Abstract

Os níveis de proteínas que controlam o ciclo celular são regulados pela degradação mediada por ubiquitina via o sistema ubiquitina-proteassoma (UPS) por ligases de ubiquitina E3 específicas de substrato. O inibidor da quinase dependente da ciclina, p27kip1 (p27), que bloqueia o ciclo celular em G1, é ubiquitylated pela E3 ligase SCF-Skp2 /Cks1 para a degradação pela UPS. Por sua vez, Skp2 e Cks1 são ubiquitylated pela ligase E3 complexo APC /CDH1 para a destruição mantendo assim os níveis abundantes de p27 nuclear. Nós já mostrou que a degradação perpétua proteossómica de p27 é um evento precoce na carcinogênese Tipo I endometrial (ECA), um estrogênio (E2) induzida por câncer. Os presentes estudos demonstram que E2 estimula o crescimento de linhas ECA celulares e células epiteliais endometriais primárias normais (EECS) e induz a fosforilação MAPK-ERK1 /2 dependente de p27 em Thr187, um pré-requisito para a ubiquitinação p27 pelo nuclear SCF-Skp2 /Cks1 e subsequente degradação. Além disso, E2 diminui a ligase E3 [APC] CDH1 deixando Skp2 e Cks1 intacta para causar degradação p27. Além disso, derrubando-down Skp2 impede E2 induzida por p27 degradação e estimulação do crescimento, sugerindo que a patogênese da ECA-induzida E2 é dependente de degradação Skp2 mediada por p27. Por outro lado, a progesterona (Pg) como um inibidor da proliferação do endométrio aumenta p27 nuclear e CDH1 em EECS primárias e células da ECA. Pg, também aumenta CDH1 ligação a APC para formar o E3ligase ativa. Bater-down CDH1 obvia estabilização induzida por Pg de p27 e inibição do crescimento. Notavelmente, nem E2 nem Pg afectada transcrição de CDH1, Skp2, Cks1 nem p27. Estes estudos fornecem novos insights sobre a regulação hormonal da proliferação celular através da UPS. Os dados implica que a prevenção da degradação da p27 nuclear, bloqueando a degradação Skp2 /Cks1 mediada por p27 ou aumentar CDH1 para mediar a degradação do Skp2-Cks1 são estratégias potenciais para a prevenção e tratamento da ECA

Citation:. Huang KT, Pavlides SC, Lecanda J, SV em branco, Mittal KR, ouro LI (2012) estrógeno e progesterona regular os níveis de p27KIP1 via da ubiquitina-proteassoma Sistema: implicações de patogenia e terapêuticas para o cancro Endometrial. PLoS ONE 7 (9): e46072. doi: 10.1371 /journal.pone.0046072

editor: Irina Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 12 de abril de 2012; Aceito: 27 de agosto de 2012; Publicado: September 27, 2012 |

Direitos de autor: © Huang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional do Câncer, R01 CA 89175 www.nih.gov (para LIG); e New York University (NYU) Cancer Institute Projeto Piloto Grant (para LIG). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o estrogênio (E2) estimula a proliferação do endométrio e progesterona (Pg) suprime a proliferação E2-driven. Em linha com os efeitos destas hormonas sobre o crescimento, E2 induz tipo I carcinoma do endométrio (CEA; taxa de: 85% de todos as ACE) e, inversamente, PG é usado como um agente terapêutico para a hiperplasia do endométrio, o precursor da ECA [1]. ECA é a neoplasia maligna ginecológica mais comum com uma incidência de 136.000 casos globais por ano [2]. Pelo menos 50% das mulheres com hiperplasia atípica endometrial (AEH) tem concorrente ECA; um adicional de 30% evoluirão para a ECA [3]. Como uma alternativa para a histerectomia, progestinas inverter AEH e bem diferenciadas ECA levando a uma alta taxa de gravidezes bem sucedidas [4], [5]. Uma compreensão nível molecular da regulação do crescimento normal e maligna do endométrio por E2 e Pg é importante para avançar no campo em termos de definir novos alvos moleculares preventivas e terapêuticas para esta doença. Nós relatado anteriormente que a quinase dependente da ciclina (CDK) inibidor, p27kip1 (p27) crítico para a paragem do crescimento, está ausente nas glândulas de ambos os tecidos AEH e ECA devido à rápida degradação e perpétua de p27 através do sistema ubiquitina proteassoma (UPS) implicando perda de p27 ocorre no início da oncogênese da ECA [6]. Alinhado com os efeitos opostos de E2 e Pg sobre a proliferação, que revelou ainda que E2 causado degradação proteossómica de p27 em EECS primários enquanto Pg aumentou acentuadamente p27 em ambas as células primárias endometriais epiteliais (EECS) e células do TCE. Estes dados sugerem que p27 é um alvo molecular significativo envolvido tanto na patogênese e tratamento da ECA.

Como um supressor tumoral e membro da família Cip /Kip de inibidores de CDK, a proliferação celular prisões p27 na fase G1 o ciclo celular por bloquear a actividade de ciclina /Cdk2 [7]. Ao contrário de outros supressores de tumores e reguladores negativos do ciclo celular, o gene p27

CDKN1B

, raramente é mutado em cancros humanos, mas em vez p27 níveis são altamente regulados por modificações pós-traducionais [7]. A concentração, localização subcelular, e fosforilação de aminoácidos específicos dentro da molécula de p27, em última análise regular o seu efeito na actividade de Cdk2 e, assim, a proliferação celular. p27 tradução e estabilidade da proteína são mais elevadas no G0 e G1 precoce quando p27 se liga e inibe a ciclina /Cdk2 para parada do ciclo celular. À medida que a célula progride através do ciclo G1, diminuições incrementais nos p27 aumentar a actividade de CylcinE CyclinA e ligado com Cdk2, que activam genes envolvidos na progressão da fase G1 para S e a iniciação da replicação de ADN [8]. A concentrações mais baixas, P27 é fosforilada em T187 [p-P27 (T187)] por ciclina /Cdk2, que retém p-P27 (T187) no núcleo, onde é ubiquitylated, que é necessário para a degradação por Skp2 /Cks1 do SCF

complexo ligase Skp2 E3 [7], [9]. A fosforilação de p27 sobre T187 requer a fosforilação da tirosina de p27 anterior em três locais no seu domínio inibidor Cdk2, que podem ser obtidos por cinases da família Src Abl ou [10]. Fosforilação de p27 em outros resíduos de aminoácidos por diferentes quinases determina a sua localização sub-celular [7], [11], [12], [13], [14]. Se p27 é degradada no núcleo ou sequestrado no citoplasma, paragem do ciclo celular não irá ocorrer a não ser que existem níveis suficientes de p27 nuclear para inibir Cdk2. É importante notar, no núcleo, é p27 supressora de tumor, mas no citoplasma, é oncogénica como TI medica migração /metástase [15], [16], [17]. Como em CEA, falta de p27 nuclear tem sido encontrada em numerosas doenças malignas epiteliais, [6], [7], [17], [18], [19] e tanto uma relação inversa entre os níveis de p27 nuclear (baixo) e Skp2 (alto) e fixação do p27 no citoplasma está associada à diminuição sobrevivência [7], [15], [20], [21]

o SCF (Skp1-Cul1-Skp2 /FBOX;. SCF -Skp2 /Cks1) e anaphase promover complexo (APC; APC /CDH1; APC /CDC20) são multi-subunidade complexos E3 ligase da UPS que causem degradação proteossómica de ciclina /Cdks e seus inibidores de CDK com timing preciso para sincronizar e regulam a progressão e paragem do ciclo celular de uma forma cíclica [22], [23]. poliubiquitina conjugação de substratos proteicos em lisinas é conseguido por três enzimas, que transfere /Activa (E1), (E2) conjugados e ligates (E3) ubiquitina à proteína para o reconhecimento e a degradação selectiva pelo proteassoma 26S [24]. A proteína F-box, Skp2, é o módulo de reconhecimento de substrato de SCF-Skp2 /Cks1. Interfaces Skp2 com a proteína acessória Cks1 formando um bolso que identifica p-P27 (T187) e ubiquitylates a molécula em lisinas 134, 153, 165 e [22], [23], [25]; Skp2 e Cks1 são a limitação de taxa para a degradação p27 [9]. No final G1-S quando o nível de SCF-Skp2 /Cks1 é mais alto, Skp2 e Cks1 tornam-se alvos de reconhecimento de substrato para APC /CDH1 E3 ligase degradação mediada por ubiquitina complexo [26]. Esta degradação do Skp2 e Cks1 resulta em acumulação nuclear de p27 de prisão G1 [7], [9], [27]. Tomados em conjunto, um aumento da APC /CDH1 indiretamente aumenta os níveis de p27 nuclear, causando degradação do Skp2 e Cks1 e esta diminuição na Skp2 /Cks1 aumenta diretamente níveis nucleares de p27. Além disso, os níveis de Skp2 nuclear e p27 estão inversamente correlacionados com a estimulação do crescimento e a inibição do crescimento no contexto de ser supressiva prooncogenic ou tumor, respectivamente.

Os presentes estudos mostram um novo mecanismo pelo qual os esteróides ovarianos regular o crescimento do endométrio, que é através da manipulação dos níveis de proteínas dos altos e não por transcrição. Especificamente, nós relatam que E2 causa fosforilação MAPK-ERK1 /2 dependente de p27 nuclear no T187 e diminui a APC E3 ligase /CDH1 deixando Skp2 /Cks1 intacta para ubiquitylate p27 nuclear para a degradação resultando em estimulação da proliferação de linhas de células EECS e TCE . Por outro lado, aumenta CDH1 Pg e a sua ligação para a APC; a ligase APC /CDH1 E3 causa degradação proteossómica de Skp2 e Cks1, deixando p27 intacta por inibição do crescimento. Propomos que p27 é um alvo molecular significativa no controlo do crescimento orientado a hormona do endométrio e que a prevenção da degradação da p27 por qualquer bloqueio Skp2 /Cks1 ou aumentar CDH1 são abordagens racionais para a intervenção terapêutica de AEH e ECA.

Resultados

o estrogênio e progesterona têm efeitos opostos sobre a proliferação celular e os níveis de p27, proteínas Skp2 e Cks1

em consonância com efeitos reguladores de crescimento hormonal sobre o endométrio, que anteriormente mostraram que os hormônios ovarianos, estrogénio (E2) e progesterona (Pg; na presença de E2 para aumentar os receptores de Pg [PR] para uma resposta fisiológica que imita o ciclo menstrual [6], [28], [29]) teve efeitos opostos sobre os níveis de p27 em EECS primárias tais que E2 diminuiu os níveis de p27 por meio da degradação mediada por ubiquitina e, inversamente, Pg induziu um aumento acentuado dos níveis de p27 em ambos EECS e células primárias de ECA [6]. Desde Skp2 e Cks1, como componentes do SCF

Skp2 E3 ligase causa degradação da p27 [7], [9], [23], propusemos que E2 e Pg seria semelhante inversamente afetar os níveis de Skp2 e Cks1 para a estimulação e a inibição da proliferação de células, respectivamente. Usando células ECC-1 que expressam tanto ER e PR, mostra-se que E2 induziu uma diminuição dependente dependente da dose e do tempo: p27 em 36% e 33% com as respostas de pico de 1 e níveis Skp2 e Cks1 10 nM, respectivamente, e inversamente afectadas com um aumento de 5,4 vezes e 3-vezes, respectivamente, com um pico de resposta de 100 nM de E2 (Figura 1A, B). A diminuição do p27 ocorreu tão cedo quanto 2 horas e foi mantida durante 24 h, enquanto que o aumento do Skp2 e Cks1 ocorreu mais tarde, atingindo um máximo de 24 h. A linha de células ER negativo KLE não respondeu ao E2, mas em vez disso, expressaram níveis elevados de Skp2 e Cks1 deixando pouco ou nenhum p27. O efeito oposto foi mostrado para o PG (mais E2), que induziu um aumento de 2,8 vezes na p27 em 100 nM e Pg um concomitante 84% e 75% de decréscimo de Skp2 e Cks1, respectivamente (Figura 1C). p27 aumentado incrementalmente 12-48 h, com um aumento de 3 vezes em 48 horas diminuiu para que duas vezes em 72 h enquanto que Skp2 Cks1 e diminuiu ao longo do tempo e eram quase ausente por 24 h (Figura 1D). É importante notar, que os tempos de exposição das transferências foram menos após a indução por PG em comparação com E2 uma vez que os níveis de p27 foram tão abundante e não poderiam ter sido quantificada em relação à actina. Assim, os níveis de p27 no tempo zero para as manchas mostrando diminuições, induzidas em p27 E2 foram consistentemente mais elevada e aqueles que mostra os aumentos induzidos por Pg foram consistentemente inferiores. Para estimar mais quantitativamente os efeitos de E2 e separadamente, Pg (mais E2) em p27 e estabilidade Skp2, células CCE-1 foram incubadas com ciclo-heximida (CHX) sozinho ou na presença de E2 ou PG. Como mostrado na Figura 1E, após 6 h em cultura, E2 diminuiu os níveis de p27 em 61% em comparação com 47% em CHX sozinho obtendo-se uma redução estimada da p27 uma meia-vida de 1,5 horas (6,2 H em função de 4,7 h, o tempo total de incubação = 18 h). Consistente com a degradação mais rápida de p27 induzida por E2, os níveis de proteína foram Skp2 aumentou 1,3 vezes neste ponto de tempo. Em contraste, Pg estabilizado P27 como o nível de proteína p27 foi aumentado em 1,5 vezes em 6 h enquanto os níveis de proteína Skp2 foram reduzidos em 45% em comparação com 24% em CHX sozinho originando e estimado diminuição na Skp2 meia-vida de 6,2 h (12,9 h contra 6.7 h tempo de incubação = 48 h).

Os detalhes estão em Materiais e Métodos e cada figura. A dose-resposta, E2: células ECC-1 e foram tratados com KLE E2 e p27, Skp2, e os níveis de proteína Cks1 determinado por imunotransferência. B, E2 decurso de tempo: As células CEC-1 foram tratadas com E2 durante os tempos indicados e os níveis de proteína determinado como anteriormente. C, Pg dose-resposta: células ECC-1 foram tratados com Pg /E2 e p27, Skp2 e os níveis de proteína Cks1 determinados como acima. D, Pg decurso de tempo: As células CEC-1 foram tratados com PG /E2 para os tempos indicados e os níveis de proteína, como acima. varrimentos densitométricos de todas as bandas de proteína são apresentados pelos gráficos à direita de cada blot. Cada banda foi normalizada para a actina e, em seguida, em comparação com 0 tempo ou de controlo não tratado. Os dados são expressos como intensidade relativa de cada banda ± desvio padrão. E, o tratamento com E2 /PG ciclo-heximida (CHX): células ECC-1 foram tratadas com E2 durante 18 h ou com E2 e Pg durante 48 h. CHX foi adicionado 6 horas antes da colheita final. As células foram colhidas em 0,1,2, e 6 pontos h de tempo. CHX sozinho era o controlo da linha de base. Os lisados ​​foram preparados e imunotransferidas para p27 e Skp2 e os teores de cada banda determinada por densitometria de proteínas (intensidade da banda). A alteração percentual em cada parâmetro de tratamento foi calculado com base no ponto de tempo zero para cada grupo. Proteína turn-over foi determinada por comparação das células tratadas com CHX isoladamente em comparação com CHX na presença de cada hormona, em cada ponto de tempo. Os gráficos de linhas representam a intensidade relativa de cada banda normalizados para a actina para cada grupo. F, G: E2 estimula e Pg inibe a proliferação: células ECC-1 foram tratadas com E2 ou pg /E2 e proliferação de células determinado por ensaio de MTS (Materiais e Métodos) * p 0,05. H, a distribuição do ciclo celular: células ECC-1 foram tratados com E2 ou E2 /Pg e análise do ciclo celular realizada como Materiais e Métodos descritos

De acordo com as concentrações máximas de efeitos E2 e PG no p27. , Skp2, e Cks1, a proliferação de células induzida E2 com respostas de pico de 26-20% em relação a controlos não tratados em 0.1 nM e 1 nM (Figura 1F), respectivamente, enquanto que inibiu a proliferação Pg com um pico de resposta de 27% a 100 nM, com (Figura 1G). Após a análise do ciclo celular, confirmou-se que as hormonas de afectar a proliferação celular tal como reflectido pelos seus efeitos sobre a distribuição do ciclo celular (Figura 1H). Depois de 18 h de tratamento com E2, o número de células ECC-1 em G1 diminuiu de 58% para 49% e o aumento em G2 e S de 14% para 15% e 29% a 36%, respectivamente. Após o tratamento Pg a 48 h, a fracção de células em G1 aumentou de 58% para 67% e diminuiu nos grupos G2 e S de 13% para 10% e 27% a 23%, respectivamente.

Estrogénio ERK induzida fosforilação dependente de p27 em Thr187

a fosforilação da p27 no T187 confere a conformação molecular para a sua ubiquitinação pelo SCF-Skp2 /Cks1 [22]. A figura 2A ilustra que o E2 induziu um aumento de 2,5 vezes e 2,3 vezes da fosforilação de p27 no T187 (p-p27 [T187]) a 1 nM e 10 nM de E2, respectivamente, em células ECC-1 (e em células HEC-1B; Figura S1A), com um pico de resposta de 11 vezes de p-P27 (T187) em 18 h após tratamento (Figura 2B) que foi MAPK-dependente (Figura S1B). Como mostrado aqui, isto é a dose idêntica pico de resposta e o tempo em que P27 é degradada por E2 (de acordo com as Figuras 1A e 1C) em células ECC-1. Em experiências iniciais, nem o proteassoma inibidor, lactacistina e o inibidor de fosfatase de serina /treonina, ácido ocadaico eram necessárias para manter a p27 no estado altamente p-P27 (T187) sugerindo que a velocidade de degradação proteossómica de p-P27 (T187) é mais lentas do que a fosforilação da T187. Mostramos ainda que ERK é activado por E2 a jusante de MEK1 (bloqueados pelo U0126) (Figura 2C). A partir destes dados, conclui-se que a fosforilação induzida por p27 de E2 no T187 são respostas de MAPK /ERK-dependentes e específicos do ER. Finalmente, siRNA knock-down de ERK1 e separadamente, ERK2 (82%, 70% de eficiência, respectivamente) diminuiu p-P27 (T187) nas células não tratadas de knockdown comparação com ARNsi de controlo (Figura 2D). Tal como mostrado em ambas as células transfectadas siRNA não transfectadas e de controlo, verifica-se que a ERK2 é mais altamente expresso de ERK1 (N.B. isto pode ser devido a uma maior especificidade do anticorpo para a ERK2 de ERK1). O blot mostra que derrubar ERK2 diminuiu a fosforilação de p27 a uma extensão maior do que a bater-se ERK1 (comparar os níveis de p-P27 (T187) em ERK1 e ERK2 knock-down para controlar siRNA). Devido à eficiência do knock-down e o maior expressão de ERK por estas células com e sem E2-indução, é difícil de quantificar a contribuição de ERK1 e ERK2 na fosforilação impulsionado-MAPK induzida por E2 de p27 no T187. No entanto, verifica-se que E2 activa tanto ERK1 e ERK2 para a fosforilação de p27 sobre T187 para reconhecimento por SCF-Skp2 /Cks1 (Figura 2D e a Figura S1B)

A, E2 dose-resposta: CEE-1. foram tratados com E2 e análise de imunotransferência realizada utilizando anticorpo de coelho anti-fosfo-p27 humano (p27-p [T187]), como descrito em Materiais e Métodos. Naturalmente, o tempo E2 B: células ECC-1 foram tratados com níveis de E2 e de proteína determinado por imunotransf erência como em A. C, E2, fosfo-ERK: células ECC-1 foram tratadas com E2 na presença de lisados ​​U0126 ou ICI e celulares imunotransferidas para p-P27 (T187), ERK fosfo (p-ERK), e ERK total, conforme descrito em Materiais e Métodos. D, E2, Análise de ERK1 e a activação de ERK2 após a sua knock-down com ARNsi: células ECC-1 foram transfectadas com ERK1, ERK2, ou ARNsi de controlo, tratados com E2 na presença ou ausência de ICI, seguido por fraccionamento de células, e imunotransferência para total e fosfo-ERK-1 (P-ERK1) e ERK2 (p-ERK2), tal como descrito em Materiais e Métodos.

Derrubando Skp2 aumento p27 nuclear e citoplasmática e bloqueado estrogénio degradação induzida de p27 [pelo SCF-Skp2 /Cks1] em ambos os compartimentos celulares

Nós claramente mostram que os níveis de Skp2 e Cks1 são aumentados, os níveis de p27 diminuem com a estimulação do crescimento em resposta a E2 (Figuras 1A, B, E). Como mostrado na Figura 3A, derrubar Skp2 (Skp2 siARN; eficiência de 80%) causou um aumento de 8,2 vezes na p27. A degradação de p27 pela Skp2 é relatado para ocorrer no núcleo [9], [30]. No entanto, verificou-se que E2 induzida por uma dobra de 2,5 e 1,9 vezes de aumento na Skp2 no núcleo e citoplasmáticos fracções, respectivamente, e uma diminuição de 50% em P27 em ambas as fracções (Figura 3B, painéis esquerdos). É importante notar, que demonstram que, após knockdown de Skp2, a degradação de p27 induzida por E2 foi bloqueada no citoplasma e no núcleo (Figura 3B, painéis à direita e Figura S2), que a estimulação da proliferação celular por E2 foi completamente evitada (Figura 3C), e que a diminuição induzida em E2 p27 era ER- e em ambas as fracções subcelulares (Figura 3B, painel esquerdo) dependente de proteassoma. Provavelmente, a diminuição no crescimento seguinte Skp2 knockdown é devido ao aumento dos níveis de p27 (como mostrado na Figura 3B, painel da direita). Estas experiências implicam Skp2 do SCF-Skp2 /Cks1 como um mediador directo da degradação induzida por E2 de p27

A, B, E2, Skp2 knockdown:. Células ECC-1 foram transientemente transfectadas com ARNsi de controlo ou Skp2 , tratadas com E2 sozinho ou na presença de 1 uM lactacistina (LAC) ou 10 nM ICI, submetido a fraccionamento celular, p27 e níveis Skp2 determinado por imunotransferência, como descrito em Materiais e Métodos. No painel A, a eficiência knock-down foi determinada comparando os lisados ​​celulares a partir Skp2 siRNA e ARNsi de controlo células tratadas por imunotransferência. p27 níveis relativos são representados pela análise densitométrica abaixo do blot. E2, a proliferação celular em células Skp2 knockdown: células ECC-1, transfectadas com ARNsi de controlo ou Skp2, foram tratadas com E2 ou não tratada e a proliferação determinada por ensaio de MTS, tal como descrito em Materiais e Métodos. Os dados são apresentados como uma média de duas experiências independentes. * P≤0.05

O estrogênio e progesterona têm efeitos opostos sobre os níveis de proteína CDH1 para regular, finalmente, o nível de proteína p27 nuclear.; Pg e E2 não afetam os níveis de mRNA de CDH1, Skp2, Cks1 ou p27

A ubiquitinação e degradação de Skp2 e Cks1 pela E3 ligase APC /CDH1 impediria a degradação da p27. Portanto, temos a hipótese de que os níveis [APC] CDH1 que variam diretamente com p27 e, portanto, ser regulamentada de forma oposta pelo E2 e Pg. Consistente com esta hipótese, enquanto o tratamento com E2 de células ECC-1 dependente do tempo diminuiu CDH1 com um efeito máximo de 56% aos 18 h (Figura 4A), Pg-tratamento aumentou CDH1 ao longo do tempo com o pico de resposta de 1,7 vezes a 48 h (Figura 4B). Em contraste não E2 nem Pg afectada transcrição de CDH1, p27, Skp2, ou Cks1 em pontos de tempo iniciais ao longo de 24 h (Figura 4C), e 12 h (Figura 4D), respectivamente, ao passo que a resposta de ARNm de genes comuns contendo elementos de resposta transcricional para ER e PR, ou seja, PR e glycodelin, respectivamente, é elevada (Figura 4D).

a, B, tempo de curso do E2 e Pg [mais E2] tratamento de células CEE-1. células ECC-1 foram tratadas com E2 e Pg mais E2, as experiências terminaram nos tempos indicados, lisados ​​preparados, e os níveis de proteína CDH1 determinado por imunotransferência, como descrito em Materiais e Métodos. C, os níveis de D, E2, PEN, o ARNm de p27, Skp2, Cks1 e CDH1: células ECC-1 foram tratadas com E2 ou pg /E2, o ARN total extraído nos tempos indicados, e quantitativo em tempo real de RT-PCR realizada, tudo em Materiais e Métodos. iniciadores PR e glycodelin foram utilizados como controlos para os genes alvo de ER e PR, respectivamente. Os dados são apresentados como uma média de duas experiências independentes.

A seguir ao tratamento de células E2- ECC-1 e subsequente fraccionamento subcelular, uma redução de 21% em CDH1 foi mostrado na fracção nuclear. Esta redução no nível de CDH1 foi revertida por lactacistina (Figura 5A), sugerindo que o E2 regula os níveis de degradação CDH1 por proteossoma. Curiosamente, o nível de Skp2 foi diminuída em 18% com o tratamento com E2 na presença de lactacistina, tanto no núcleo e no citoplasma e também, por si só lactacistina, mostrado aqui nos lisados ​​celulares totais (37%; inserção da Figura 5A). Este resultado é difícil de explicar e, embora lactacistina é amplamente utilizado para inibir a degradação do proteassoma, pode haver efeitos fora do alvo, como proteólise do Skp2 por diferentes vias de degradação

A, E2.; B, Pg, fracionamento celular e análise de CDH1, Skp2, Cks1, proteínas p27 e p-p27 (T187): As células foram ou não tratados, tratados com E2, E2, mais Lac ou tratados com Pg /E2 com ou sem 1 ^ M lactacistina ( Lac) ou RU486. As células foram fraccionados e as proteínas analisadas por imunotransferência, todos descritos em Materiais e Métodos. O

inserir em A

mostra que lactacistina diminui os níveis de proteína Skp2. C, Pg, CDH1 de ligação à APC: As células foram tratadas com PG /E2, os lisados ​​celulares imunoprecipitados com anticorpo anti-CDH1 seguido de imunotransf erência com anticorpos anti-Cdc27, como descrito em Materiais e Métodos. D, diagrama mostra APC /CDH1 como a ligase E3 upstream que ubiquitylates Skp2 /Cks1 (do complexo SCF), que é a ligase E3 jusante que ubiquitylates p27 para regular os níveis de proteína p27.

É de notar que, ao contrário Skp2, Cks1, e p27, CDH1 não está presente no citoplasma. Uma diminuição concomitante no p27 foi observada em ambas as fracções nucleares e citoplasmáticos de 30% e 61%, respectivamente, em comparação com controlos não tratados (basais de p27 foi maior no núcleo do que o citoplasma das células não tratadas). Consistente com a redução nuclear na p27, p-P27 (T187) foi aumentada para a identificação e ubiquitinação de p27 por Skp2 /Cks1 pela sua degradação. Além disso, lactacistina inibida a degradação de p27, tanto no núcleo e no citoplasma e aumento da p-P27 (T187) por 2,4 vezes apenas na fracção nuclear, confirmando que P27 é fosforilada em T187 no núcleo e, além disso, mantém-se e acumula-se no núcleo quando o seu degradação é inibida por lactacistina (mesmo que a Figura 3B, painéis esquerdos). Uma relação inversa antecipado entre p27 e os níveis de Skp2 foi mostrado a seguir E2-tratamento em ambos os frações nuclear e citoplasmática. Por outro lado, o tratamento de células Pg ECC-1 induziu um aumento de 1,65 vezes na tanto CDH1 e p27 no núcleo, enquanto esta hormona Skp2 diminuiu em 66% no citoplasma e ambos Skp2 Cks1 e em 62% na fracção nuclear; estas respostas eram específicos da PR (Figura 5B). Ao contrário do tratamento E2 em que ocorre a degradação de p27 ocorreu em ambos os compartimentos celulares, p27 foi largamente estabilizados no núcleo por PG (1,7 versus 1,1 vezes). É possível que Skp2 e Cks1 foram degradados através do UPS desde lactacistina e aumentou Skp2 Cks1 no núcleo e no citoplasma Cks1 bem. Considerando que mostram níveis CDH1 são aumentados de Pg, esta proteína tem de ser ligado ao complexo APC [num estado hipofosforilado] para exercer a sua actividade específica de ligase E3 [31], [33] [32]. Como mostrado na Figura 5C, Pg, de facto aumentaram a ligação de APC a CDH1 ostensivamente aumentar a sua actividade de ligase E3 para Skp2 e Cks1 e, assim, a sua degradação proteossoma. Tomados em conjunto, como mostrado na Figura 5D, os nossos resultados implicam CDH1 como o regulador a montante dos níveis de p27 através dos altos (ou seja, o SCF-Skp2 /Cks1) e o elo crítico para efectuar a regulação hormonal de crescimento.

derrubar acumulação blocos CDH1 Pg mediada por p27 nuclear e crescimento inibição

Figura 6A ilustra que derrubar CDH1 (

fzr

gene; 87% de eficiência) bloqueou completamente o Pg-induzida 1.6- dobrar aumento na p27 nuclear (Figura 6B, painéis da direita) e o efeito inibidor do crescimento de 30% (Figura 6C). Além disso, a proliferação foi parcialmente bloqueada nas células transfectadas não tratados e tratados CDH1 Pg de ARNip. Considerando que Pg causou uma diminuição na Skp2 nuclear e Cks1 (Figuras 5B, 6B), a falta de actividade de ligase E3 CDH1 nas células batida de deslocamento, expectavelmente aumenta os níveis basais de Skp2 nuclear e Cks1 (Figura 6B, painéis direitos). Além disso, Pg-tratamento diminuiu citoplasmática Skp2 tanto no controlo e ARNsi CDH1 ARNsi por 51% e 45%, respectivamente (Figura 6B, painéis esquerdos). Estes dados proporcionam forte suporte para um mecanismo pelo qual mediada pelo PR acção Pg aumenta p27 nuclear para a inibição da proliferação elevando CDH1 no núcleo, que por sua vez degrada Cks1 e Skp2, como evidenciado pelo seu aumento na presença de lactacistina e Pg [ ,,,0],mais E2] (Figura 5B)

a, Pg, CDH1 knockdown:. células ECC-1 foram transientemente transfectadas com ARNsi CDH1 seguido por separação citoplasma /núcleo, a eficiência e knockdown determinado em cada fracção por comparação de controlo e ARNsi CDH1 siARN transfectadas lisados ​​celulares. B, PG, CDH1 knock-down e fraccionamento subcelular: As células transfectadas foram tratadas com PG /E2 com ou sem RU486, submetido a fraccionamento celular, e análise de imunotransferência realizada em knock-down e controlar células de ARNsi para proteínas mostrados; todos descritos em Materiais e Métodos. varrimentos densitométricos (intensidade relativa) de cada banda de proteína que representam os níveis de resposta relativos à actina e comparadas com controlos não tratados são mostrados no gráfico seguinte. C, Pg, proliferação de células em células de knockdown CDH1: células transfectadas com ARNsi de controlo ou CDH1 foram tratados pg /E2 ou não tratada e proliferação analisados ​​por ensaio de MTS como descrito em Materiais e Métodos; * P . 0,05

O estrogênio e progesterona têm efeitos opostos sobre p27 e proteínas do sistema ubiquitina-proteassoma em células epiteliais endometriais primários

EECS de tecido endometrial renderam respostas idênticas para p27 , CDH1, Skp2 e Cks1 como mostrado pela linha celular ECC-1 após tratamento com E2 e Pg. Especificamente, E2 através do ER p27 diminuiu em 88% (Figura 6A) e CDH1 por 71% e aumentou Skp2 e Cks1 de 1,2 e 2,3 vezes, respectivamente. Em contraste, Pg-tratamento de EECS primárias aumentou p27 e CDH1 de 2,7 vezes e 1,8 vezes, respectivamente, ao passo que Skp2 Cks1 e foram ambos diminuiu em 69% (Figura 7B). O tratamento de células primárias com E2 estimulou o crescimento em 18% e 15%, enquanto que Pg (mais E2) inibiu o crescimento em 33% e 29%, que foi quase completamente bloqueada por RU486 (Figura 7C e 7D), tanto em pacientes. fraccionamento Nuclear-citoplasmática de EECS de um tecido endometrial normal, revelou que CDH1 estava presente apenas no núcleo e que E2 diminuiu CDH1 de 41%, diminuição do p27, principalmente no núcleo (50%), o aumento da Skp2 em ambas as fracções, mas principalmente na núcleo (1,3 vezes), e aumentou Cks1 em ambas as fracções, mas com mais no citoplasma (1,5 vezes; Figura 7E). Em contraste direto, Pg predominantemente aumento p27 nuclear em 2,6 vezes e CDH1 nuclear em 1,3 vezes, enquanto que Skp2 foi diminuída no núcleo e citoplasma por 41% e 89%, respectivamente. Pg Cks1 reduzida por 50% no núcleo e no citoplasma menos. Curiosamente, enquanto que CDH1 não foi encontrado no citoplasma na linha celular ECC-1 e EECS normais primário (n = 3), CDH1 foi detectada no citoplasma de células ECA primários (N = 3, graus II, III; A Figura 7F) , que foi reduzida em 44% nesta fracção subcelular ao mesmo tempo que foi aumentada no núcleo de 44%, após o tratamento Pg. O mesmo padrão foi mostrado para p27, que estava presente no citoplasma e o núcleo aumentou em 1,4 vezes em resposta ao PG. As respostas consistentes para E2 e Pg observada entre os quatro EECS primárias normais não só implicam que a consistência pode ser obtido apesar heterogeneidade paciente, mas sugerem que as respostas hormonais que observados nas linhas de células imortalizadas são susceptíveis fisiológico.

A, E2; B, tratamento Pg de EECS primárias EECS normais de fase proliferativa foram tratados quer com E2, sem ou com ICI ou tratados com PG /E2 com ou sem RU486, lisados ​​celulares preparados e imunotransferidas para os níveis de proteína mostrados como descrito em Materiais e Métodos. A e B são diferentes pacientes que mostram diferentes níveis basais de p27 e CDH1. C, D: E2, E2 mais tratamento Pg, a proliferação celular (por ensaio MTS): experiência paralela para o paciente # 2, como descrito em Materiais e Métodos; * P 0,05. E, E2, o tratamento Pg, fraccionamento subcelular: EECS primários da fase proliferativa foram tratadas com E2 ou pg /E2, submetido a fraccionamento subcelular, e análise de imunotransf erência para os níveis de proteína mostrados e realizados como descrito em Materiais e Métodos.