor: Peiwen Fei, Universidade do Havaí Cancer Center, United States |

Recebido: 09 de janeiro de 2015; Aceito: 09 de junho de 2015; Publicação: 06 de julho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Wu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability: Dados relevantes são dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi financiado em parte por doações do Veterans general Hospital Taichung (TCVGH1033209C) para Tsung-Ying Yang, MD, PhD, bem como do Hospital Taichung Veterans general (TCVGH -1027305D) e TCVGH-1027319D o Dr. Shih-Lan Hsu

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O cancro do pulmão é a principal causa de morte para homens e mulheres em muitos países, incluindo Taiwan, que apresentaram a maior taxa de aumento na mortalidade por câncer de pulmão em uma década recente [1, 2]. A taxa de sobrevivência de cinco anos de pacientes com câncer de pulmão além do estágio II é de apenas 13-25% [3]. cancros do pulmão são histologicamente classificados em dois tipos principais: cancro de pulmão de pequenas células (CPPC) e câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC). O NSCLC, são responsáveis ​​por 85% da incidência de câncer de pulmão, e pode ser subdividida em três grupos: adenocarcinoma, o carcinoma de células escamosas e carcinoma de grandes células. estratégias clínicas para o tratamento de pacientes com câncer de pulmão incluem cirurgia, quimioterapia, radioterapia e terapia-alvo. Embora, terapia promissora surgiu para o tratamento de pacientes com câncer de pulmão na última década, uma grande parte dos pacientes permanecem sem cura [4]. Portanto, a busca de novas drogas com maior eficácia e segurança são urgentemente necessários para pacientes com câncer de pulmão.

A apoptose é um processo estritamente regulada controlada por um ou outro (receptor de morte) extrínseca e /intrínsecas (mitocondriais) caminhos ou [5 ]. As proteínas da família Bcl-2 tem um papel central no controlo da via apoptótica mitocondrial. Bcl-2 e de Mcl-1 são membros anti-apoptóticos da família Bcl-2 e a sua expressão elevada é encontrada em muitos tipos de células de tumor [6]. Bax e Bak pertencem aos membros pró-apoptóticos da família Bcl-2, a sua activação leva a oligomerização provocando a formação de poros, que por sua vez resulta em um aumento da permeabilidade da membrana mitocondrial externa e libertando citocromo C para activar cascata das caspases. Bcl-2 e de Mcl-1 podem ligar-se directamente com Bax e evitar a activação da apoptose Bax [7]. PUMA é um sensor geral de estímulos apoptóticos e um fármaco alvo promissor para a terapia do cancro [8, 9], que induz a apoptose através da activação da proteína pro-apoptótica Bax através da sua interacção com membros da família Bcl-2, anti-apoptóticos, incluindo Bcl-2 e Mcl-1. As interacções de PUMA com proteínas anti-apoptóticas causar deslocamento de Bax, resultando na activação da actividade pró-apoptótica de Bax [10]. evidências acumuladas salienta que a indução de apoptose por segmentação proteínas da família Bcl-2 é considerada uma abordagem potencialmente promissora terapêutico em cancros humanos [7].

acumular evidência indica que os medicamentos base de plantas têm propriedades anti-cancro e para mostrar a capacidade para inibir o crescimento ou induzem a apoptose de vários tipos de células tumorais. Os componentes ativos de plantas medicinais que são responsáveis ​​pelos efeitos anti-câncer e seus mecanismos subjacentes, no entanto, permanecem em grande parte obscura. A identificação e caracterização desses componentes, assim, pode ajudar a acelerar o desenvolvimento de potenciais drogas anti-câncer.

Koelreuteria henryi

Dummer (

K

.

henryi

), uma planta endêmica em Taiwan, tem sido usada como uma medicina popular para o tratamento de enterite, hepatite, alergia, hipertensão, faringite, tosse, hiperlipidemia, e cancro em Taiwan [11-13]. Lignana, um composto derivado de fitoestrógeno que amplamente existe em ervas, apresenta diversos efeitos fisiológicos, incluindo a melhoria da função hepática e cardiovascular e prevenção de osteoporose e câncer [14]. Os lignanos também foram encontrados como sendo inibidores potentes de DNA humano de topoisomerase-I e II [15-17]. Austrobailignan-1, uma lignina natural, isolada a partir da folha de

K

.

henryi

, tem efeitos anti-proliferativos em vários tipos de células tumorais [13, 18, 19]; os efeitos e os mecanismos subjacentes de austrobailignan-1 em células cancerosas, no entanto, permanecem desconhecidas. Neste estudo, foram isoladas austrobailignan-1 a partir da folha do

K

.

henryi

, e examinaram a topoisomerase I de ADN efeito inibitório in vitro e efeitos citotóxicos de austrobailignan-1 em células não-pequenas do pulmão de células humanas cancerígenas. Descobrimos que austrobailignan-1 inibiram a actividade da topoisomerase 1 de ADN e de sinalização causado danos resposta, consequentemente retardou o ciclo celular na fase G2 /M e desencadeada a morte celular por apoptose em ambos adenocarcinoma do pulmão A549 e linhas de células H1299. Além disso, também mostrou que várias moléculas relacionadas à interrupção do ciclo celular e apoptose foram modulados por austrobailignan-1.

Materiais e Métodos

produtos químicos e reagentes

A 4 ‘, 6’-diamindino-2-fenilindole (DAPI), iodeto de propídio (PI), ribonuclease (RNase), dimetil sulfóxido (DMSO), e Triton X-100 foram adquiridos a partir de Sigma-Aldrich Inc. (St. Louis, MO. EUA ). soro fetal bovino e meio RPMI1640 foram adquiridos da Gibco BRL (Gaithersburg, MD, EUA). Os anticorpos contra p21

WAF1 /Cip1 (SC-397), p27

KIP1 (SC-667), p53 (SC-126), Cdc25C (SC-327), Cdk1 (SC-53219), ciclina A1 (SC-751), ciclina B1 (SC-245), Bcl-2 (SC-509), citocromo c (SC-13156) e β-actina (SC-47778) foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA , EUA). COX IV (4844), Mcl-1 (4572), Bax (2772), Bak (3814), PUMA (12450), fosfo-ATM (4526), ​​fosfo-H2AX (9718), fosfo-Chk1 (2341), fosfo -Chk2 (2661) e fosfo-p53 (9284) de anticorpo foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA) tal como descrito no relatório anterior [20]. O inibidor de caspase-2 (Z-VDDADFMK, # FMK003) foi adquirido a R D sistema (MN, EUA). O inibidor de caspase-3 (Z-DEVD-FMK, # 550378) ou caspase -9 (Z-LEHD-FMK, # 550381) foi adquirida a BD Bioscience (MD, EUA).

As linhas celulares e cultura de células

As linhas celulares de cancro de pulmão de células não-pequenas humanas, incluindo A549, H1299, A549-shRNA e A549-p53shRNA fornecido pelo Dr. Hsu-Shih-Lan [21] foram mantidas em RPMI 1640 com 5% inactivado por calor soro fetal bovino, e incubaram-se numa co 5%

2 incubadora a 37 ° C.

Material vegetal

As folhas de

K

.

henryi

foram coletados a partir de Taiwan pelo Dr. Chi-Luan Wen, Melhoria Semente Taiwan e da Estação de propagação, o Conselho da Agricultura, Secção Tecnologia Propagation, onde um voucher espécime foi depositado.

O isolamento e purificação de austrobailignan-1

O austrobailignan-1 utilizada neste estudo foi extraída e purificada a partir das folhas da

K

.

henryi

(Fig 1A) de acordo com os processos descritos em outra parte com pequena modificação [12]. Resumidamente, as folhas secas (1 kg) de

K

.

henryi

foram moídos e extraídos por etanol a 95% três vezes à temperatura ambiente. O extracto de etanol foi dividida com H

2O-CH

2Cl

2 (1: 1) mistura, e em seguida, o CH

2Cl

2 fracção foi recolhida e dissolvida em 90% de metanol seguido por extracção com hexano. A fracção de metanol foi recolhido e cromatografado sobre uma coluna de gel de sílica, utilizando-se hexano, hexano /CHCl

3 e CHCl

3 /metanol como o solvente de eluição, seguida por cromatografia em camada fina para recolher as fracções citotóxicos. Estas fracções foram reunidas e, em seguida, executado através de uma coluna de gel de sílica, eluída com um gradiente de hexano /EtOAc e seguido por uma coluna C8 Trabalho de fase inversa para se obter austrobailignan-1 seguida por liofilização na forma de pó com a pureza superior a 90% [22 ]. O pó foi então dissolvido em DMSO a uma concentração de caldo de 100 | iM para aplicações experimentais. A estrutura do austrobailignan-1 (Fig 1B) foi identificado por 2D

1H- e

13 C-RMN baseado em HETCOR e de longo alcance HETCOR dados espectrais, e uma comparação directa com os dados anteriores de lignanas relacionados [23] .

(A) A imagem de K. henryi Dummer (adotado de Herbanum, Academic Sinica, https://digiarch.sinica.edu.tw/content/repository/resource_content.jsp?oid=3819630). (B) A estrutura do austrobailignan-1 foi estabelecida através de

1H- e

13 C-RMN.

atribuições 13C-RMN foram baseados em HETCOR e de longo alcance HECTOR resultados espectrais.

A proliferação celular e análise da distribuição do ciclo celular

A549, A549-shRNA, A549-p53shRNA e células de cancro do pulmão H1299 foram semeadas em placas de 12 poços (2 x 10

4 células /cavidade). Após 24 h, as células foram tratadas com austrobailignan-1 para o período de tempo indicado, seguido por um ensaio de exclusão de azul de tripano. Além disso, ao analisar a distribuição do ciclo celular, as células tratadas com austrobailignan-1 foram fixadas com etanol, e, em seguida, coradas com iodeto de propídio, seguida por sujeição a um ensaio de citometria de fluxo para determinar a taxa de distribuição do ciclo celular.

Terminal rotulagem transferase dUTP cortado-end desoxinucle�ido (TUNEL) ensaio

O A549 ou H1299 células foram tratadas ou não com austrabalignan por 24 h. As células foram então sujeitas a ensaio de TUNEL, como descrito em outro relatório anterior [24].

a actividade da caspase ensaio

O austrobailignan-1-tratados ou não tratados células A549 foram recolhidas, lisadas e sujeitas a o ensaio de actividade de caspase, como descrito em outro lugar relatórios anteriores [24, 25].

imunotransferência

a extracção de lisados ​​celulares foram descrito no relatório anterior (ref), Resumidamente, as células foram extraídas com tampão de lise RIPA (NaCl 150 mM, Tris 10 mM, pH 7,5, 1% de NP-40, 1% desoxicolato, 0,1% de SDS, e cocktail de inibidor de protease). Os lisados ​​foram então separadas por SDS-PAGE, e, em seguida, transferidos para a membrana de PVDF seguido do procedimento de transferência de Western utilizando anticorpos indicados. A imagem foi resolvido pela quimiluminescência.

Protein subcelular fracionamento

O experimento foi descrito outro lugar no relatório anterior [26]. Resumidamente, as células progenitoras ou tratada austrobalignan-1-foram lisadas com tampão de sacarose (EDTA a 2 mM, sacarose 250 mM, DTT a 10 mM e EGTA a 2 mM) em gelo durante 30 min. Os lisados ​​foram então centrifugadas a 1300

g

durante 10 min a 4 ° C. O sobrenadante foi centrifugado adicionalmente 100.000 xg durante 30 min a 4 ° C para recolher a fracção citosólica. O sedimento de membranas pesado foi então ressuspenso em 1 ml de tampão de sacarose e colocado no topo de 1,2 e 1,5 M de tampão de gradiente de sacarose seguida de centrifugação a 1300

g

durante 30 min a 4 ° C. As fracções de mitocôndrias enriquecidos foram coletadas em 1.2 /1.5 M interphases respectivamente, seguidos por dissolução em tampão de lise RIPA.

Comet ensaio

O A549 e H1299 células foram tratadas com ou sem 30 e 100 nM austrobailignan-1 durante 24 h e o procedimento de ensaio do cometa incluindo preparação da lâmina, de lise, a incubação alcalina, a electroforese, a neutralização e a visualização foi levada a cabo tal como descrito noutro local [27]. O brometo de etídio ADN marcado foi visualizado sob um microscópio de fluorescência. O grau de dano ao DNA foi marcado por momento de cauda (DNA% no comprimento da cauda x cauda) a partir de células de pelo menos 100 em cada grupo de tratamento.

In vitro

DNA topoisomerase ensaio 1 a inibição

ADN a actividade da topoisomerase 1, foi determinada medindo o relaxamento do ADN super-enrolado plasmídeo como descrito em outro lugar, com pequenas modificações [28]. Resumidamente, várias concentrações de austrobailignan-1 foram adicionados à actividade mistura de reacção da topoisomerase-1 (incluindo 250 ng Phot um ADN-plasmídeo, 0,3 L de timo de vitela de ADN topoisomerase 1, 20 mM de Tris-HCl, pH 8,0, KCl 72 mM, 5 mM MgCl

2, ditiotreitol 5 mM, espermidina 2 mM, 0,01% de albumina de soro de bovino) durante 30 min a 37 ° C, e a reacção foi parada por carregamento de solução de corante (2,5% de SDS, EDTA a 25 mM, pH 8,0, 15% de Ficoll-400, 0,05% de azul de bromofenol, e 0,05% de xileno cyanole). Os produtos de reacção foram separados por electroforese em gel de agarose a 1%, e visualizados por coloração com brometo de etídio. CPT (camptotecina) foi usada como um controlo positivo.

Análises Estatísticas

Todos os dados foram apresentados como média ± D.P.. Cada resultado foi obtido pelo menos três experiências separadas. As comparações estatísticas foram avaliados por meio da análise de uma via da variância (ANOVA), e a significância foi determinada por meio do estudante

t

-test e apresentados como * p 0,05, ** p 0,01, *** p . 0.001

resultados

Austrobailignan-1 células /paragem G2 do ciclo celular M fase e morte celular em ambos os A549 e H1299 induzidas

A perda da função normal da p53 tinha vindo a encontrar em mais da metade de todos os tumores humanos [29]. A literatura mostra que a p53 é um dos reguladores mais importantes na mediação da paragem do crescimento e apoptose induzida por vários stresses intrínseca ou extrínseca, incluindo agentes quimioterapêuticos [30]. Além disso, a p53 é também um conector importante e comutador entre a paragem do ciclo celular e apoptose. Uma vez que os danos são incapazes de ser reparado, p53 ativa a transcrição de vários genes pró-apoptóticos, incluindo Bax, Noxa, PUMA, Fas e DR5 [31, 32] para executar o processo de apoptose. Alternativamente, p53 desencadeia apoptose por repressão de genes anti-apoptóticos tais como Bcl-2, induzindo assim a libertação de citocromo c seguido pela caspase-3 e -9 activação [31]. Está bem documentado que o estado de p53 pode afectar a resposta de células cancerosas para alguns fármacos quimioterapêuticos [33]. Nós, em primeiro lugar, examinou os efeitos antiproliferativos de austrobailignan-1 purificadas a partir das folhas de

K

.

henryi

(Fig 1 e [12]) em NSCLC humano A549 (+ p53, que uma colher p53 de tipo selvagem) e H1299 (-p53, que é p53-null) linhas celulares. Como mostrado na Fig 2A, o tratamento com austrobailignan-1 inibiu significativamente o crescimento de células A549 e H1299 em ambos os modos da sua concentração e dependentes do tempo com IC

50 valores de 41 e 22 nm após a administração de 48-h, respectivamente. Os resultados também mostraram que o tratamento de células de cancro do pulmão com concentrações baixas (inferiores a 10 nM) de austrobailignan-1 provocou um efeito citostático, apenas a proliferação das células, mas não inibiu o efeito citotóxico observado sob investigação microscópica. No entanto, o tratamento com alta concentração (30 e 100 nM) de 1-austrobailignan exibiram características morfológicas de morte celular por apoptose, flutuante e foram observadas células blebbing (dados não mostrados). Para abordar a acção exacto responsável pelo efeito antiproliferativo austrobailignan-1-mediada, o perfil de distribuição do ciclo celular foi examinada. Tal como indicado na figura 2B, a exposição de células A549 e H1299 com 30 e 100 nM de austrobailignan-1 durante 24 h conduziu a uma acumulação de células na fase G2 /M, em comparação com células de controlo, juntamente com uma diminuição concomitante na proporção de as células na fase G1 e S. Além disso, um hipodiploidia pico de conteúdo de DNA (população sub-G1), o que é indicativo de ADN degradado e uma característica da apoptose, foi observada após 24 h de tratamento de dose elevada e aumentou continuamente depois de 48 h austrobailignan-1 de incubação (Fig 2B ). Para confirmar ainda mais a indução de apoptose por austrobailignan-1 em células A549, foi realizado o ensaio de TUNEL e coloração com DAPI. Tal como indicado na figura 2C, o tratamento com 100 nM austrobailignan-1 durante 48 h induziram significativamente a morte celular por apoptose com núcleos condensados ​​e aumento das células positivas TUNEL (verde fluorescente células coloridas), sugerindo que a fragmentação de ADN estava a ocorrer nestas células.

(A) A549 H1299 e as células foram tratadas com várias doses (0, 1, 3, 10, 30 e 100 nM) de austrobailignan-1 para 24 e 48 h. O número de células foi medido por um método de exclusão de corante azul de Tripano-. Os dados são expressos como a média ± S.D. a partir de 3 experiências independentes. (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001 V.S. controlo). (B) As células foram tratadas com doses variadas (0, 3, 10, 30 e 100 nM) de austrobailignan-1 durante 24 e 48 h, e, em seguida, coradas com iodeto de propídio, e citometria de fluxo foi realizada para examinar a distribuição do ciclo celular. (C) As células foram tratadas com ou sem 100 nM austrobailignan-1 durante 48 horas, um ensaio de TUNEL foi, em seguida, realizado para detectar células apoptóticas (verde) e o ADN nuclear foi corado com DAPI (azul). As células coradas foram investigadas por microscopia de fluorescência. Ampliação x 400; barra de escala, 50 mm.

Austrobailignan-1 inibiu a topoisomerase 1 actividade e induziu o dano ao DNA via de sinalização

compostos da família Lignan foram encontrados para ser potentes inibidores da topoisomerase DNA humano 1 [16, 17]. Em seguida, utilizou-se um kit de ensaio de ADN relaxamento comercial para a medição in vitro da actividade da topoisomerase 1, na presença de austrobailignan-1. Este kit é majorly para analisar a capacidade da topoisomerase-1 para relaxar um ADN super-enrolado. Figura 3A mostra que austrobailignan-1 inibiram a actividade de relaxamento do ADN da topoisomerase uma forma dose-dependente. A camptotecina, um conhecido inibidor de topoisomerase 1, foi utilizado como controlo positivo. A 100 nM, austrobailignan-1 exibiram actividade inibitória equipotente à camptotecina (100 uM), indicando que austrobailignan-1 pode ser mais eficaz do que o da camptotecina.

(A) Inibição da actividade da topoisomerase 1 de ADN. Ph-1 DNA de plasmídeo foi incubada com várias concentrações de austrobailignan-1 (0, 10, 30, e 100 nM) e topoisomerase 1 a 37 ° C durante 30 min. Os produtos de reacção foram separados por gel de agarose a 1% e coradas por brometo de etídio. A imagem de fluorescência foi gravada por microfotografia. A camptotecina (CPT) foi usada como um controlo positivo. S. C. DNA: DNA super-enrolado, Relax DNA: descontrair DNA circular fechado. resposta a danos (B) de ADN. As células A549 e H1299 foram tratadas com ou sem 30, 100 nM austrobailignan-1 durante 24 h, e os danos do ADN na base por célula foi examinada por um ensaio de cometa. cometa imagens representativas das células expostas a austrobailignan-1 a várias concentrações, são mostradas (painel superior). O grau de dano de ADN foi marcado por momento de cauda (% de ADN de comprimento cauda cauda X) a partir de pelo menos 100 células em cada grupo de tratamento (painel inferior). Os dados são média ± SD de três experiências independentes. **

p Art 0,01, ***

p Art 0,001. (C) Activação de ATM via de sinalização por austrobailignan-1. A549 H1299 e as células foram tratadas com várias concentrações de austrobailignan-1 durante 24 h, os níveis expressos de fosforilada ATM, Chk1, Chk2, H2AX, e as proteínas p53 foram investigadas por meio de análise de mancha de Western. β-actina foi usado como um controle de carga interna

A literatura mostra que topoisomerase 1 inibidor pode induzir quebras de cadeia dupla (DSB) e, em seguida, levar a DNA danos resposta [34, 35].; Portanto, um ensaio do cometa foi realizada para examinar se austrobailignan-1 causou danos no DNA de A549 e as células H1299. Como representado na Fig 3B, austrobailignan-1 aumentou o movimento da cauda do cometa em ambas as células testadas de uma forma dependente da concentração. ATM é um sensor de danos no ADN bem conhecida e regulador. Após a exposição a tensões de danos no DNA, tais como o stress oxidativo ou inibidores da topoisomerase 1 e 2, ATM quinases /ATR são activadas por fosforilada na ser1981 [36], que por sua vez fosforila numerosos substratos a jusante, incluindo Chk1-ser345, Chk2-thr68, γH2AX -ser139 e p53-ser15, etc., e, finalmente, levando à interrupção do ciclo celular e apoptose [37, 38]. Em seguida, foram examinados os efeitos potenciais de austrobailignan-1 na via de sinalização de ATM. Os dados da análise de Western blot mostrou claramente uma fosforilação dependente da concentração de ATM-ser1981, Chk1-ser345, Chk2-thr68, γH2AX-ser139 e p53 em células-ser15 austrobailignan-1-tratados (Fig 3C). No entanto, os níveis totais de ATM, Chk1, Chk2 e permaneceu inalterada em resposta à exposição austrobailignan-1 (dados não mostrados).

Austrobailignan-1 proteínas do ciclo celular regulado relacionados

Demonstrámos que a p53 podem ser fosforiladas por cinases ATM /ATR na presença de austrabailignan-1 em células A549. O p53 activo pode aumentar os níveis de transcrição de p21 expressão

WAF1 /Cip1, p27

Kip 1 [39], que são ambos disjuntores de progressão do ciclo celular. Além disso, a dupla especificidade família fosfatase Cdc25 (Cdc25A, CDC25B e Cdc25C) é outro transdutor de sinal comum substrato a jusante da ATR /ATR /SCMJ. fosforilada da inactivação mediada por Cdc25C ATM /ATR /chKS desempenha um papel crucial na prisão fase G2 /M e, subsequentemente, a apoptose induzida por vários agentes anti-tumor [40-43]. Para abordar o evento molecular subsequente do retardamento do ciclo celular austrobailignan-1-mediada, os níveis de expressão das moléculas de G2 /relacionados-H, tais como p53, p27

Kip 1, p21

WAF1 /Cip1, Cdk1, Cdk2, ciclina a, ciclina B1 e Cdc25C foram examinados depois de várias doses de austrobailignan-1 (0, 10, 30, e 100 nM) tratamento das células A549, durante 24 h. Como esperado, as expressões de p53, p21

WAF1 /Cip1, p27

KIP1 e ciclina B1 foram aumentadas, enquanto a ciclina A e Cdc25C foram reduzidos (Figura 4A) nas células tratadas austrobailignan-1-comparado com células de controlo não tratadas. Os níveis de Cdk1 e Cdk2 não foram afetados pela austrobailignan-1. Limitada pela disponibilidade composto, que só níveis p21

WAF1 /cip1, p27

Kip 1 e Cdc25C foram examinados em linha de células H1299 p53 nulo. Da mesma forma, a sobre-regulação de p21

WAF1 /Cip1 e p27

KIP 1 e células H1299 sub-regulação de Cdc25C foram observadas em austrobailignan-1-tratados (Fig 4B). Estes resultados indicaram que austrobailignan-1 mediada por eventos celulares e moleculares nas linhas celulares testadas foram p53 independentemente.

células A549 (A) foram tratados com 0, 3, 10, 30 e 100 nM de austrobailignan-1 para 24. Depois do tratamento, extracto de células foram recolhidos e analisados ​​por Western blot. (B) H1299 células foram tratadas com 0, 10, 30, 100 nM austrobailignan-1 durante 24 h, os níveis de p21Waf1 /Cip1, p27Kip1 e Cdc25C foi detectada por transferência de Western. β-actina foi utilizado como um controlo de carga.

Austrobailignan-1 induzida intrínseca mediada por mitocôndrias apoptose

Como a activação de caspase desempenham um papel central durante a fase da execução, de apoptose [44] , para examinar se austrobailignan-1 induziu a apoptose através da activação da via da caspase, a actividade de caspases-2, -3, -8, -9, -12 e foi estimada usando um kit de substrato peptídeo fluorogénico caspase. Como mostrado na Fig 5A e 5B, o tratamento de células A549 e H1299 com 100 nM austrobailignan-1 resultou na activação de caspase-relacionadas a mitocôndria-2, -9 e -3, mas não a morte receptor relacionado com a caspase-8 e endoplasmático retículo-associado caspase-12. Para caracterizar o papel da activação da caspase em induzida por austrobailignan-1 apoptose, A549 e H1299 células foram pré-tratados com inibidores da caspase-2 (Z-VDDADFMK), caspase-3 (Z-DEVD-FMK), e caspase-9 (Z -LEHD-FMK) durante 1 h, e depois tratou-se com 100 nM austrobailignan-1 durante mais 48 h. Os inibidores da caspase-2, -3 e -9, protegeu significativamente A549 e células H1299 contra a morte celular mediada austrobailignan-1-(Figura 5C). Estes resultados sugeriram que as caspases activadas pode contribuir para a apoptose nestas células austrobailignan-1-disparado.

(A) As células A549 foram tratadas com 100 nM de austrobailignan-1 para períodos indicados de tempo (0, 12, 24 e 48 h). (B) As células foram expostas a H1299 austrobailignan-1 durante 48 h. Os lisados ​​de células foram colhidas, e as actividades de caspase foi determinada usando substratos fluorogen. Os dados são expressos como a média ± S.D. a partir de três experiências independentes. (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001 V.S. de controlo tratado com veículo). inibidores (C) Caspase bloquear a morte celular induzida austrobailignan-1-. As células A549 foram pré-tratadas e H1299 com 50 uM indicado inibidores de caspase durante 1 h, e depois tratou-se com 100 nM austrobailignan-1 durante mais 48 h. A viabilidade celular foi medida por um método de exclusão do corante azul tripano. (D) O Regulamento de proteínas da família Bcl-2. As células A549 e H1299 foram tratados com 0, 30, 100 nM austrobailignan-1 durante 48 h. Os níveis de proteínas indicadas família Bcl-2 foram examinados por transferência de Western. (E) A libertação de citocromo

c

da mitocôndria para o citosol. As células A549 e H1299 foram tratadas com ou sem 100 nM austrobailignan-1, durante 24 e 48 h. Após o tratamento, em partículas e fracções citosólicas foram isolados, a nível do citocromo

C

proteína foi analisada por Western blot. α-tubulina e citocromo oxidase de IV foram utilizadas como controlo de carga.

Com base nos resultados acima, a activação de caspase-2, -3 e -9 envolvida na apoptose induzida austrobailignan-1- , indicando que a via de apoptose mitocondrial foi activado. Sabe-se que as proteínas da família Bcl-2 estão envolvidas em apoptose mediada por mitocôndrias intrínseca [45]. Para obter mais insights sobre os eventos moleculares envolvidos na apoptose induzida austrobailignan-1-, foram examinados os níveis expressos de Bcl-2, Mcl-1, Bax, Bak, e PUMA. A expressão de moléculas pro-apoptóticas Bax, Bak, e PUMA foi drasticamente aumentada, enquanto que os níveis de proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 e de Mcl-1 diminuiu a seguir foram austrobailignan 1-tratamento (Figura 5D). Citocromo C desempenha um papel fundamental na Bcl-2 morte por apoptose mediada por proteínas da família. É normalmente reside na mitocôndria mas transloca-se para o citosol, conduzindo a activação da caspase no aparecimento de tensões apoptóticas. Assim, a distribuição celular de citocromo c foi investigado. Como representado na Fig 5E, a administração de austrobailignan-1 resultou na libertação de citocromo c mitocondrial ao citosol. Estes resultados sugerem que a apoptose induzida por austrobailignan-1 foi principalmente através da via intrínseca desencadeada-mitocondrial.

p53 não foi necessariamente necessário para G2 do ciclo celular /M induzida por prisão austrobailignan-1 e morte celular

Os nossos resultados mostraram que autrobailignan-1 da morte celular induzida tanto em A549 e linhas de células H1299 (Fig 2A e 2B). A fosforilação de p53 no Ser

15 sites geralmente representa ativação apoptótica [46]. As Figs 4A e 5E mostram que austrobailignan 1-tratamento aumentou os níveis de p53 total e fosforilada de p53-ser15 em células A549, o que implica um papel da p53 na morte celular austrobailigan-1-induzida. Para caracterizar se p53 na verdade desempenha um papel importante na paragem do ciclo celular mediada austrobailignan-1-e apoptose, o próximo examinou o efeito de austrobailignan-1 em A549 p53-knockdown (A549-p53-shRNA) células, que foram estavelmente transfectadas com uma p53 espec�ico shRNA [47]. Não houve diferença significativa entre as células de controlo do vector A549 (A549 (-shRNA) e A549-p53-shRNA células em paragem do ciclo celular (Figura 6A) e da viabilidade celular após 48 horas de tratamento austrobailignan-1 (Figura 6B). Por conseguinte, concluir que G2 austrobailignan-1 mediada /M prisão e a morte celular não exige necessariamente que a p53.

(A) As células A549-A549-shRNA ou p53shRNA foram tratados com austrobailignan-1 (0, 10, 30 , e 100 nm) durante 48 h. A distribuição do ciclo celular foi determinada por cyotmetry fluxo. (B) A549-shRNA e A549-p53shRNA células foram tratadas com ou sem 100 nM austrobailignan-1 durante 48 horas. Os níveis de proteína p53 eram detectada por Western blot (painel superior). a viabilidade celular foi determinada por um método de exclusão de azul de tripano (painel inferior).

Discussão

neste estudo, nós fornecemos a evidência que mostra que austrobailignan-1, um composto família lignana isolado do

Koelreuteria henryi

Dummer, inibiu a atividade da topoisomerase-1, e, em seguida, provocou um dano ao DNA via de sinalização, consequentemente levou à detenção do ciclo celular e apoptose em não humanos A549 câncer de pulmão de pequenas células e as células H1299. Os níveis crescentes de p21

WAF1 /Cip1 e p27

KIP1, e diminuindo o nível Cdc25C, indicou que estas moléculas estavam ativamente envolvidos na resposta ao austrobailignan-1 induzida por G2 /M detenção. Além disso, as moléculas relacionadas com apoptose mitocondrial, tais como as proteínas da família Bcl-2, citocromo c, caspase-2, 3 e 9, contribuíram para austrobailignan-1-desencadeada a morte celular por apoptose.

ADN topoisomerase 1 regula o estado topológico de ADN em muitos processos celulares, incluindo a replicação do ADN e a transcrição [48, 49]. Os compostos que inibem a topoisomerase uma actividade têm sido amplamente utilizados como fármacos anti-cancerígenos, porque o bloqueio da topoisomerase 1 actividade pode causar danos ao DNA e iniciar a pontos de verificação de ADN que provocam a paragem do ciclo celular e, subsequentemente, induzir a morte das células [34, 50].