Abstract

Fundo

evasão imune é uma das marcas reconhecidas de câncer. As respostas inflamatórias ao câncer também pode contribuir diretamente para a oncogênese. Uma vez que o sistema imunitário é programado para proteger o hospedeiro, existe uma possibilidade de que os cancros, independentemente das suas origens histológicos, dotar-se com um padrão associado a um cancro inflamatório comum e partilhado molecular (iCAMP) para promover oncoinflammation. No entanto, a definição de iCAMP não foi conceitualmente e experimentalmente investigado

métodos e resultados

Genome-wide de dados de expressão de cDNA foi analisado para 221 normal e 324 amostras de cancro de tipos 7 câncer:. Mama , da próstata, do pulmão, do cólon, gástrico, oral e pancreático. Um total de 96 genes inflamatórios com desregulação consistente foram identificados, incluindo 44-regulada e 52 genes regulados negativamente. A expressão da proteína foi confirmada por imuno-histoquímica para alguns destes genes. O iCAMP contém proteínas, cujos papéis no cancro têm sido implicados e outros que ainda estão para ser apreciado. O significado clínico de muitos genes iCAMP foi confirmada em vários grupos independentes de cólon e pacientes com câncer ovariano. Em ambos os casos, melhor prognóstico fortemente correlacionada com alta

CXCL13

e baixo nível de

GREM1, LOX, TNFAIP6, CD36

, e

EDNRA

. Um “gene integrado inflamatória Pontuação” foi desenvolvido a partir da combinação de 18 genes iCAMP em cancro do ovário, que previam sobrevivência global. Visivelmente, como uma proteína seletivo nuclear importação, cuja função reguladora imuno-apenas começa a emergir, carioferina alpha 2 (KPNA2) é uniformemente sobre-regulada em todos os tipos de câncer. Pela primeira vez, o aumento da regulação específica do cancro da KPNA2 e seu significado clínico foram verificados por análise de microsséries de tecido no cólon e cabeça-pescoço cancros.

Conclusão

Este trabalho define uma doença inflamatória assinatura partilhada por sete tipos de cancro epiteliais e KPNA2 como uma proteína consistentemente sobre-regulada no cancro. Identificação de iCAMP não só pode servir como um biomarcador da novela para o prognóstico e tratamento individualizado do câncer, mas também têm implicações biológicas significativas

Citation:. Rachidi SM, Qin T, Sun S, Zheng WJ, Li Z (2013 ) Molecular Profiling de vários cancros humanos Define um padrão Cancro-Associated Molecular Inflammatory e revela KPNA2 como um Uniform mau prognóstico do cancro do marcador. PLoS ONE 8 (3): e57911. doi: 10.1371 /journal.pone.0057911

editor: Matthew L. Anderson, Baylor College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 22 Outubro, 2012; Aceito: 29 de janeiro de 2013; Publicação: 25 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Rachidi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi parcialmente apoiado por projectos-piloto de Institutos Nacionais de Saúde /Centro Nacional de investigação Recursos (NIH /NCRR) concede RR017696-05 P20 e P20 RR017677; Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (NIH /NIGMS) R01GM063265-09S1; PhRMA Research Foundation arranque Grant (para W.J.Z); T.Q. foi apoiado por PhRMA Research Foundation arranque Grant, NIH /NCRR 5P20RR017677-10, NIH /NIGMS R01GM063265-09S1 e T32GM074934 07. Z.L. é apoiada por doações do NIH. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a relação entre câncer e inflamação foi observado tão cedo quanto o 19

th século, quando Ronald Virchow descreveu leucócitos infiltrantes tumorais. No entanto, não foi até as duas últimas décadas que o microambiente inflamatório tem sido reconhecido como um componente chave na carcinogênese, estar envolvido na iniciação do câncer, promoção e metástase [1]. infecções crônicas são estabelecidos fatores etiológicos para muitos cancros humanos [2]. Do mesmo modo, a inflamação crónica tal como doença inflamatória do intestino e da hepatite crónica aumenta o risco de carcinomas colorrectais e hepatocelulares, respectivamente. Na maioria dos casos, imuno-vigilância é pensado para eliminar focos tumorigénico [3]. No entanto, as células iniciadoras de câncer de reprogramar células do sistema imunológico para criar um microambiente ideal para tumor, evitando assim a imunidade antitumoral. Além disso, o câncer pode educar os braços inata e adaptativa do sistema imunológico através de células supressoras derivadas mielóides [4], as células T reguladoras [5] e de outros mediadores, para promover o crescimento e invasão.

O papel de inflamação na carcinogénese começa com a iniciação do tumor, por meio de vários mecanismos, tais como o stress genotóxico através de espécies de oxigénio reactivas, a indução da citidina-desaminase induzida por activação (AID) [6], a entrada de TNF induzida por α de β-catenina para o núcleo [7 ] e outros. Além iniciação, citocinas activar factores de transcrição pró-tumorigénicas como STAT3 e NF-kB em células cancerosas existentes [8]. As células inflamatórias também amortecer a imunidade anti-tumor através de moléculas, tais como indoleamina-2,3-dioxigenase e arginase 1, que interferem com a função de linfócitos T [4]. transição epitelial-mesenquimal é também favorecido por citoquinas tais como TGF-β, promover metástases distal [9].

“onco-inflamação”, por conseguinte, contribui para as diferentes marcas de cancro, incluindo a proliferação celular, angiogénese e escapar apoptose . No entanto, apesar desta elaborada cross-talk entre células cancerosas e do microambiente inflamatório, a abordagem para descobrir jogadores críticos neste interação tem sido até agora esporádicas e não exaustiva. Neste estudo, a hipótese de que um padrão inflamatório comum existe entre os diferentes tipos de câncer, constituindo um perfil assinatura denominado como iCAMP. Foi realizada uma análise global da expressão gênica por 7 tipos de câncer epiteliais comuns. Um perfil oncoinflammatory robusta foi identificada, demonstrando valores preditivos independentes e fortes em resultados clínicos de vários tipos de câncer. Esta abordagem também levou à descoberta e validação de KPNA2 como o único e mais consistente sobre-regulada de proteínas no câncer.

Métodos

Declaração de Ética

O acesso a amostras de pacientes e análise anônima de dados foi aprovado pelo Conselho de revisão Institucional para Pesquisa com Seres Humanos da Universidade médica da Carolina do Sul.

os conjuntos de dados

Esta análise incluiu os perfis de expressão gênica de 7 tipos de câncer. Um conjunto de dados foi incluída para cada tipo de cancro, resultando em um total de 7 conjuntos de dados. Os cancros incluídos neste estudo são: mama, cólon, pulmão, oral, próstata, pâncreas e câncer gástrico [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16]. Conjuntos de dados foram obtidos a partir de Gene Expression Omnibus (GEO) conjuntos de dados, um banco de dados público NCBI. Cada um dos conjuntos de dados de microarray incluídos dados de expressão de ARNm de cancro e tecidos normais (Tabela S1). Todos os conjuntos de dados utilizados [HG-U133_Plus_2] Affymetrix Human Genome U133 mais 2,0 plataforma Array para quantificação dos níveis de expressão de genes.

análise CDEP em sete conjuntos de dados GEO

Os sete tipos de câncer epitelial foram investigados para identificar genes que mostram uma expressão diferencial consistente utilizando o método recentemente desenvolvido consistente padrão de expressão diferencial (CDEP) [17]. Os dados de microarranjos cru comparando a expressão do gene entre células normais e cancerosas foi descarregado a partir do banco de dados GEO do NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/) (Tabela S1). Após a exclusão de 10 amostras adenoma no conjunto de dados cólon, 545 amostras foram estudados, dos quais 324 eram de tecido de câncer e 221 foram normais. Os valores das amostras idênticas, no conjunto de dados de expressão de cancro pancreático foram em média. Os conjuntos de dados brutos foram pré-processados ​​individualmente. Para cada conjunto de dados, os valores de expressão gênica foram ajustadas e normalizada pela abordagem GCRMA implementado em R [18]. A taxa de falsa descoberta (FDR) de cada gene em cada conjunto de dados normalizado foi calculado usando o método de permutação implementado pelo pacote “RankProd” em R [19]. Cada gene em cada conjunto de dados foi, em seguida, associado com um FDR em bruto, por ser para cima /para baixo-regulado [17]. Para os genes não presentes na plataforma de um conjunto de dados, o valor médio do conjunto de dados FDR de que foi atribuído [17].

CDEP meta-análise foi em seguida aplicada aos FDRs em bruto dos sete conjuntos de dados. Para cada conjunto de dados, a taxa de falsos positivos é definida como a probabilidade de um gene não regulada-se ser falsamente chamado como sobre-expressos (ou um gene não-regulada negativamente sendo falsamente chamado como reprimidos). O número de genes a ser regulada para cima, para baixo-regulamentado, e não diferencialmente expressos para cada conjunto de dados foi estimado por um modelo de mistura Beta implementado em WinBUGS [20]. Com base nessa taxa e usando distribuições de Bernoulli independentes, calculamos a probabilidade de um gene a ser falsamente identificado como acima /abaixo-expressa entre os sete conjuntos de dados para cada limiar FDR

l.

O procedimento foi avaliada através da estimativa do taxa de falsa descoberta (FDR

g) observar a probabilidade log esperado anteriormente, ou seja, a proporção de falsos positivos entre os genes identificados a ser consistentemente diferencialmente expressos. A “probabilidade log nulo” foi calculado por permutando os valores relativos aos genes dentro de cada conjunto de dados, e, em seguida, realizando os mesmos procedimentos acima para calcular o valor esperado do “probabilidade log nulo” em cada permutação

b Compra de cada gene, utilizando como ponto de corte.

Banco de Dados para anotação, visualização e descoberta integrada (DAVID)

Depois de identificar os genes diferencialmente expressos entre os 7 tipos de câncer, o conjunto de up-regulada e genes regulados negativamente foi inserido no banco de dados DAVID (https://david.abcc.ncifcrf.gov/), e aqueles com anotações de genes relacionados com a inflamação e /ou resposta imune foram selecionados para análise posterior.

Humano proteína Atlas (HPAT)

Seis dos sete tipos de câncer e seu tecido normal correspondente foram investigados para o nível de expressão de proteína de todos os genes relacionados ao sistema imunológico por HPAT (www.proteinatlas.org).

Cancro Oncomine database

banco de dados Oncomine (www.oncomine.org) foi utilizado para identificar o significado clínico dos genes relacionados ao sistema imunológico e sua capacidade de prever a sobrevida do paciente e recorrência da doença. software X-tile [21] foi utilizada para determinar os pontos de corte ideais para a separação de baixo risco de pacientes de alto risco.

Score inflamatória Gene Integrado (IGIS)

IGIS para cada cancro do ovário paciente é o somatório do valor de risco de 18 genes iCAMP com significado prognóstico independente demonstrado pelo conjunto de dados de treinamento [22]. Esses genes são

CCL28, CXL12, EDNRRB, GFRA1, GREM1, IL8, JAM2, LOX, MAL, MIF, MPZL2, plgR, PTGER4, RSAD2, SERPINA5, TFF3, TNFAIP6 e TNFSF4

. O valor preditivo da IGIS foi testada usando um conjunto de dados de cancro do ovário TCGA independente, com base em valores de corte pré-determinadas pelo conjunto de dados de treinamento [22]. Para um determinado paciente, o valor de um gene que confere o mau prognóstico é o risco relativo (RR), ao passo que o valor de um gene cuja expressão em que prediz paciente melhor prognóstico foi definida como zero. Como um exemplo, se um paciente de uma cai no grupo de alto risco para os genes 1 e 2, mas no grupo de baixo risco para o gene 3, IGIS deste paciente será o somatório de risco relativo para o gene 1 e do risco relativo para o gene 2, desde o valor do gene 3 é zero.

Ingenuity Pathway Analysis (IPA)

Usando a ferramenta Ingenuity Pathway Analysis (www.ingenuity.com), genes inflamatórios foram mapeados em várias redes, cada uma exibindo sobre-expressos e os sub-expressas.

Tissue microarrays

Tissue microarrays (TMAs) para câncer de cólon e amostras de cancro da cabeça-pescoço contidas, embebidos em parafina tecidos fixados em formalina. O cancro do cólon TMAs foram desenvolvidos a partir de amostras de pacientes obtidos na Universidade de Medicina da Carolina do Sul (MUSC), Charleston, SC, EUA. Nosso estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board. A coorte de câncer de cólon consistiu em tumores de 55 pacientes e tecido normal adjacente de 50 deles, juntamente com amostras metastáticos 15 nódulos linfáticos. Cada uma das amostras normais e cancerosas foi, pelo menos, em duplicado. As informações clínicas e demográficas, incluindo idade, sexo, tipo histológico, grau, tumor (T) e dos linfonodos (N) estágios, global ea sobrevida livre de recidiva foram obtidos a partir do Registro de Câncer da Cancer Center Hollings na Universidade de Medicina da Carolina do Sul . O cancro da cabeça-pescoço TMA foi obtido a partir de US Biomax, que continha carcinomas de células escamosas 60 cabeça-pescoço e amostras normais a partir de 9 pacientes independentes.

imuno-histoquímica (IHQ)

secções de 5 um foram cortadas a partir dos blocos de TMA. KPNA2 coloração foi realizada utilizando um anticorpo policlonal de coelho específico para KPNA2 humana (Abcam, Cat # 84440) em 1:500 diluição. As lâminas foram cozidos durante 1 hora a 60 ° C e de-parafinado. Após a recuperação de antigénios, utilizando tampão de citrato (pH = 6,0), peroxidase endógena foi extinta utilizando 3% H

2O

2 em dH

2O durante 5 minutos e a ligação não específica foi bloqueada por soro de cabra normal a 2% durante 3 horas à temperatura ambiente. As amostras foram incubadas com anticorpo anti-KPNA2 a 4 ° C durante 16 horas, seguido pelo anticorpo secundário (Vectastain ABC Kit, PK-4001) e desenvolvimento utilizando substrato DAB (Vector Labs SK-4100). Coloração mostrou especificidade absoluta para o núcleo, sem sinal de fora do alvo discernível. KPNA2 quantificação foi realizada por um patologista cirúrgico (S.S.) que desconhecia os parâmetros clínicos do paciente. Quantificação incluídos intensidade nuclear coloração (1: fraco; 2: moderado; 3: forte, mas menos intensa do que 4, e 4: intensa). E percentual de núcleos positivos sobre todas as células tumorais em um núcleo TMA

Resultados

fluxo de trabalho Data-mining e identificação de genes consistentemente diferencialmente expressos em sete tipos de câncer humano

Os dados brutos de 7 conjuntos de dados (Tabela S1) foi obtido pela primeira vez a partir de Gene Expression Omnibus (GEO). Cada conjunto de dados corresponde a um tipo de cancro: mama, cólon, pulmão, oral, pancreático, da próstata e cancros gástricos. Estes conjuntos de dados de perfis incluem microarranjos de expressão a partir de tecidos de cancro e tecidos normais correspondentes. Depois de determinar genes desregulados em cada tipo de câncer, a metodologia consistente Diferencial padrão de expressão (CDEP) foi implementado para identificar genes diferencialmente expressos nos sete conjuntos de dados. 911 genes foram regulados positivamente e 618 genes foram regulados negativamente. Usando DAVID, estes genes foram então funcionalmente classificadas e os genes relacionados ao sistema imunológico foram identificados (Figura S2, Tabela S2). Para melhorar ainda mais a relação sinal-ruído, os genes que mostraram uma mudança de dobragem (FC) 2 em cinco ou mais tipos de cancro foram excluídos. Isto resultou em um perfil inflamatória robusta, denominado iCAMP, 44 de sobre-regulada e 52 genes ao nível do ARNm regulada para baixo (Figura 1). A expressão da proteína de iCAMP foi verificada por meio de IHC em 6 tipos de câncer: de mama, cólon, pulmão, pâncreas, próstata e gástricas pela mineração do Atlas proteína humana (Tabela S3, Figura S5). O significado clínico iCAMP foi determinada utilizando banco de dados Oncomine. Finalmente, a ferramenta Ingenuity Pathway Analysis foi usado para identificar a função de iCAMP na inflamação associada ao câncer.

mapa de calor mostrando a 44 up-regulada e 52 genes regulados negativamente em todo os sete tipos de câncer, além de a direção de desregulação no câncer de ovário. ↑,-regulada. ↓, para baixo-regulado. ↔, inalterado.

Identificação de genes relacionados ao sistema imunológico

Entre os genes regulados positivamente em iCAMP, aqueles que estão envolvidos na regulação positiva da apoptose de linfócitos foram significativamente enriquecida por 11,2 dobras. Pequenas quimiocinas da família CXC, tais como

CXCL9

,

CXCL10

e

CXCL11

foram enriquecidos com 9,5 dobras (Figura S2A). Além disso, os tumores foram também enriquecida com genes em outras categorias imunológicas, tais como a interação vírus-hospedeiro e resposta ao ferimento (Figura S2A). genes regulados negativamente foram altamente enriquecidas em componentes do complemento da via alternativa (9.9 dobras), genes de células T associado, tal como CD8a, granzima A e Mal, proteínas T de diferenciação de células (7,3 dobras) e genes envolvidos na regulação da função das células NK tais como subfamília receptor lectina-like K, membro 1 (

KLRK1

) (Figura S2B).

As funções de muitos genes iCAMP estão ainda a ser compreendido. Por exemplo, foi mostrado KPNA2 ser regulada para cima através de um largo espectro de tipos de cancro (Figura 1) [23], [24], [25], [26], [27]. É claro, no entanto, se a actividade promotora de tumor possível de KPNA2 é devido à sua função como um transportador nuclear de proteínas imuno-reguladores selectivos, tais como STAT1 [28] e o factor de transcrição induzido por interferão-γ IRF-1 [29].

a expressão de iCAMP ao nível da proteína

Para examinar o padrão dos genes iCAMP expressão da proteína, aproveitamos o banco de dados de expressão de proteína disponível publicamente, HPAT. Genes que não apresentaram expressão diferencial por IHC não foram excluídos devido à sensibilidade limitada deste método. Usando IHC como uma etapa de filtragem iria expandir as observações negativas falsas, limitando o poder deste estudo. No entanto, ele foi informativo definir quais genes mostrou alterações de proteínas em tipos que cancro como isso tem implicações diretas sobre a escolha de genes para análises funcionais adicionais. Por exemplo, KPNA2 foi encontrado para ser aumentada em todos os tipos de cancro, com excepção do cancro do pâncreas (Figura 2). Por outro lado, o receptor de imunoglobulina polimérica (plgR), uma proteína envolvida no transporte trans-epitelial de imunoglobulinas, é consistentemente sub-regulada em células de cancro (Figura 2). No total, os dados de expressão de proteína está disponível para 34 regulada para cima e para baixo 38 genes regulados (total = 72) dos 96 genes (Tabela S3, S5 Figura). Dos 34 genes up-regulada a nível mRNA, 13 foram também up-regulada por IHC em pelo menos 3 dos 6 tipos de câncer estudados. Como para a transcrição regulada de genes (38 foram examinados quanto à expressão de proteínas), 20 mostrou a sub-regulação por IHQ em ≥3 dos mesmos 6 tipos de cancro.

Um exemplo de um gene sobre-regulada (KPNA2 ) (a) e um gene regulada para baixo (plgR) (B) em 5 tipos de cancro sobre o nível de proteína. Números correspondem a variações médias vezes nos níveis de mRNA em todos os 7 tipos de câncer no estudo atual.

O significado clínico dos genes iCAMP

A seguir, escolhi usar o cancro do ovário para estudar a significância de genes iCAMP com base em duas considerações. Primeiro, a maioria das malignidades dos ovários são de origem epitelial que é histologicamente semelhante para os sete tipos de cancro a partir do qual o perfil foi gene definidos. Em segundo lugar, o cancro do ovário não foi utilizado para gerar os genes iCAMP. O valor preditivo destes genes em cancro do ovário iria validar a utilidade da nossa abordagem descoberta do gene. Como um controlo, os valores preditivos clínicos destes genes foram também examinados no cancro do cólon. Para determinar a direção da desregulação de cada gene no câncer de ovário, nós extraído 5 conjuntos de dados publicados [30], [31], [32], [33], [34] e um conjunto de dados adicionais a partir do Cancer Genome Atlas (TCGA) ( S4 tabela), que contêm coletivamente 35 normais e 878 amostras de câncer. Com base no número de conjuntos de dados mostrando desregulação em cada sentido, cada gene foi identificado como elevada, inalteradas ou reprimida em cancro do ovário (Figura 1). Um gene é determinada a ser elevada se 1) pelo menos um conjunto de dados mostra-se-regulação (p 0,05) e nenhum dos outros conjuntos de dados mostra a infra-regulação, ou 2) pelo menos 3 conjuntos de dados mostrar-se-regulação e não mais do que um conjunto de dados mostra a regulação negativa (p 0,05). O inverso aplica-se a genes reprimidos. Com base em que, 33 dos 44 genes sobre-regulada também foram elevados em cancro do ovário, 3 e 8 foram reprimidos não pôde ser determinada. Entre os 52 genes regulados negativamente, 28 também foram reprimidos em cancro do ovário, sete permaneceram inalterados, 10 foram elevados e 7 foram indeterminada (Figura 1). Assim, pelo menos 61 dos 96 genes iCAMP foram concordante desregulado no cancro do ovário.

Colon [35], [36], [37] e conjuntos de dados de câncer de ovário [22], [30], [38] , [39], [40] a partir Oncomine, bem como TCGA conjunto de dados do cancro do cólon, foram então analisados ​​para significado clínico dos níveis de expressão do gene iCAMP indivíduo. Um certo número de genes tais como

CCL20

,

CD36 Comprar e

IL18RAP

mostrou individualmente correlações significativas com as variáveis ​​clínicas em câncer de cólon tais como o estágio do tumor (T1 a T4), linfa status do nó (N0 com N2), metástases (M0 ou M1), grau patológico (G1 a G4) e Duke fase (a a D) (figuras 3A e 3B). No câncer de ovário, todos os genes regulados positivamente foram aumentadas com o estágio mais avançado (

CXCL10

,

RIPK2

e

SPP1

) ou superior grau patológico (

CXCL11

,

KPNA2

,

RSAD2

,

THOC4

e

TNC

) (Figura 4A). Quanto aos genes iCAMP regulada para baixo, estágios mais avançados conferido maior expressão de alguns genes (

CCL28

e

CFD

) e menor expressão de outros (

CLU

,

LEAP2

,

plgR

e

TFF3) (Figura 4B).

Quatro estudos independentes foram analisadas para a expressão de genes indicados e seu significado clínico. O eixo vertical representa a intensidade de expressão de cada gene normalizada em relação à intensidade média das sondas de gene inteiro. As barras de erro representam o desvio padrão. Genes são listados em ordem alfabética.

O mesmo que na Figura 3, com excepção foram analisados ​​que cinco estudos independentes de câncer de ovário para a expressão de genes indicados e seu valor clínico.

a seguir, determinou se iCAMP nível de expressão do gene prediz a sobrevivência, com base em dados de microarranjos brutos para o cancro do cólon [37] e do ovário [22]. Os genes que mostraram diferentes níveis de expressão entre os sobreviventes e não sobreviventes em um, três e /ou cinco anos foram testados por análise de Kaplan-Meier (Figura 5 e 6). No cancro do cólon, melhor sobrevida global foi previsto com níveis mais elevados de GFRA1 e THOC4, e níveis mais baixos de C7, GREM1, ISG15, LIFR, LOX, MMRN1, SCN4B, SPP1, TNC, TNFAIP6 e ZC3H8 (Figura 5A). A expressão desregulada de muitos genes iCAMP também tem valor preditivo significativo para a recorrência do câncer (Figura 5B).

Dois conjuntos de dados de Smith

et al.

[37] foram examinados para os genes indicados. Alto, pacientes com alta expressão de gene. Baixos, pacientes com baixa expressão do gene. RR, o risco relativo. Genes são listados em ordem alfabética. Vermelho: gene iCAMP Cima, Azul:.. Gene iCAMP reprimida

Os dados de expressão gênica bruto foi obtido a partir Tothill

et al

[22] para (A) e (B), e de TCGA para (C). Vermelho: elevada no cancro do ovário, Azul: Reprimida no cancro do ovário, Preto: Inalterado ou desconhecida. pontuação IGIS foi calculado com base em todos os 18 genes indicados em (A).

No estágio do câncer de ovário IIIC, melhorou a sobrevida global foi associada com maiores níveis de mRNA de IL8, MIF, MPZL2, plgR, RSAD2 , SERPINA5 e TFF3, mas níveis mais baixos de CCL28, CXCL12, EDNRB, GFRA1, GREM1, JAM2, LOX, MAL, PTGER4, TNFAIP6 e TNFSF4 (Figura 6A). O dysegulation de muitos destes genes também prevê sobrevida livre de recidiva (Figura 6B).

Curiosamente, menor expressão de um número de genes (GREM1, LOX, TNFAIP6, CD36, e EDNRA) previu melhor prognóstico em ambos ovário e cólon. Por outro lado, CXCL13 elevação previu melhor prognóstico em ambas as doenças (Figuras 5 e 6).

Para determinar o valor prognóstico de genes iCAMP como um grupo, uma pontuação integrada gene inflamatória (IGIS) foi elaborado para ovário cancro (Figuras 6C). IGIS incluiu 18 genes que mostraram, independentemente, previsibilidade significativa (p 0,05) por análise de Kaplan-Meier. Esta pontuação leva em consideração o número de genes no interior do qual o doente cai no grupo de alto risco, bem como o risco de cada um destes genes confere. A robustez do IGIS foi validado usando o cancro do ovário TCGA conjunto de dados independente. Com base em valores de corte pré-determinada a partir do conjunto de dados formação inicial acima [22], os pacientes estágio IIIC do conjunto de dados TCGA foram classificados como alto ou baixo risco para cada gene. Em seguida, para cada gene em que um paciente TCGA mostra mau prognóstico, o risco relativo (RR pré-determinado pelo conjunto de dados de treinamento) desse gene foi adicionada à pontuação pacientes IGIS. Os pacientes TCGA, eventualmente, foram distribuídos com diferentes pontuações IGIS com base nos níveis de todos os 18 genes IGIS expressão. Descobrimos que IGIS fato previu a sobrevida global (RR = 1,21, p = 0,02) (Figuras 6C).

significado clínico KPNA2 no adenocarcinoma de cólon e cabeça-pescoço carcinomas de células escamosas

A seguir, focada em KPNA2 em adenocarcinoma do cólon e cabeça /pescoço carcinoma de células escamosas, uma vez que a sobre-expressão KPNA2 não foi reportado nestes dois tipos de cancro. KPNA2 é uma proteína nuclear /citoplasmático envolvidos na importação de proteínas citoplasmáticas selecionados para o núcleo. Ele liga-se a sequência de localização nuclear (NLS) de carga e a sua proteína de carioferina β1, e todo o complexo transloca-proteína através do envelope nuclear por meio do complexo do poro nuclear (NPC) [41]. Entre os clientes KPNA2 é o factor de transcrição induzido por interferão-γ IRF-1 [29] e STAT1 [28], sendo que ambos estão envolvidos na resposta imune do hospedeiro.

Foi examinada a expressão KPNA2 com immunohistrochemistry usando o nosso em microarray de tumores -house que contém 55 amostras de cólon primário de cancro, metástases nos nódulos linfáticos 15 e 50 correspondentes tecidos normais adjacentes a partir de pacientes de vários estádios da doença. Encontrámos um aumento drástico na expressão KPNA2 no nó de tumores de cólon primários e metastáticos linfáticos em comparação com tecidos normais adjacentes (Figuras 7A, 7B e 7C). KPNA2 expressão também se correlacionou com a fase do tumor (T), em que a percentagem de células positivas aumentou de T1 a T4 (T1: 6,4%, T2: 10%, T3: 20,6% e T4: 25,4%) (Figura 7D). Dado que a maioria dos pacientes estavam na T2 (n = 11) e T3 (n = 31) categorias, encontramos diferença significativa na expressão KPNA2 entre T2 e T3 (p = 0,017). A diferença também foi significativa entre T1-T2 combinados e estágios T3-T4 (p = 0,003) (Figura 7D). Mais importante ainda, pacientes com escore de intensidade KPNA2 ≥3 exibido sobrevida global pior do que aqueles com intensidade KPNA2 ≤2 (risco relativo = 1,9, p = 0,048) (Figura 7E).

A. Imagens representativas da coloração imuno-histoquímica KPNA2 de tecidos normais e malignos cólon. B. Quantificação de KPNA2 intensidade da coloração nos tecidos normais (N, n = 50), tumor primário (T, n = 55) e nó de linfa de metástase (LN Ca, n = 15). * P 0,0001. C. Frequência de células positivas KPNA2. * P 0,0001. D. A percentagem de células positivas KPNA2-se correlaciona com o estágio T. * P 0,05. curva E. Kaplan-Meier mostrando a sobrevivência global dos doentes com cancro do cólon com diferentes expressão KPNA2.

Similar ao cancro do cólon, carcinoma epidermóide de boca e laringe apresentaram níveis elevados de KPNA2 comparação com boca independente e laringe tecidos normais (Figura 8A, 8B e 8C). Embora KPNA2 não mostrou correlação com o estágio da doença, foi maior em cada um de grau 2 (células positivas 39,2%) e grau (células positivas 49%) 3 carcinomas comparação com grau 1 (26,3%). (P (G1 versus G2) = 0,03 e p (G1 vs G3) = 0,002) (Figura 8D).

A. Imagens representativas da coloração imuno-histoquímica KPNA2 de tecidos normais e malignos da língua. B. KPNA2 intensidade de coloração no tumor primário e de tecido normal adjacente * p 0,0001. C. frequência de células positivas em KPNA2 tumor primário e de tecido normal adjacente (2%). * P 0,0001. D. correlação entre a expressão KPNA2 e grau do tumor. * P . 0,05

TNFAIP6 é sobre-expresso em adenocarcinoma do cólon

de proteína induzida pelo factor de necrose tumoral alfa 6 (TNFAIP6) é uma glicoproteína segregada, expressa por células epiteliais e leucócitos nas condições normais e condições inflamatórias. Sua função anti-inflamatória é bem estabelecido em diferentes condições inflamatórias, tais como a osteoartrite, e é detectável em amostras de soro de pacientes com doenças auto-imunes [42]. Recentemente, perfis de transcrição de sangue de pacientes colorectais e controlos normais por qRT-PCR identificou TNFAIP6 como um biomarcador para o cancro colorrectal [43]. Este estudo mostra que TNFAIP6 mRNA é elevada em células de sangue periférico de pacientes com cancro colo-rectal. Aqui, nós investigamos os níveis de proteína de TNFAIP6 em células de câncer de cólon e epitélio normal adjacente. a coloração imuno-histoquímica de 55 espécimes de cancro do cólon e 50 tecidos normais adjacentes revelou uma expressão aumentada no cancro numa base por célula, bem como um aumento na frequência de células que expressam TNFAIP6 (Figuras 9A, B e C). Os níveis de proteína TNFAIP6 não prever a sobrevida global do paciente (dados não mostrados). Quanto a recorrência da doença, encontramos uma tendência de pior sobrevida livre de recorrência em pacientes altamente expressando (Figura 9D), sem alcançar significância estatística (RR = 2,44, p = 0,09).

A. Imagens representativas da coloração imuno-histoquímica TNFAIP6 de tecidos normais e malignos cólon. B. TNFAIP6 intensidade de coloração no tumor do cólon primário (n = 55) e tecido normal adjacente (n = 50). * P 0,001. C. frequência de células positivas em TNFAIP6 tumor primário (n = 55) e tecido normal adjacente (n = 50). * P 0,0001. curva D. Kaplan-Meier mostrando sobrevivência livre de recorrência de pacientes com câncer de cólon com diferentes expressão TNFAIP6, com base na percentagem de células positivas.

Discussão

Este estudo foi desenhado para conceitualmente e experimentalmente tratar de uma nova hipótese de que o câncer, independentemente da sua etiologia, porto iCAMPs compartilhada para iludir a vigilância imunológica e sequestrar a imunidade do hospedeiro para promover o crescimento e metástase onco-inflamatório. Uma estratégia de mineração de dados imparcial e abrangente foi realizado para abordar esta hipótese e de minar os padrões comuns de expressão moleculares em um grande número de pacientes a partir de muitos estudos independentes para garantir a consistência dos nossos resultados. A expressão de genes selectivos foi confirmada por microarrays de tecido. Apesar de a importância biológica da nossa descoberta aguarda estudos, é claro que o iCAMP não só existe, mas também mostra relevância clínica significativa. O conjunto de genes iCAMP núcleo reproduz muitos genes bem estabelecidos que são expressos de maneira aberrante no tecido canceroso, tais como VCAN e KPNA2. (https://bioinfo.vanderbilt.edu/webgestalt/).

doi:10.1371/journal.pone.0057911.s003

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