Abstract
Fundo
Kaempferol tem sido proposto como uma droga potencial para quimioprevenção e tratamento do câncer, porque é um polifenol natural, contida em alimentos de origem vegetal. Estudos recentes têm demonstrado que o kaempferol protege contra doenças cardiovasculares e câncer. Com base nesta constatação, investigamos os mecanismos pelos quais kaempferol produz o efeito anti-metastático em células de células escamosas carcinoma SCC4 língua humana.
Metodologia /Principais Achados
Neste estudo, nós fornecemos molecular evidência associada com o efeito anti-metastática de campferol, demonstrando uma supressão substancial da migração celular e invasão SCC4. Este efeito foi associado com expressão reduzida de proteína níveis de MMP-2 e TIMP-2 e ARNm. Análise da regulação transcricional indicou que kaempferol inibida MMP-2 transcrição suprimindo a atividade c-junho Kaempferol também produzido um efeito inibitório sobre a fosforilação de ERK1 /2.
Conclusões
Estes resultados fornecem novas perspectivas sobre os mecanismos moleculares envolvidos no efeito anti-metastática de campferol, e são valiosos no a prevenção da metástase do câncer bucal
Citation:. Lin CW, Chen PN, Chen MK, Yang WE, Tang CH, Yang SF, et al. (2013) Kaempferol Reduz metaloproteinase de matriz-2 Expressão de Down-Regulação ERK1 /2 e as proteína ativadora-1 vias de sinalização em células de cancro oral. PLoS ONE 8 (11): e80883. doi: 10.1371 /journal.pone.0080883
editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, China
Recebido: 02 de outubro de 2013; Aceito: 18 de outubro de 2013; Publicação: 20 de novembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Lin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi financiado por subvenções do Conselho Nacional de Ciência, Taiwan (NSC-100-2632-B-040-001-MY3). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Competir interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
carcinomas de células escamosas oral (CCEO) são a sexta neoplasia maligna mais comum em todo o mundo e a quarta principal causa de mortes por câncer entre os homens em Taiwan [1]. A cirurgia e a terapia de radiação são uma modalidade de tratamento importante na fase inicial de CEB [2]. Apesar dos avanços na terapia, CEB ainda está caracterizam por serem recorrentes e metástases para linfonodos cervicais regionais, que produz pobres prognósticos de pacientes. A taxa de sobrevivência de cinco anos de doentes com cancro é inferior a 50%, mas as possibilidades de diagnóstico precoce e prevenção desta doença é susceptível de aumentar se o mecanismo molecular é identificado [3]. Embora a causa da CEB é multifactorial, metástase, a qual é resistente a terapias convencionais, é provável que seja a principal causa de morte [4].
A degradação das membranas basais e do estroma componentes da matriz extracelular (ECM) constitui um processo crucial durante a invasão do tecido local e metástases [5]. Através da secreção de enzimas proteolíticas, as células tumorais podem criar um caminho para migrar tanto local como remotamente. As metaloproteinases de matriz (MMPs) pertencem a uma família de endopeptidases dependentes do zinco que degradam vários componentes da ECM [6]. A estrutura e o substrato da família MMP permite que seja dividido em subgrupos de colagenases, estromelisinas, gelatinases, do tipo de membrana, as MMPs e outras MMPs [7]. Estes são crucial para os processos fisiológicos normais, tais como desenvolvimento embrionário, inflamação, angiogénese, e cicatrização de feridas. No entanto, a investigação recente demonstrou que níveis elevados de MMP são muitas vezes correlacionadas com cancros humanos, tais como o pulmão [8], da mama [9], no fígado [10], e cancros oral [11]. As actividades das MPM são regulados por inibidores fisiológicos, inibidores de tecidos de metaloproteinases (TIMPs) [12]. O desequilíbrio de MMPs e TIMPs activas é um elemento crucial envolvida na remodelação da matriz extracelular exposta em um número de estados de doença [13]. Gohji et ai. sugerido que a MMP-2 no soro:. relação de TIMP-2 é um indicador de prognóstico independente de recorrência do cancro urotelial [14]
Os flavonóides são compostos fenólicos que são encontrados em frutos e vegetais [15]. Os flavonóides são comumente utilizados na prevenção de doenças cardiovasculares [16], [17]. Além disso, estudos anteriores demonstraram que os flavonóides dietéticas inibir o desenvolvimento de vários cancros humanos, tais como cancro da mama [18], o cancro da próstata [19] e do cancro colo-rectal [20]. Caempferol, um polifenol natural, pertencente ao grupo dos flavonóides, está presente em níveis elevados em chá, uvas, brócolos, bagas e [21], [22]. Vários estudos anteriores indicaram que exibe kaempferol antioxidantes [23], anti-inflamatórios [24] e propriedades antitumorais [25]. Há pelo menos seis tipos diferentes de flavonóides. Kaempferol pertence à flavonol e têm uma estrutura semelhante como quercein e miricetina, que também têm efeitos anti-cancro [26]. Kaempferol foi descoberto para inibir a angiogênese ea expressão de VEGF em células de cancro do ovário humano, e os caminhos envolvidos na regulação do HIF-1α [27]. Kaempferol também produziu um efeito apoptose através da expressão de AKT em células de glioma humanas [28] e células de leucemia [29]. Estudos recentes indicaram que induz kaempferol G2 /M, a paragem do ciclo celular e morte celular em células cancerosas autophagic hepáticos humanos [30]. Além disso, Kang et ai., Reportado que a quercetina e campferol 3-induzida apoptose dependente da caspase em células cancerosas da cavidade oral [31]. No entanto, o efeito do campferol na metástase do cancro de CEB, e os mecanismos subjacentes a este efeito, não foi ainda estudado. Neste estudo, demonstramos que a supressão da capacidade metastática por kaempferol é produzido pela infra-regulação da MMP-2 expressão, e esperamos fornecer uma base para futuras pesquisas.
Materiais e Métodos
celular e cultura de células
SCC-4, uma linha de células da língua humana carcinoma epidermóide obtidas de ATCC (Manassas, VA, EUA) foi cultivada em meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com um volume igual de um nutriente mistura, meio F-12 de Ham (Life Technologies, Grand Island, NY, EUA), 10% de soro fetal de bovino (Hyclone Laboratories, Logan, UT, EUA), glutamina 2 mM, 100 U /mL de penicilina, 100 ug /mL de estreptomicina e 400 ng /ml de hidrocortisona. Todas as culturas de células foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO
2.
ensaio de viabilidade celular (ensaio MTT)
SCC4 células foram semeadas em placas de 24 poços a uma densidade de 5 x 10
4 células /cavidade e tratados com kaempferol a uma concentração entre 0-100 uM a 37 ° C durante 24 h. Após o período de exposição, o meio foi removido, e as células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e depois incubados com 20 ul de MTT (5 mg /mL) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA) durante 4 h. O número de células viáveis por placa é directamente proporcional à produção de formazano, pelas desidrogenases na mitocôndria dentro de células vivas, que pode ser medida espectrofotometricamente a 563 nm seguintes solubilização com isopropanol.
A migração celular e ensaios de invasão
Depois de um tratamento com campferol (0, 20, 40, 60, 80 e 100 uM) durante 24 h, as células sobreviventes foram colhidas e semeadas a Boyden câmara (Neuro Probe, Cabin John, MD, EUA) a 10
4 células /poço em meio isento de soro e depois incubadas durante 24 h ou 48 h a 37 ° C no ensaio de ensaio de migração ou invasão, respectivamente. Para o ensaio de invasão, 10 mL de Matrigel (25 mg /50 ml; BD Biosciences, MA, EUA) foi aplicada a 8 filtros de membrana de policarbonato de tamanho de poro e a câmara de fundo continha meio padrão. As células invadidas foram fixadas com metanol 100% e coradas com Giemsa 5%. Os números de células foram contadas sob um microscópio de luz. O ensaio de migração foi realizada como descrito no ensaio de invasão sem o revestimento de Matrigel.
gel de substrato Gelatina zimografia
As actividades de MMP-2 em meio condicionado foram medidos por ensaios de zimografia de protease . Resumidamente, meios recolhidos de um volume adequado (ajustado pelo número de células vitais) foram preparadas com tampão de amostra de SDS, sem ebulição ou de redução e submetido a 0,1% de gelatina e 8% de electroforese SDS-PAGE. Após a electroforese, os géis foram lavados com 2,5% de Triton X-100 e então incubadas em tampão de reacção (Tris-HCl a 40, pH 8,0; CaCl 10 mM
2 e 0,01% NaN
3) durante 12 h a 37 ° C. Então gel foi corado com azul brilhante de Coomassie R-250. As bandas correspondentes a actividade de MMP-2 foram visualizadas por coloração negativa usando 0,3% azul de Coomassie em metanol 50% e 10% de ácido acético.
análise Western blot
lisados celulares foram preparados por suspensão de 2 × 10
6/10 cm de placa em 200 ul de RIPA contendo inibidores de protease tampão coquetel. Os lisados celulares foram submetidos a uma centrifugação de 10.000 rpm durante 10 min a 4 ° C, e o sedimento insolúvel foi rejeitado. A concentração de proteína de lisados de células totais foi determinada pelo ensaio de Bradford. Os 20 ^ g de amostras de lisados de células totais ou fracções nucleares foram separadas por SDS-PAGE em géis de poliacrilamida a 10% e transferidas para uma membrana de nitrocelulose usando o sistema de electroforese Mini-Tetra-Protean como descrito anteriormente [32]. A membrana foi subsequentemente incubada com 5% de leite não gordo em solução salina tamponada com Tris (Tris 20 mM, NaCl 137 mM, pH 7,6) durante 1 h para bloquear a ligação não específica e em seguida durante a noite com anticorpos policlonais contra a MMP-2, TIMP -2 ou três MAPK (ERK 1/2, 1/2 JNK e p38) com anticorpos específicos para as formas fosforiladas de não fosforilados ou o correspondente 1/2 ERK, JNK e p38 1/2. As manchas foram então incubadas com um anti-coelho de peroxidase de rábano de cabra ou IgG anti-ratinho durante 1 h. Em seguida, o sinal foi detectado utilizando quimioluminescência aumentada (ECL) kit comercial (Amersham Biosciences) e densidade fotográfica relativa foi quantificada pela digitalização dos negativos fotográficos em um sistema de documentação do gel e análise (AlphaImager do sistema HP, Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA, EUA).
isolamento de ARN, semi-quantitativa por RT-PCR quantitativo TaqMan e PCR em tempo real
O ARN total foi isolado a partir de 1 × 10
6 SCC4 células utilizando Trizol (Life Technologies , Grand Island, NY) de acordo com as instruções do fabricante. O ARN total (2 ug) foi transcrito de modo reverso em ADNc por SuperScript III Síntese da primeira cadeia Supermix (Invitrogen, Carlsbad, CA). A PCR foi realizada numa mistura de reacção contendo 2 l de ADNc, 0,2 mistura de dNTP mM, 2 pM de cada um dos iniciadores, 1 U de polimerase Taq de ADN, e a concentração de 1-vez de Tampão térmica Pol (New England Biolabs, MA, EUA) por desnaturação a 95 ° C durante 5 min, seguido pela amplificação dos ciclos indicados de 95 ° C durante 30 seg, 62 ° C durante 30 seg, e 72 ° C durante 30 seg. As sequências iniciadoras específicas para estes genes são os seguintes: MMP-2: 5′-GGCCCTGTCACTCCTGAGAT-3 ‘(para a frente), 5′-GGCATCCAGGTTATCGGGG A-3′ (inverso), e o TIMP-2: 5’-GGCGTTTTGCAATGCAGATGTAG-3 ‘ (para a frente), 5’-CACAGGAGCCGTCACTTCTCTTG-3 ‘(reverso). A análise de PCR quantitativa em tempo real foi realizado utilizando um Taqman-passo de PCR Master Mix (Applied Biosystems). 100 ng de cDNA total foram adicionados por cada 25 uL de reacção com MMP-2 ou GAPDH iniciadores e sondas Taqman. As MMP-2 e GAPDH iniciadores e sondas foram concebidos utilizando o software comercial (ABI PRISM Sequence Detection System; Applied Biosystems). Os ensaios de PCR quantitativa em tempo real foram efectuadas em triplicado em um sistema de detecção de sequência StepOnePlus. O limiar foi fixado acima do fundo do controlo não-molde e no interior da fase linear da amplificação do gene alvo para calcular o número do ciclo em que foi detectado o transcrito.
luciferase repórter ensaio de gene
células SCC4 foram semeadas a uma concentração de 5 × 10
4 culas por po em placas de cultura celular de 6 poços. Um fragmento do promotor de MMP-2 foi inserido no vector pGL3-basic para gerar o plasmídeo promotor de MMP-2. Após 24 h de incubação, pGL3-basic (vector) e MMP-2 plasmídeo promotor foram co-transfectadas com um vector de expressão β- galactosidase (pCH110) nas células utilizando Turbofect (Fermentas, Carlsbad, CA). Após 12 horas da transfecção, as células foram tratadas com o veículo ou campferol (0, 20, 40, 60, 80 e 100 uM) durante 24 h. actividades de luciferase e β-galactosidase foram ensaiadas de acordo com o protocolo do fabricante (Promega). A luminescência foi medida utilizando um luminómetro de microplacas Tropix TR717 (Applied Biosystems). O valor da actividade de luciferase foi normalizada para a eficiência de transfecção e expressão monitorizada por β-galactosidase.
desvio de mobilidade electroforética ensaio
ensaios de ligação em extractos nucleares de AP-1 foi realizada com dupla marcado com biotina -cordas oligonucleótidos de c-Jun (5′-CGCTTGATGAGTCAGCCGGAA-3 ‘) de ensaio, e o desvio de mobilidade electroforética foi realizado usando o kit de Lightshift (Promega). Resumidamente, as reacções de ligação, contendo 10 ug de proteína nuclear, 10 mM de Tris, 50 mM de KCl, 1 mM de ditiotreitol, MgCl 5 mM de
2, 2? G de poli (dI · dC) e 2 pmol de sonda de oligonucleótido foram incubadas durante 20 min à temperatura ambiente. complexos DNA-proteína foram separados por electroforese num gel de acrilamida não desnaturante 6%, transferido para membranas de nylon carregadas positivamente e então reticulado num reticulador de Stratagene. turnos de gel foram visualizadas com uma estreptavidina-peroxidase de rábano seguido de detecção quimioluminescente. Os oligos não marcados de AP-1 em 200 × foram adicionados para competir especificamente com a ligação de oligo marcado no EMSA competitivo.
análise de imunoprecipitação de cromatina (ChIP)
análise de imunoprecipitação da cromatina foi realizada como descrito anteriormente [33]. Em resumo, a cromatina e proteínas de aproximadamente 2 × 10
6 células foram reticuladas com formaldeído a 1% durante 10 min à temperatura ambiente. Estas células foram recolhidas, lisadas, e sonicado em gelo para cortar o ADN de cromatina um comprimento entre 200 – 1000 pares de base utilizando Sonicator 3000 (Misonix, Nova Iorque, EUA). O lisado sonicado foi cromatina imunoprecipitada com anticorpo anti-c-Jun, e recolhidas com Proteína A /G agarose (Pierce, IL, EUA). As ligações cruzadas de proteína /ADN dos complexos imunoprecipitados foram revertidas por incubação em NaCl a 0,2 M a 65 ° C durante 4 h, e, em seguida, o ADN foi purificado e aplicado a PCR tal como descrito acima, para determinar a capacidade de ligação de c-Jun a MMP- 2 promotor. As sequências dos iniciadores são 5′-CTCTTTAGCTCTTCAGGTCTCAGC-3 ‘(para a frente), e 5′-TGTTGGGAACGCCTGACT-3’ (reverso).
A análise estatística
Para todas as medições, análise da variância seguido de comparação a posteriori de Scheffe foi utilizado para avaliar as diferenças entre o controlo e as células tratadas com várias concentrações de campferol. A diferença em p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo e as experiências foram repetidas três vezes
Resultados
Efeito do kaempferol sobre a viabilidade das células SCC4
Foram analisados. os efeitos citotóxicos do campferol a várias concentrações (0-100 uM) de células SCC4 utilizando o ensaio MTT. Como mostrado na Figura 1, usando tratamento kaempferol nas células SCC4 produzidos nenhum efeito citotóxico sobre a viabilidade celular. Portanto, esta gama de concentrações de campferol foi utilizado nas experiências seguintes.
SCC4 células foram tratadas com várias concentrações (0, 20, 40, 60, 80, e 100 uM) do campferol, durante 24 horas. A viabilidade celular foi determinada utilizando um ensaio MTT. Os valores representavam as médias ± DP de pelo menos três experiências independentes.
Kaempferol inibe a migração celular SCC4 e invasão
Para verificar se a migração e invasão celular foram suprimidos por kaempferol, nós semeadas células SCC4 numa câmara de Boyden e calculado o número de células invasivas na presença de campferol. Observou-se que kaempferol inibiu substancialmente a migração e a invasão de células SCC4 de uma forma dependente da dose, com apenas 58% e 56% remanescente após um tratamento com 100 uM de kaempferol às 24 h e 48 h, respectivamente (Figuras 2A e 2B) .
Depois de ser tratada com kaempferol a uma concentração de 0, 20, 40, 60, 80, e 100 uM, (a), a migração celular e invasão da célula (B) foram medidos utilizando uma câmara de Boyden de 24 horas e 48 horas, respectivamente. Os valores representavam as médias ± DP de pelo menos três experiências independentes. * P . 0,05 como comparado com o controlo
Kaempferol reduz a expressão de MMP e de TIMP
Para demonstrar se a supressão da migração SCC4 foi mediada através da regulação da expressão de MMP-2 , foi realizado um ensaio de zimografia de gelatina. Os dados zimografia indicaram que a actividade da enzima MMP-2 foi inibido em 53% à concentração mais elevada de campferol (100 ^ M) (Figura 3A). A Figura 3B mostra uma análise de transferência de Western dos níveis de proteínas de MMP-2 e TIMP-2. Os níveis de proteína de tanto a MMP-2 e TIMP-2 diminuiu substancialmente. A expressão de mRNA também demonstraram os mesmos resultados (Figura 3C). Nós também utilizado um ensaio de PCR em tempo real quantitativo para confirmar a expressão de ARNm de MMP-2 (Figura 3D). Assim, Kaempferol inibe consideravelmente a MMP-2 de expressão do mRNA de uma forma dependente da concentração.
SCC4 células foram tratadas com várias concentrações (0, 20, 40, 60, 80 e 100 pM) de 24 horas para campferol . Os meios condicionados foram recolhidos e a actividade de MMP-2 foi detectada (A), ou uma mancha de Western com anti-MMP-2 e anticorpos anti-ITMP-2 foi realizada (B). (C) semiquantitativa RT-PCR foi realizada para comparar os níveis de MMP-2 e TIMP-2 de ARNm. (D) Os níveis de ARNm de MMP-2 foram quantificados usando um ensaio de PCR em tempo real. Os valores representavam as médias ± DP de pelo menos três experiências independentes. * P . 0,05 como comparado com o controlo
Kaempferol inibe a actividade de transcrição de MMP-2
Para investigar se o campferol regulada a actividade do promotor de MMP-2, nós realizado um ensaio de repórter de luciferase, e um gene repórter que continha a região do promotor de MMP-2 foi transfectada para as células SCC4. Como mostrado na Figura 4A, a actividade do promotor de MMP-2 foi reduzida de uma forma dependente da dose, indicando que kaempferol inibe a MMP-2 de expressão a nível da transcrição.
(A) As células foram transfectadas com SCC4 básico pGL3 ou um promotor de plasmídeo repórter /MMP-2, em seguida, tratado com várias concentrações (0, 20, 40, 60, 80, e 100 uM) do campferol. Após 24 horas de incubação, as actividades de luciferase foram determinadas e normalizadas para a actividade de p-galactosidase. (B) Extracto nuclear preparado a partir de células SCC4 com várias concentrações (0, 20, 40, 60, 80, e 100 uM) do campferol foram incubadas com oligonucleótidos específicos de AP-1 marcada com biotina, com sequência de consenso para o AP-1 de ligação. complexos ligados foram analisadas utilizando um ensaio de desvio de mobilidade electroforética. (C) A ligação de c-Jun ao promotor de MMP-2 foi medida utilizando um ensaio de chip. (D) Os resultados representativos dos níveis da proteína de c-fos e c-jun por meio de análise Western Blot. Os valores representavam as médias ± DP de pelo menos três experiências independentes. * P . 0,05 em comparação com o controle
Kaempferol diminui c-Jun /AP-1 ativação em células SCC4
Como os dados anteriores revelaram que AP-1 foi uma transcrição chave regulador de MMP-2 promoção [33], foram então realizados ensaios de EMSA e chip para investigar o efeito do campferol na actividade de ligação de ADN de AP-1. Tal como ilustrado na Figura 4B, a actividade de ligação de AP-1 ao promotor da MMP-2 diminuiu significativamente em células SCC4 depois de ser tratado com kaempferol de um modo dependente da concentração. Especificamente, a capacidade de ligação de AP-1 no promotor do gene de MMP-2 foi reprimida em células SCC4 depois de ser tratada com 60 uM campferol (Figura 4C) .Para determinar os factores de transcrição, foi utilizado um ensaio de Western Blot para detectar a translocação nuclear de c-jun e c-fos. O tratamento de células com SCC4 kaempferol reduziu a translocação nuclear de c-Jun, mas não produziram efeitos sobre o nível de c-fos (figura 4D).
Kaempferol inibe a fosforilação de ERK1 /2
de acordo com os dados que recolheu, kaempferol inibiu a migração de células SCC4 por redução da expressão de MMP-2. Para investigar adicionalmente o mecanismo subjacente à capacidade anti-metastática de células em campferol SCC4, foi utilizado um ensaio de Western Blot para detectar a expressão das vias de MAPK. A Figura 5A mostra que a fosforilação de ERK foi suprimida após tratamento das células com SCC4 campferol. No entanto, a fosforilação das vias JNK1 /2 e p38 permaneceram inalterados (Figuras 5B-5C).
SCC4 células foram tratadas com várias doses de campferol (0, 20, 40, 60, 80, e 100 ^ M ) durante 24 horas e os lisados de células totais preparados a partir destas células foram utilizadas para a análise western blot com (a) anti-ERK1 /2, (B), anti-JNK1 /2 e (C) anti-p38 () anticorpos totais e fosforilados como descrito na secção Materiais e Métodos. Os valores representavam as médias ± DP de pelo menos três experiências independentes. * P . 0,05 como comparado com o controlo
Efeito do campferol na expressão de MMP-2 de células tratadas com SCC4 U0126
Para demonstrar se a supressão da MMP-2 expressão por caempferol ocorreu principalmente através da inibição da /2 via de sinalização ERK1, as células foram tratadas com SCC4 U0126, um inibidor da MEK. Os dados zimografia demonstrou que a actividade da enzima MMP-2 foi suprimida quando apenas o tratamento de campferol ou U0126 com 47% e 42%. No entanto, o tratamento com a combinação do inibidor com kaempferol intensamente reduzida actividade da enzima MMP-2 em 78% (Figura 6A). Além disso, resultados semelhantes foram obtidos a partir do ensaio de câmara de Boyden de invasão celular. A Figura 6B mostra que tanto kaempferol e invasão de células U0126 inibir, e tratamentos de combinação destes dois compostos químicos aumentar a actividade anti-invasão. Portanto, a inibição das vias de sinalização de ERK1 /2 pode resultar numa redução da expressão de MMP-2, e a migração de células de tumor reduzida.
SCC4 células foram pré-tratadas com U0126 (10 ou 20? M) durante 1 horas, e, em seguida, incubadas na presença ou ausência de campferol (60 uM) durante 24 horas. (A) Os meios de cultura foram utilizados como sujeitos para a análise da actividade de MMP-2, e as células foram usadas para o ensaio de invasão (B) como descrito na secção Materiais e Métodos. Os valores representavam as médias ± DP de pelo menos três experiências independentes. * P 0,05 em comparação com o controle
Discussão
O consumo de frutas e legumes que contêm flavonóides produz benefícios para a saúde vitais.. Kaempferol, um flavonóide, demonstra diversos efeitos biológicos e farmacológicos, como a atividade antioxidante e propriedades anti-câncer relacionados [23], [31], [34]. Nosso estudo utilizou SCC4 células carcinoma epidermóide de boca, e os nossos resultados indicam que kaempferol (1) inibe a migração e invasão de células SCC4; (2) reduz a expressão de genes e a actividade enzimática da MMP-2; (3) diminui a translocação nuclear de AP-1 ao promotor da MMP-2; e (4) inibe a fosforilação de ERK1 /2.
Vários estudos anteriores demonstraram que numerosos fitoquímicos utilizar capacidades anti-metástases através da supressão da actividade da enzima ou a expressão do gene de MMP-2 [35], [36] . éster fenetil ácido caféico inibe a metástase das células do câncer bucal, regulando as MMP-2 e MAPK caminhos [11]. Silibinin suprime osteossarcoma humano invasão celular MG-63 através da inibição da indução dependente de ERK de MMP-2 [37]. Wang et al observou que PAK5-EGR1-MMP-2 de sinalização controla a migração e invasão em células de câncer de mama [38]. Embora o TIMP-2 foi o inibidor fisiológico da MMP-2, os nossos dados indicam que o campferol reduz a MMP-2 e TIMP-2 mRNA e a expressão da proteína. Em estudos anteriores, a sobreexpressão de TIMP-2 reduziu a angiogénese e invasão, e células de melanoma protegidos de apoptose [39]. Bourboulia et ai. revelou que o TIMP-2 promove um perfil de transcrição anti-tumoral por cima de regulação de E-caderina nas células de cancro do pulmão [40]. No entanto, de Vicente et al. demonstraram que a expressão de TIMP-2 em carcinoma epidermóide oral foi correlacionada com o estadiamento TNM, recidiva local, e as taxas de sobrevivência menos favoráveis [41]. Os mesmos resultados foram incluídos no estudo realizado por Baker et ai. descobriu que os níveis médios mais elevados de TIMP-2 em tecido tumoral do que no tecido normal [42].
Estudos anteriores demonstraram exaustivamente o papel da via de MAPK na regulação da expressão MMPs [37], [43], [ ,,,0],44]. Shan et al. indicou que o estrogénio pode aumentar a expressão do VEGF, e activam a via de ERK1 /2 de induzir a expressão de MMP-2 [45]. Silibinin inibe a invasão das células cancerosas por via oral através da supressão da activação de ERK1 /2 e a expressão de MMP-2 [46]. Selaginella tamariscina (Beauv.), Uma planta medicinal tradicional, possui efeitos antimetastáticos em células de osteossarcoma humano, diminuindo a MMP-2 e MMP-9 secreções através de p38 e as vias de sinalização de Akt [47]. No entanto, nossos resultados do estudo mostraram que kaempferol só inibe a fosforilação ERK e sem efeitos significativos foram evidentes na JNK e p38 vias de sinalização. Com efeito, como se mostra nas Figuras 5-6, kaempferol inibiram a fosforilação de ERK1 /2, e o envolvimento da via de MAPK foi bem demonstrada usando o inibidor da MEK em células SCC4, mostrando, assim, que um tratamento utilizando U0126 poderia levar a um inibição de MMP-2 e a secreção de invasão celular SCC4.
a expressão do gene de MMP-2 é regulada pela interacção nível transcricional de AP-1 com sequências de ligação no promotor do gene MMP-2 [33], [48]. AP-1 não é um factor de transcrição única, mas um heterodímero que consiste das famílias c-jun e c-fos. Vários relatórios demonstraram que numerosos fármacos inibem a metástase do cancro, através da modulação das actividades de ligação de ADN de AP-1. Hong et ai. indicaram que ascochlorin inibe a expressão de MMP-9, suprimindo a actividade de AP-1 [49]. Nobiletin, um flavonóide citrino, atenuou a MMP-7 de expressão através da redução de AP-1 a actividade de ligação de ADN [50]. Os nossos dados actuais revelam que kaempferol diminuiu a actividade de MMP-2 de células SCC4 por inibir a activação de AP-1. Esta descoberta suporta relatórios anteriores que indicaram silibinin suprimida a invasão de células de osteosarcoma humano através da inibição da indução de AP-1 dependente de ERK de MMP-2 [37]. No entanto, observou-se que kaempferol deprime apenas a expressão de c-Jun no núcleo sem afetar c-Fos. Todos estes resultados sugerem que kaempferol inibe a migração celular e invasão SCC4 pela diminuição da actividade de ligação de MMP-2 promotora do gene de factores de transcrição AP-1, incluindo c-Jun.
Em resumo, os nossos resultados indicam que inibe kaempferol AP-1 actividade, reduz a expressão de MMP-2, e, subsequentemente, suprime a invasão de células SCC4. Além disso, demonstrou-se que inibe kaempferol ERK1 /2 fosforilação, que conduziu de MMP-2 a sub-regulação. Estes resultados sugerem que o kaempferol pode ser um candidato poderoso para o desenvolvimento de agentes utilizados para a prevenção de metástases de cancro.