Abstract

Em pacientes diabéticos complicados com câncer colorretal (CRC), o tratamento com metformina foi relatado para ter correlação diversificada, com mortalidade específica do CRC. Em estudos de laboratório, a metformina foi relatado para afectar a sobrevivência de células estaminais do cancro (CSCs) em cancros da mama e pancreáticas e glioblastoma. Embora cscs desempenhar um papel crítico na resistência ao 5-fluorouracilo (5-FU) de quimioterapia em pacientes com CCR, o efeito da metformina sobre cscs em pacientes de CRC e o efeito sinérgico de metformina em combinação com 5-FU em cscs não são relatados. No presente estudo exames patológicos foram realizados em 86 pacientes CRC complicadas com DM tipo 2 que foram divididos em um grupo de metformina e um grupo sem metformina. As comparações relativas tipo patológico, a incidência de metástases, a expressão de CD133 e β-catenina foram realizadas entre os dois grupos. Nós exploramos os efeitos sinérgicos de metformina em combinação com 5-FU sobre a proliferação, ciclo celular, apoptose e a proporção de CD133 + cscs de linhas celulares de cancro colorrectal humano SW620. Os resultados mostram que o tratamento com metformina tinham correlações reversas com a proporção de pacientes com adenocarcinoma pouco diferenciado, a proporção de CD133 cscs + em pacientes com CCR com DM tipo 2. Metformina aumentou os efeitos antiproliferativos de 5-FU sobre CD133 + cscs em células SW620. Estes resultados fornecem um complemento importante para o estudo anterior. A inibição da proliferação de CD133 cscs + pode ser um potencial mecanismo responsável pela associação do uso de metformina com a melhoria dos resultados de CRC em pacientes com CCR com diabetes tipo 2

Citation:. Zhang Y, Guan M, Zheng Z, Zhang Q , Gao F, Xue Y (2013) Efeitos da metformina sobre células CD133 + câncer colorretal em pacientes diabéticos. PLoS ONE 8 (11): e81264. doi: 10.1371 /journal.pone.0081264

editor: Chunming Liu, da Universidade de Kentucky, Estados Unidos da América

Recebido: 19 de julho de 2013; Aceito: 02 de outubro de 2013; Publicação: 21 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado por uma bolsa da província industrial da tecnologia de pesquisa edesenvolvimento Projects, não. (2010) 207 e do Fundo de Investigação de Guangdong Pharmaceutical Association for Medication do diabetes tipo 2, NO. 2012C07, Guangdong, China. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Gerenciamento de pacientes diabéticos complicado com câncer colorretal (CRC) é um grande desafio para os clínicos. Estudos epidemiológicos mostraram que a diabetes mellitus (DM) está intimamente relacionado com a incidência de cancros, especialmente malignidade gastrointestinal [1,2]. Uma meta-análise de 15 estudos envolvendo um total de mais de 2,5 milhões de pessoas, mostrou que o diabetes foi associado com um risco adicional de 30% do CRC [3]. Além disso, a diabetes é significativamente associada com o aumento geral e específico-CRC mortalidade [4,5], enquanto a metformina (cloridrato de biguanida 1,1-dimetil), o medicamento antidiabético oral mais prescrito para o DM tipo 2 [6,7], pode diminuiu o risco de câncer e mortalidade CRC-specific em pacientes diabéticos [8]. As evidências acumuladas sugerem que a metformina pode ser uma droga potencial para a quimioprevenção de CRC em pacientes diabéticos. No nosso estudo anterior, a metformina inibe o crescimento de células SW-480 foram incubadas com ou sem produtos finais de glicação avançada (AGEs) e regula negativamente a expressão de ciclina D1 e a actividade da telomerase [9,10]. Os efeitos anti-neoplásicos da metformina foram relatados para ser associada com a activação da proteína cinase activada por AMP (AMPK) via de sinalização, a melhoria da resistência à insulina e hiperinsulinemia [11,12].

Mais recentemente, uma outra vantagem da antineoplásico metformina foi relatado. Pode inibir a sobrevivência de células estaminais do cancro (CCC, células estaminais do tipo de iniciação do tumor: TISCs) em cancros da mama, cancros pancreáticos e glioblastoma e in vitro [13,14]. Como CSCs possuem o potencial para iniciar e sustentar o crescimento de tumores e metástases, que são responsáveis ​​pela resistência a quimioterapia e a recorrência de cancro, em que a via de sinalização /β-catenina Wnt podem estar envolvidos [15,16]. células CD133-positivas (CD133 +) separados da CRC exibem as propriedades de CSCs, como auto-renovação e de elevado potencial tumorigénico. No cancro da mama, CD133 foi classificado como um marcador útil para prever a eficácia da quimioterapia e da recorrência [17]. papéis similares de CD133 também foram identificados no CRC. A elevada proporção de células CD133 + foi altamente correlacionada com a sobrevivência pobre em geral (OS) em pacientes com CCR [18]. No entanto, não há nenhuma investigação sobre a correlação entre o tratamento com metformina e a proporção de CD133 + CSCs em pacientes com CCR.

O que é mais, não há nenhuma pesquisa, quer para a correlação entre o tratamento com metformina e o 5-fluorouracil (5-FU) a quimioterapia. Metformina tem sido relatado recentemente que têm um efeito sinérgico em combinação com alguma quimioterapia [19,20]. 5-FU, uma primeira linha de droga quimioterapêutica para pacientes de CRC, é normalmente utilizado em combinação com outros fármacos quimioterapêuticos para melhorar a eficácia terapêutica, uma vez que a resistência ao 5-FU são prováveis ​​de ocorrer em pacientes avançada CRC e muitas vezes leva à falha de quimioterapia [ ,,,0],21]. Por conseguinte, precisa de ser explorado se a metformina pode ser utilizada em combinação com 5-FU para aumentar o efeito anti-proliferativo de 5-FU no CRC. Considerando o importante papel dos CSCs na progressão tumoral a hipótese de que o papel positivo da metformina no CRC pode ser parcialmente contribuiu para o seu efeito anti-proliferativa em CSCs colorretal.

A fim de esclarecer como a metformina afeta a patogênese e progressão patológica da CRC com DM tipo 2, examinamos as associações de metformina com o tipo patológico e a incidência de metástase do CRC em pacientes diabéticos complicado com CRC eo efeito anti-proliferativo de metformina em CSCs colorrectais (CD133 +), bem. A fim de compreender como metformina sinergicamente com 5-FU para afecta o comportamento celular de CRC, foram examinados os efeitos sinérgicos da metformina sobre a expressão de células CD133 + em combinação com 5-FU in vitro.

Materiais e Métodos

Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Nanfang Hospital, Universidade de Southern Medical.

o comitê de ética do Hospital Nanfang dispensou a necessidade de consentimento dos pacientes já que as amostras foram adquiridos a partir de um banco de tecidos do departamento de patologia, Nanfang Hospital, Southern Medical University.

1.1.1 pacientes e desenho do estudo

Um total de 187 pacientes diabéticos tipo 2 foram submetidos a ressecção da CRC em Nanfang Hospital, Southern Medical University em Guangzhou, China entre janeiro de 2010 e junho de 2012. Os prontuários desses pacientes foram recuperadas para investigação epidemiológica das suas características demográficas e clínicas. A utilização de outras medicações diabéticos (sulfonilureias, tiazolidinedionas, inibidores de alfa-glucosidase, a insulina, e assim por diante) foi também investigado. A idade média foi de 64 anos de idade (variando de 29 a 87 anos de idade) e 119 (63,64%) dos pacientes estavam acima de 60 anos de idade. 88 (47,06%) dos pacientes tinham diagnóstico recente de DM tipo 2. A duração do DM menos de 5 anos e mais de 5yrs representaram 26,74% (50/187) e 22,99% (43/187), respectivamente. Os outros (6/187, 3,21%) não tinha nenhuma informação clara sobre a duração do DM. Finalmente, 86 pacientes com registros médicos completos foram incluídos neste estudo e foram divididos em dois grupos de acordo com o uso de metformina. No grupo metformina, havia 36 pacientes que tinham usado de forma consistente metformina antes do diagnóstico CRC e no grupo não-metformina havia 50 pacientes. espécimes patológicos de 37 pacientes que haviam sido submetidos a quimioterapia nem radioterapia nem antes da ressecção do CRC foram recuperados para exame imuno-histoquímico das expressões de CD133 e β-catenina.

Os dois grupos foram comparados em termos demográficos, características clínicas e achados laboratoriais. dados demográficos e as características clínicas incluíram idade no momento do diagnóstico, sexo, duração da diabetes, índice de massa corporal (IMC), /pressão arterial diastólica sistólica (PAS /PAD). Os achados laboratoriais foram glicose plasmática em jejum (FPG), hemoglobina A1c (HbA1c), nitrogênio urina no sangue (BUN), creatinina (CR), triglicerídeos (TG), colesterol total (T-Chol), lipoproteína de baixa densidade (LDL), muito lipoproteína de baixa densidade (VLDL) e o colesterol de lipoproteína de alta densidade (HDL), bem como as informações relativas ao diagnóstico CRC, incluindo histologia, diferenciação e metástases. A data do diagnóstico CRC foi definido como o dia do diagnóstico patológico definitiva.

1.1.2 imunohistoquímicos Exames

As amostras de tecido de cada paciente dos 37 pacientes foram fixados em formalina e embebidos em parafina. Em seguida, as secções de parafina foram desparafinadas antes, eles foram aquecidas durante 20 min a 105 ° C em tampão de recuperação de antigénios (Jinqiao Zhongshan Biotech, Pequim, China). Após bloqueio com soro de cabra a 10%, as lâminas foram incubadas com anticorpos monoclonais primários respectivamente contra CD133 (BIOS, China, diluição 1: 150) e β-catenina (Cell Signaling Technology, EUA, diluição 1: 200) durante a noite a 4 ° C seguido por peroxidase de rábano-anticorpos secundários marcados durante 1 h a temperatura ambiente. E, em seguida, as lâminas foram desenvolvidos com tetracloridrato diaminoben-Zidine (DAB) e contrastadas com hematoxilina.

1.1.3 imuno Avaliação

Para cada slide, pelo menos, 5 campos (dentro do tumor) e 500 células foram analisadas com alta potência (400 × ampliação) microscopia por dois patologistas. As amostras foram definidas como positivas para a expressão de CD133 se as células tumorais foram distintamente corados pelos anticorpos anti-CD133. Os resultados foram classificados em dois níveis: 10% e ≥10% células CD133-positiva.

As expressões de β-catenina na membrana celular e no citoplasma e os núcleos foram registados. A expressão 70% de β-catenina na membrana celular foi considerado normal, registados como negativa (-), enquanto que a expressão 10% de β-catenina no citoplasma e núcleo foi considerada anormal, registada como positiva (+ ).

1.2.1 linhas de células e condições de cultura de células

A linha celular de cancro colorrectal humano SW620 foram obtidas a partir de ATCC (EUA) e mantidas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de fetal de bovino soro (FBS; PPA, Áustria), em uma atmosfera humidificada com 5% de CO2 a 37 ° C. 5-FU e metformina foram adquiridos da Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA. Para avaliar os efeitos da metformina combinado com 5-FU, as células foram tratadas com ou sem metformina (5 mM) durante 24 h, e, em seguida, lavadas com PBS, depois tratadas por 5-FU (5μΜ) para outro 48h.

1.2.2 ensaios de proliferação celular

células SW620 foram semeadas em placas de 96 poços antes do tratamento com ou sem metformina seguido de 5-FU por 24, 48, e 72 h, respectivamente. A proliferação celular foi medida com o 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT; 5 mg /ml, Sigma, MO, EUA) ensaio. Após o tempo de tratamento apropriado, adicionou-se MTT a uma concentração final de 1 mg /ml, e a mistura de reacção foi incubada durante 3 horas a 37 ° C. Os cristais resultantes foram dissolvidos em HCl a 0,04% em isopropanol e a absorvância foi lida a 562 nm. Cada tratamento foi realizado em triplicado e cada experiência foi repetida duas vezes.

1.2.3 ensaios de ciclo celular

células SW620 foram pré-tratados com metformina durante 24 h ou não, e, em seguida, tratada com 5-FU durante 48 h. As células foram colhidas em fase de crescimento exponencial, e suspensões de célula única contendo células 1×106 foram fixadas com álcool a 70%. ciclo celular foi monitorizada utilizando coloração com iodeto de propídio (PI) dos núcleos. A fluorescência de PI ligado ao ADN em células foi medida com uma citometria de fluxo (BD Biosciences). Os resultados foram analisados ​​com o software ModFit 3.0 (Verity Software House, Topsham, ME). O experimento foi realizado três vezes. A proporção de células em G0 /G1, intra-S, e G2 /M fases foram expressos como média ± DP.

1.2.4 Avaliação da apoptose

A apoptose foi detectada por citometria de fluxo através de análise do plasma embalagem fosfolípido de membrana alteradas por corante lipofílico Anexina V. em resumo, as células tratadas foram recolhidas e lavadas duas vezes com PBS antes da re-suspensas a uma concentração de 1 × 106 células /ml em tampão de ligação de acordo com as instruções do fabricante (AnnexinV: FITC apoptosis Detection Kit, BD Pharmingen, CA, EUA). Em seguida, 5 mL de anexina V-FITC e 5 mL de iodeto de propídio (PI) foram adicionados a 100 ul de suspensão de células e incubaram-se durante 15 min à temperatura ambiente no escuro. Após a adição de 400 mL de tampão de ligação, células marcadas foram contadas dentro de 30 min de fluxo FACS Calibur citômetro (Becton-Dickinson, Mountain View, Califórnia). células de ocorrência precoce de apoptose apoptose das células necróticas /tardio (duplo positivo) (Anexina V-positiva, PI-negativas), bem como células vivas (duplo negativo) foram medidos antes de análise posterior por software celular Quest (Becton-Dickinson).

1.2.5 A detecção de células positivas CD133

Após SW620 células foram preparadas e tratadas como descrito, as células de tumor foram recolhidas e coradas com anticorpo anti-CD133 (IgG monoclonal de ratinho, 1: 10 , Milteny Biotec) ou anticorpo de controlo do isotipo IgG1 (Milteny Biotec) durante 30 minutos no escuro a 2-8 ° C. coloração CD133 foi analisada por citometria de fluxo (Becton Dickinson, San José, CA). As experiências foram realizadas em triplicado. A proporção de células CD133 + foi expressa como média ± SD.

1.3 estatística A análise

Os dados foram apresentados como a média + desvio padrão (SD) e analisados ​​utilizando software estatístico SPSS v.16.0 (Abbott Laboratories, North Chicago, IL). one-way análise de variância (ANOVA) e depois de Student não pareado

t

-test foram usadas para determinar os efeitos de diferentes variáveis. As associações entre as expressões de CD133 e β-catenina e os parâmetros clínico foram analisados ​​com o uso do qui-quadrado de Pearson (χ

2) e teste exato de Fisher.

P

valor menor que 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

2.1.1 dados demográficos e as características clínicas

A demografia dos doentes e características clínicas estão resumidos na Tabela 1. não houve diferenças significativas entre os grupos de metformina e não metformina quanto a idade no momento do diagnóstico, a pressão arterial, IMC, duração da diabetes, FPG, HbA1c, BUN, CR, ALB, TG, T-Chol, HDL , ou os níveis de VLDL na linha de base, mas o nível de LDL era significativamente menor no grupo tratado com metformina do que no grupo não-metformina (p = 0,024). Como para as características patológicas entre os dois grupos, a proporção de doentes com adenocarcinoma pouco diferenciado no grupo tratado com metformina foi significativamente menor do que no grupo não-metformina (2,78% vs 16,0%, p = 0,048). Além disso, a taxa de metástase distante no grupo tratado com metformina foi significativamente menor do que no grupo não-metformina (5,60% vs 21,6%, p = 0,035). No entanto, não foi observada diferença significativa entre os dois grupos na metástase em linfonodo (tabela 2).

Grupo metformina (n = 36)

grupo não-metformina (n = 50)

p

idade de diagnóstico (anos) 66,19 ± 9.8863.22 ± 9.940.725DM duração (anos) 4,99 ± 3.685.75 ± 4.700.334BMI (kg /m

2) 22,39 ± 3.4125.09 ± 3.450.894SBP ( mmHg) 144,72 ± ± 21.82137.66 19.230.199DBP (mmHg) 80,11 ± ± 17.720.306BUN 9.7277.98 (mmol /L) 6,92 ± ± 3.780.430CR 9.836.42 (mmol /L) 92,61 ± 69.2197.94 ± 108,490. 253ALB (g /L) 34,96 ± ± 5.760.063FBG 6.9333.71 (mmol /L) 8,63 ± ± 2.950.080HbA1c 2.099.27 (%) 6,78 ± ± 1.990.083TG 1.067.61 (mmol /l) 1,75 ± 1,282. 51 ± 3.070.132T-Chol (mmol /L) 4,44 ± ± 4.260.173HDL 0.835.42 (mmol /L) 1,25 ± ± 0.850.203LDL 0.251.27 (mmol /L) 2,27 ± ± 1.070.024VLDL 0.522.41 ( mmol /L) 0,88 ± 0.490.95 ± 0.540.741Table 1. Dados demográficos do paciente e características clínicas no início do estudo.

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grupo metformina (n = 36)

grupo não-metformina ( n = 50)

p

adenocarcinoma12 Patológica characteristicsWell diferenciado (33,33%) 13 (26,0%) adenocarcinoma21 0.460moderately diferenciado (58,33%) 22 (44,0%) adenocarcinoma1 0.190poorly diferenciado (2,78%) 8 (16,0%) adenocarcinoma2 0.048mucinous (5,56%), carcinoma01 células em anel 0.310signet 6 (12,0%) (2,0%), Metastasislymph node7 (19,44%) 14 (28,0%) 0.257distant2 (5,60%) 11 (21,6%) 0.035Table 2. características patológicas e metástase em dois grupos.

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2.1.2 expressões de CD133 e β-catenina em amostras de CRC

padrões de imuno-histoquímico das expressões CD133 e β-catenina foram analisados ​​em amostras de CRC . sinais acastanhados CD133 foram observadas na membrana celular, em especial no seu lúmen e a superfície basal. Em geral, a maior intensidade de coloração das células CD133 indica maior percentagem de células tumorais CD133 + (Figura 1, painel 1). No grupo tratado com metformina, 15 dos 19 espécimes de CRC (78,9%) continham menos do que 10% de células tumorais CD133-positivos, enquanto os outros 4 (21,1%) continham mais do que 10% de células tumorais CD133-positiva. Embora metade dos casos de CRC (18/09, 50,0%) no grupo não-metformina continha mais do que 10% de células tumorais CD133-positiva,

a diferença entre os dois grupos não alcançar um nível significativo

(

p = 0,065

). (Tabela 3)

(A): fracamente positivo ou positivo na coloração focal de 10% das células; (B): moderadamente ou fortemente positivas-coloração envolvendo 10% ou mais das células; (C) e (D): A coloração das células CD133 na superfície luminal e a superfície basal de células cancerosas. Painel 2: (A): expressão citoplasmática ou nuclear de β-catenina se encontra ausente; (B): expressão nuclear de β-catenina foi inferior a 10% das células cancerosas; (C) e (D):. Acumulação nuclear generalizado de β-catenina

expressão positiva

*

grupo metformina (n = 19)

grupo não-metformina (n = 18)

p-Value

CD1334 (21,1%) 9 (50,0%) 0.065β-catenin7 (36,8%) 13 (72,2%) 0.031Table 3. As expressões de CD133 e β-catenina em dois grupos.

* superior ou igual a 10% expressão de CD133 nas células foi registada como positiva; 10% de expressão β-catenina no citoplasma e núcleo foi registado como positivo. CSV Transferir CSV

Expressão de β-catenina foi claramente evidente nos limites de célula-célula e citoplasma em uma maioria de amostras de CRC, enquanto que em algumas das células foi observada acumulação nuclear da proteína β-catenina (Figura 1, painel dois ). Houve diferença significativa entre os dois grupos na taxa positiva de expressão da proteína β-catenina (p = 0,031). A taxa de acumulação nuclear de β-catenina em mais de 10% das células de tumor foi significativamente menor no grupo tratado com metformina do que no grupo não-metformina (19/07, 36,8% versus 13/18, 72,2%; p = 0,031) . (Tabela 3)

Há uma correlação significativamente positiva entre CD133 e expressão β-catenina (p = 0,028).

A expressão de CD133 está correlacionada com o tipo patológico de CRC, mas eles não chegaram a um nível significativo (p = 0,056

). Não existe uma correlação significativa entre β-catenina e do tipo patológico de CRC (p = 0,335).

2.2.1 Efeito antiproliferativo de 5-FU sozinho e em combinação com metformina em células SW620

In vitro, SW620, respectivamente, as células foram tratadas apenas com 5-FU e com uma combinação de 5-FU e metformina. A proliferação de células SW620 em ambos os grupos aumentaram com o tempo que se prolonga. Observou-se que o pré-tratamento com metformina seguido de 5-FU tratamento inibiu significativamente a proliferação das células SW620 como comparado com o tratamento de por si só 5-FU (1,019 ± 0,181 vs 1,218 ± 0,090, p = 0,058 para exposição 24 h; 1,075 ± 0,118 vs 1,644 ± 0,219, p = 0,001 para 48 h de exposição; 1,299 ± 0,147 vs 1,786 ± 0,109, p 0,001 para 72 h de exposição). (Figura 2A)

B: A proporção de células SW620, quer em G0 /G1 ou fase G2 /M não foi obviamente mudado entre os três grupos (p = 0,06 e p = 0,248, respectivamente), mas o tratamento prévio metformina reduziu significativamente a percentagem de células na fase S SW620 (24,14 ± 6,01 vs 39,62 ± 0,88, P = 0,003). **, P . 0,01 para comparações de tratamento com MET + 5-FU, respectivamente, com tratamento e de controlo 5-FU

2.2.2 Efeito sinérgico de metformina e 5-FU sobre o ciclo celular de SW620 células

para investigar o efeito da metformina combinado com 5-FU sobre o ciclo celular, que pré-tratado com células SW620 metformina durante 24 h antes do tratamento com 5-FU. Depois disso, as proporções de células SW620 em G0 /G1, S e G2 /M fases foram analisadas por citometria de fluxo. Observou-se que não havia nenhuma diferença significativa entre os três grupos, na proporção de células SW620 em G0 /G1 ou fase G2 /M (p 0,05), enquanto que o pré-tratamento com metformina reduziu significativamente a que na fase S, em comparação com o 5-FU tratamento sozinho (24,14 ± 6,01% vs 39,62 ± 0,88%, p = 0,003) (Figura 2B).

2.2.3 Efeito do tratamento com MET + 5-FU sobre a apoptose de células SW620

a percentagem de células apoptóticas foi significativamente aumentada por pré-tratamento com metformina seguido por tratamento com 5-FU, em comparação com 5-FU tratamento sozinho (taxa de apoptose precoce: 3,50 ± 0,44% vs 2,33 ± 0,38%, p = 0,029; taxa de apoptose tardia: 11,80 ± 4,15% vs 5,30 ± 2,10%, p 0,001) (Figura 3A).

*, P 0,05 e ***, P 0,001 para a comparação entre o grupo tratado com MET + 5-FU sozinho e o grupo 5-FU. B: A proporção de células CD133 + foi significativamente diminuído pela MET + 5-FU tratamento, em comparação com 5-FU sozinho tratamento (15,13 ± 3,43 vs 21,30 ± 1,40; p = 0,027). Os valores foram expressos como média ± DP.

2.2.4 Efeitos de Met + 5-FU no tratamento proporção de células CD133 +

A proporção de células CD133 + foi determinada por citometria de fluxo. 27,63 ± 2,58% das células SW620 expressa o antigénio de membrana CD133 e tanto o 5-FU sozinho e tratamentos com MET + 5-FU diminuiu significativamente a proporção de células CD133-positivos. Além disso, o pré-tratamento com metformina durante 24 h, seguida por 5-FU tratamento durante 48 h reforçado significativamente o efeito de inibição de 5-FU tratamento sozinho na proporção de positivos CD133 (15,13 ± 3,43 vs 21,30 ± 1,40; p = 0,027) (Figura 3B).

Discussão

Nos pacientes com CCR complicada com diabetes tipo 2, o presente estudo mostrou que a taxa de metástases à distância no grupo metformina foi significativamente menor do que no grupo não-metformina (5,60% vs 21,6%, p = 0,035) e a proporção de pacientes com adenocarcinoma fracamente diferenciado foi significativamente menor no grupo tratado com metformina do que no grupo não-metformina (2,78% vs 16,0%, p = 0,048). Estes resultados mostram um outro benefício da metformina em pacientes com CCR. Na última década, estudos epidemiológicos e grandes estudos, randomizados (RCT), como ADOTE (um resultado Diabetes Teste Progressão) e RECORD (Rosiglitazone avaliados para resultados cardiovasculares e regulamento da glicemia em Diabetes), sugeriram uma correlação inversa entre a metformina usar eo risco de câncer, especialmente o risco de câncer colorretal (CRC), em comparação com outros tratamentos anti-diabéticos [22,23]. O tratamento com metformina resultou em uma redução do risco de mortalidade global e mortalidade CRC-specific em pacientes com CCR com diabetes [24]. Um estudo prospectivo randomizado mostrou que o tratamento com metformina reduziu o número de rectal focos de criptas aberrantes (ACF), um marcador substituto endoscópico do CRC, em pacientes sem diabetes [25]. Em várias linhas celulares de cancro e em modelos animais, o tratamento com metformina exerce efeitos antiinvasive e antimetastasis [26-29]. No entanto, poucos estudos abordaram as correlações de tratamento com metformina com a metástase do câncer e com o tipo patológico de câncer em populações humanas. O presente estudo é uma tentativa preliminar de nosso para explorar estas questões. A força desta pesquisa é nossa observação patológica de um subgrupo de pacientes de CRC com diabetes tipo 2 concomitantes que estavam a receber tratamento com metformina. Encontramos evidência patológica sólida apoiar uma associação notável de metformina com melhores resultados em tais pacientes, o que desencadeou o nosso estudo mais aprofundado em alguns dos mecanismos subjacentes à associação.

No nosso estudo anterior, a proliferação de células SW480 foram significativamente inibida pelo tratamento com metformina na dose e um modo dependente do tempo o qual pode ser devido à regulação negativa da expressão da ciclina D1 e a actividade da telomerase por metformina [ ,,,0],9,10]. No presente estudo, mostramos que a metformina tem efeitos sinérgicos com 5-FU na proliferação e ciclo celular de células SW620. O inibidor do crescimento significativo e efeitos pró-apoptóticos da metformina sobre as células cancerosas, provavelmente devido à ativação de LKB1 /AMPK ea melhoria da resistência à insulina [19,20,30]. Além disso, Ras /Raf via /MAPK e metabolismo de glutamina redutiva também têm sido relatados para desempenhar um papel no efeito antineoplásico de metformina [19]. Mais recentemente, foi relatado metformina para afectar a sobrevivência de CSCs em várias linhas celulares de cancro [13,14]. CSCs foram identificados como alvos terapêuticos para a progressão tumoral [31], porque eles desempenham um papel importante na génese e a recorrência de tumores, metástases e a resistência à quimioterapia, como resultado de duas propriedades fundamentais: a capacidade de auto-renovação e diferenciação potencial entre populações heterogéneas ilimitadas de células cancerosas. Posteriormente, nós exploramos o efeito do tratamento com metformina sobre os CSCs colorretal em pacientes com CCR, usando seus espécimes patológicos. Nós, portanto, encontrou uma correlação inversa do tratamento com metformina com CD133 + CSCs em pacientes com CCR. CD133 foi acreditado ser o marcador de superfície mais robusta para os CSCs colorrectais. Os pacientes com expressão CD133 de alta parecia ter uma taxa muito menor de OS 5 anos e mais chances de T3, 4 invasão tumoral, positivo N e invasão vascular do que aqueles com expressão CD133 de baixa [32].

Depois de nossa descoberta da associação do tratamento com metformina com a proporção de CD133 + CSCs no CRC desses pacientes, investigamos ainda mais o efeito sinérgico de metformina e de tratamento de 5-FU na proporção de células CD133 + ea expressão de proteína β-catenina em células SW620. Nós revelou que a metformina em combinação com 5-FU diminuiu significativamente tanto a proporção de células CD133 + e a expressão da proteína β-catenina, indicando metformina pode ter um efeito antineoplásico sinérgico na CRC por inhibting a proliferação das CSCs através da via β-catenina. Um semelhante efeito antineoplásico de metformina tem sido relatada em cancro da mama [20]. Embora o 5-FU é o agente quimioterapêutico mais comum no tratamento da CRC, a resistência a este fármaco é muito comum em quimioterapia de pacientes de CRC. A activação da via Wnt /β-catenina em células CD133 (+) CSCs colorrectais podem ser responsáveis ​​pela resistência da quimioterapia em CRCs [15,16,33]. Recentemente, activadores de AMPK foram relatados para suprimir o crescimento de células de cancro do colo do útero através da inibição da via Wnt /β-catenina [34]. A inibição da via Wnt /β-catenina por AMPK pode ser responsável pelo efeito sinergético de metformina em combinação com 5-FU sobre a proliferação das CSCs colorrectais. É notório que encontramos o tratamento combinado de metformina e 5-FU teve um efeito significativamente melhor antineoplásica do que o tratamento da sozinhos 5-FU, sugerindo que o tratamento combinado pode ser um potencial de quimioterapia padrão para pacientes com CCR, especialmente para aqueles que estão resistentes a 5-FU altamente. Claro, outras pesquisas, ambos os ensaios clínicos e experimentos de laboratório, são necessários para verificar esta hipótese.

Em conclusão, nosso estudo confirma ainda mais que a metformina não é apenas um antidiabético, mas também um potencial medicamento anticancerígeno. Nossos resultados revelaram correlação inversa de tratamento com metformina com a incidência de metástases à distância e adenocarcinoma pouco diferenciado, a taxa positiva de CD133 e a expressão da proteína β-catenina em pacientes com CCR com DM tipo 2. Nós também demonstrar os efeitos sinérgicos de metformina em combinação com 5-FU, sobre a biologia de células e percentagem de células CD133 + in vitro. No entanto, o mecanismo de metformina interferir com a proliferação das CSCs permanece indeterminada. No futuro, ensaios clínicos randomizados prospectivos são necessários para investigar o efeito da metformina em combinação com 5-FU no prognóstico de pacientes com CCR e os mecanismos subjacentes deve ser mais explorado.

Reconhecimentos

Agradecemos a Prof. Yanqing Ding, o diretor do Departamento de Patologia e Hongfen Shen, um técnico do Instituto de Pesquisa do Câncer, Southern Medical University, Guangzhou, China. Reconhecemos também os votos comentários e revisões deste manuscrito por Prof. Ping Allen Liang.