Abstract

estruturas secundárias de DNA G-quadruplex Quatro presos foram recentemente visualizados em núcleos de células humanas cultivadas. Aqui, mostramos que BG4, um anticorpo específico G-quadruplex-, pode ser utilizado para corar ADN estruturas G-quadruplex em tecidos derivados de pacientes, utilizando imuno-histoquímica. Observa-se um número significativamente elevado de núcleos G-quadruplex-positivos em cancros humanos do fígado e estômago, em comparação com o fundo de tecido não neoplásico. Nossos resultados sugerem que a formação do G-quadruplex pode ser detectado e medido em material derivado de paciente e que a formação do G-quadruplex elevada pode ser uma característica de alguns cancros

Citation:. Biffi G, Tannahill D, Miller J, Howat WJ, Balasubramanian S (2014) Níveis elevados de Formação G-Quadruplex no estômago humano e cancro do fígado tecidos. PLoS ONE 9 (7): e102711. doi: 10.1371 /journal.pone.0102711

Autor: Mark Isalan, Imperial College London, Reino Unido

Recebido: 28 de maio de 2014; Aceito: 23 de junho de 2014; Publicação: 17 de julho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Biffi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Os autores agradecem Cancer Research UK para a concessão de programa (C9681 /A11961) e financiamento institucional do núcleo para o laboratório Balasubramanian, e por uma bolsa de estudo para doutorado GB (https://www.cancerresearchuk.org). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução estruturas secundárias

não-canônico de DNA G-quadruplex pode ser formado a partir de sequências de DNA ricas em guanina do tipo G

3 + N

L1 G

3 + N

L2 G

3 + N

L3 G

3+ (N = qualquer base e L = circular) e tais motivos de sequências são prevalentes em todo o genoma humano [1], [2]. G-quadruplexes são estruturas que compõem as pilhas de tetrads formadas através Hoogsteen ligações de hidrogénio de quatro guaninas coordenados por um cátion monovalente Central [3] quatro de cadeia. Oligonucleotídeos dobradas em uma estrutura G-quadruplex

in vitro

têm uma alta estabilidade termodinâmica sob condições quase fisiológica, de acordo com a sua formação em células [4]. O local previsto de motivos de sequência G-quadruplex em regiões reguladoras do genoma, tais como promotores e telómeros, sugere que as estruturas G-quadruplex podem ter papéis importantes na função do genoma [5] – [7]. Um número de helicases que resolver G-quadruplexes foram identificados e são hipoteticamente para contribuir para as funções normais do genoma, tais como a replicação, a transcrição e a manutenção da estabilidade do genoma [8]. A visualização do DNA estruturas G-quadruplex em células humanas tem vindo a apoiar a existência de G-quadruplexes no genoma [9]. Nestas experiências, um anticorpo específico para o G-quadruplex altamente selectivo (BG4) foi gerado por exibição em fagos e empregue para visualizar focos discretos de estruturas de G-quadruplex nos núcleos das linhas de células de cultura de tecido humano. Este anticorpo tem fornecido uma oportunidade para sondar a função celular de G-quadruplexes e também o seu envolvimento potencial na doença.

estruturas G-quadruplex têm sido sugeridos para ser associada com as funções celulares tais como a replicação e transcrição. Por exemplo, a estabilização do G-quadruplex por uma molécula pequena pode reprimir a transcrição de certos oncogenes e /ou induzir danos no ADN em telómeros e oncogenes que conduz a defeitos de replicação e a morte das células [10] – [17]. estruturas G-quadruplex também pode ser ligado a instabilidade do genoma e motivos de sequências de G-quadruplex foram encontrados pontos de interrupção proximal e locais de número de cópias do DNA somático muda visto em vários cancros [18], [19]. As helicases que resolvem G-quadruplexes também são encontrados localizadas em locais de instabilidade do genoma [20] – [22], e doenças tais como Bloom e síndromes de Werner, que mostram um aumento dos níveis de instabilidade do genoma e uma predisposição para o cancro, têm que contribuem mutações em L helicases -quadruplex-resolução [23].

Dada a potencial relação entre as estruturas G-quadruplex e doenças humanas, é uma meta importante para resolver se G-quadruplexes pode ser detectado dentro de tecidos humanos. Por conseguinte, investigada a detecção de ADN de G-quadruplexes em tecidos de pacientes-derivado e se existem diferenças entre os níveis de G-quadruplex entre tecidos não-neoplásicas e do cancro. Ao empregar o anticorpo G-específicas do quádruplo, BG4, em imuno-histoquímica com (FFPE) seções tissue microarray embebidos em parafina fixadas em formalina, temos detectado DNA formação G-quadruplex generalizada nos núcleos de tecidos humanos. A quantificação de núcleos de células bg4-positiva revelou mais extensa formação de estruturas de G-quadruplex no estômago e no fígado cancros em comparação com os correspondentes tecidos de fundo não neoplásicas. Estes resultados sugerem que o processamento de estruturas G-quadruplex é mis-regulados em alguns cancros humanos.

Resultados e Discussão

Partimos para demonstrar a presença de G-quadruplexes nos núcleos de humano tecidos e para investigar se as diferenças são facilmente visíveis em tecidos de câncer derivadas de pacientes. A nossa abordagem foi baseada na detecção de G-quadruplexes nucleares por imuno-histoquimica (IHC) com o anticorpo específico G-quadruplex-, BG4, em microarrays de não-neoplásicas e do cancro de tecido (TMAs). A especificidade e selectividade das BG4 para estruturas G-quadruplex e a aplicação de BG4 de imunofluorescência (IF) de microscopia em células humanas foram previamente descritos [9]. Para determinar a adequação do BG4 para IHC, que testou pela primeira vez este anticorpo em um sistema modelo usando seções de pellets de células FFPE de-231 MDA-MB cancro da mama células que foram previamente observados para exibir nuclear focos G-quadruplex por microscopia IF [9] . Como recuperação de epítopo, ou (no pH à base de citrato de 6,0 ou Tris /pH à base de EDTA 9,0 buffers) ou enzimática (com proteinase K) mediada por calor, é muitas vezes necessário para expor os locais antigénicos antes de ligação do anticorpo, foram comparados estes três epitopo padrão recuperação de pré-tratamentos. Após incubação BG4, coloração foi realizada por incubação com um anticorpo secundário anti-FLAG, que reconhece um epitopo marcador FLAG presente no anticorpo BG4, seguido por detecção com base em polímeros com peroxidase de rábano Leica utilizando a plataforma de Bond coloração IHC. Seguindo este protocolo, coloração nuclear intensa foi observada com BG4 somente após a recuperação epitopo (Figura 1B e S1). Não se observou coloração na ausência de pré-tratamento (Figura 1A) e controlos realizados na ausência de BG4 mostraram que a recuperação de epítopo com tampão à base de citrato deu menos fundo do que com Tris /EDTA (Figura 1C e S1), enquanto pré -Tratamento com proteinase K levado a coloração nuclear não específico, mesmo na ausência de BG4 (Figura S1). Além disso, após a recuperação de epítopo com citrato ou tampões Tris /EDTA, DNase I a um tratamento prévio BG4 coloração conduziu a uma forte redução na intensidade do sinal BG4 nuclear (Figura 1D e S1), confirmando ainda a detecção de ADN de G-quadruplexes. O sinal BG4 nuclear visto no IHC é consistente com a detecção de focos anterior BG4 nos núcleos de células de cultura de tecido [9].

. MDA-MB-231 de adenocarcinoma da mama sedimentos celulares humanas foram fixados, embebidos em parafina e processado para IHC utilizando o BG4 anticorpo específico G-quadruplex-. Nenhuma coloração é observado na ausência de recuperação de epítopo. Barra de escala corresponde a 20 um. Os núcleos são contrastadas com hematoxilina (azul). B. Strong BG4 coloração (marrom) é facilmente perceptível nos núcleos celulares seguintes recuperação antigênica com tampão à base de citrato pH 6.0. C. Nenhum coloração é observada na ausência do anticorpo primário BG4. D. Nenhuma coloração é visto a seguir ao tratamento com DNase antes da coloração BG4. Estes resultados mostram que BG4 podem ser empregues para a detecção de ADN de G-quadruplex por coloração IHC.

Tendo estabelecido um protocolo de IHQ para BG4, primeiro confirmou que as amostras de tecido humano não-neoplásicas biopsiados poderiam ser coradas utilizando BG4. Geralmente, observou-se padrões de coloração BG4 variadas em muitos tecidos, sugerindo diferenças na formação de L-quadruplexes entre tecidos e também entre células dentro do mesmo tecido (Figura S2). Estes resultados indicam que a formação global de DNA G-quadruplexes em tecidos humanos complexos pode ser avaliada utilizando BG4 no IHC, estendendo assim a visualização das estruturas G-quadruplex além SE microscopia em células de cultura de tecidos. Numa pesquisa provisória de coloração BG4 em tecidos de cancro em comparação com o fundo do tecido não neoplásico, as diferenças de intensidade ou distribuição de coloração BG4 apareceu principalmente inconclusivos (dados não mostrados), e em muitos casos rigorosa quantificação não foi possível devido a diferenças significativas na morfologia e presença de múltiplos tipos de células malignas em contra tecido não neoplásico. Em contraste, para o fígado e estômago, a nossa análise provisória sugere que esses tecidos foram facilmente quantificáveis ​​devido a uma aparência mais uniforme no interior e entre os tecidos não-neoplásicas e do cancro. Por conseguinte, utilizado o software de análise de imagem Aperio Imagescope Nuclear (V9) para quantificar a percentagem de núcleos positivos bg4 presentes nas TMA. Um classificador de análise de imagem separada foi desenvolvido para cada tipo de tecido para identificar com precisão e objectos tocar separadas, com as amostras malignas e não-neoplásicas registados com os mesmos parâmetros para comparação rigorosa. Surpreendentemente, em nove casos em que tivemos de câncer de fígado duplicado núcleos TMA com o fundo combinado tecido não-neoplásica correspondente retirado do mesmo paciente, observou-se um número muito maior de núcleos BG4-positivos no cancro (média de 60,3 ± 5,4%) versus não neoplásico (média de 18,3 ± 2,12%) núcleos de tecidos (Figura 2). Quando fenótipos de cancro individuais foram examinados, verificou-se que tanto o carcinoma hepatocelular (HCC) e colangiocarcinoma intra-hepática (ICC) mostrou significativamente maior coloração nuclear BG4 comparação com o tecido não neoplásico (Figura 2A-D e G). Embora HCC e ICC têm diferentes origens celulares, desenvolvendo a partir de hepatócitos ou cholangiocytes ducto biliar, respectivamente, ambos mostraram um maior número e intensidade dos núcleos bg4-positivos em comparação com o tecido do fígado não-neoplásica. Além disso, nas metástases (isolada a partir de locais de carcinoma do pulmão indiferenciado de células grandes) um aumento na coloração BG4-positivo foi também observado (Figura 2E-G). Observaram-se diferenças claras entre o tecido não-neoplástico e de tumor para um número de diferentes casos de pacientes. Na verdade, uma análise mais abrangente do câncer e de fundo não neoplásicas núcleos TMA incluindo casos incomparáveis ​​mais uma vez mostrou um aumento em núcleos bg4-positivas em todo HCC, ICC e carcinoma metastático (Figura 3A). Quando todos os casos foram considerados em conjunto, um aumento ~2.4-vezes no número de núcleos BG4-positiva foi observada em cancro do fígado em comparação com o tecido não neoplásico. (P 0,001, Figura 3B)

fundo não- tecidos neoplásicos do fígado e câncer foram coradas por IHQ utilizando o BG4 anticorpo G-específicas do quádruplo. A. Os núcleos de tecido hepático não-neoplásico de um paciente carcinoma hepatocelular são principalmente BG4-negativas, com hematoxilina de contraste (azul) evidente. Barra de escala corresponde a 50 um. Note-se que os grânulos citoplasmáticos são variáveis ​​e susceptíveis de ser artefatos à base de heme, por vezes observadas no fígado IHC. B. neoplásica tecido a partir do mesmo paciente em uma grande mostra a presença de núcleos bg4-positivo (castanho). C. Os núcleos de tecido hepático não-neoplásico para um paciente colangiocarcinoma intra-hepática são principalmente BG4-negativo. D. neoplásica tecido a partir do mesmo paciente em C mostra muitos núcleos bg4-positiva. E. Os núcleos de tecido hepático não-neoplásica a partir de uma grande célula indiferenciada paciente carcinoma do pulmão metastático são principalmente BG4-negativo. F. tecido hepático metastático isolado a partir do mesmo paciente em E mostra diversos núcleos bg4-positiva. G. A quantificação do número de núcleos bg4-positiva em cancro do fígado e dos correspondentes combinados tecidos não-neoplásicas a partir de nove pacientes. As barras de erro representam o erro padrão da média (S.E.M.) quando calculado em duplicado TMA núcleos estavam disponíveis. No geral, estes resultados indicam que há um maior número de estruturas de G-quadruplex em cancro do fígado em comparação com o fundo de tecido não neoplásico a partir do mesmo indivíduo.

. A quantificação do número de núcleos bg4-positiva em tecidos de fígado incluindo núcleos individuais TMA incomparáveis. hepático não-neoplásico mostra menos núcleos bg4-positivos em comparação com carcinoma hepatocelular ou colangiocarcinoma intra-hepático. Cada coluna corresponde a uma única amostra de tecido e as barras de erro representam o S.E.M. calculado quando as amostras de tecidos em duplicado foram disponível. B. quantificação global do número de núcleos bg4-positivos em todos os tecidos do fígado não-neoplásicas e do cancro. As barras de erro representam o S.E.M. ** P 0,001, n = 19 e 32 para os núcleos não-neoplásicas e do cancro, respectivamente. Estes resultados confirmam a generalidade da formação de L-quadruplex mais extensa nos cancros do fígado em comparação com os tecidos não neoplásicos.

semelhante ao aumento da incidência do G-quadruplex em tecido de cancro do fígado, uma maior do que três aumento vezes de no número de núcleos bg4-positiva foi observada em adenocarcinoma do estômago e carcinoma de células em comparação com o anel de sinete fundo tecido não neoplásico tomadas a partir do mesmo indivíduo (Figura 4). Uma análise mais abrangente de câncer de estômago e os tecidos não-neoplásicas, incluindo casos incomparáveis ​​reafirmou o aumento do número de núcleos bg4-positivos observados em câncer de estômago em comparação com o tecido não-neoplásica (Figura 5). De fato, em câncer de estômago indivíduo sub-tipos, adenocarcinomas (proveniente do epitélio glandular), carcinomas de células em anel de sinete (adenocarcinomas caracterizadas pela deposição de mucina) e tumores estromais gastrointestinais (GIST,-KIT expressar sarcomas de origem mesenquimal), todos apresentaram maior número de núcleos bg4-positiva em comparação com o tecido de estômago não-neoplásicas (Figura 5A). Quando todos os casos foram considerados em conjunto, ~3.1 vezes mais núcleos bg4-positivas foram encontradas no cancro contra tecidos não-neoplásicas (Figura 5B, P 0,001). É notável que vários tumores de estômago sub-tipos, que têm diferentes etiologias e progressão, são todos caracterizados por aumento da coloração BG4. Estes resultados são, portanto, altamente sugestivo de uma ligação geral entre um aumento da presença de estruturas G-quadruplex e desenvolvimento de câncer de estômago.

adenocarcinoma gástrico e carcinoma de células anel de sinete e fundo combinados tecidos não neoplásicas retirado do mesmo paciente foram manchadas com o BG4 anticorpo G-específicas do quádruplo por IHC. A. Os núcleos de tecido do estômago não-neoplásica de um paciente adenocarcinoma gástrico são principalmente BG4-negativas, com contracoloração hematoxilina (azul) facilmente perceptível. Barra de escala corresponde a 50 um. B. Adenocarcinoma do tecido a partir do mesmo paciente em uma extensa mostra números de núcleos bg4-positivo (castanho). C. Os núcleos de tecido do estômago não-neoplásica de um paciente carcinoma anel de sinete são principalmente BG4-negativo. D. Signet tecido de carcinoma de células em anel a partir do mesmo paciente em C mostra muitos núcleos bg4-positiva. E. A quantificação do número de núcleos bg4-positiva nos cancros do estômago combinados e tecidos de fundo não neoplásicas de dois pacientes diferentes. As barras de erro representam o S.E.M. calculada quando duplicados TMA núcleos estavam disponíveis. Estes resultados indicam que há mais estruturas G-quadruplex nos núcleos de tecido de cancro do estômago do que no tecido não neoplásico a partir do mesmo indivíduo.

A confirmação da presença aumentada de núcleos bg4-positiva num gama de tecidos de câncer de estômago em comparação com tecidos de fundo não-neoplásica, incluindo casos incomparáveis. A. Os núcleos dos tecidos do estômago não neoplásicas são em grande parte BG4-negativo. os núcleos das células foram contrastadas com hematoxilina (azul). Barra de escala corresponde a 50 um. tecido adenocarcinoma gástrico B. mostra a extensa presença de núcleos bg4-positivas (marrom). carcinoma de células anel C. Signet mostra muitos núcleos bg4-positivo. tumores estromais gastrointestinais (GIST D.) são em grande parte BG4-positivo (para a pesquisa de câncer de estômago apenas tecidos GIST incomparáveis ​​estavam disponíveis). E. A quantificação do número de núcleos bg4-positiva em tecidos individuais do estômago, incluindo núcleos TMA incomparáveis. tecido do estômago não-neoplásica mostra menos núcleos bg4-positivos em comparação com adenocarcinoma, carcinoma anel de sinete ou GIST. Cada coluna corresponde a uma única amostra de tecido e as barras de erro representam o S.E.M. calculado quando as amostras de tecidos em duplicado foram disponível. F. geral quantificação do número de núcleos bg4-positivos em todos os tecidos do fígado não-neoplásicas e do estômago. As barras de erro representam o S.E.M. ** P 0,001, n = 10 e 34 para os núcleos não-neoplásicas e do cancro, respectivamente. Estes resultados confirmam a generalidade dos mais extensa formação G-quadruplex nos cancros do estômago em comparação com tecidos não-neoplásicas.

No fígado e estômago TMAs, alguns núcleos de tecido de cancro mostrou pouca ou nenhuma coloração BG4 quantificável , talvez refletindo um problema na estabilidade epitopo durante a coleta de biópsia cirúrgica ou, alternativamente, apontando para uma variabilidade real na formação do G-quadruplex nestes tecidos particulares. No entanto, é digno de nota que em nenhum caso houve qualquer tecido do fígado ou do estômago não-neoplásica extensivamente BG4-positivo. Esta última observação confirma ainda que o aumento no número de células bg4-positivos observados nos núcleos cancro TMA reflecte uma diferença verdadeira na presença de G-quadruplex entre os estados não neoplásicos e malignas. Análise de coloração G-quadruplex em outros tipos de cancro podem ser, por conseguinte, possível e a análise preliminar do tecido pâncreas sugere que, enquanto que a coloração BG4 no pâncreas não neoplásico é generalizada, existe um aumento ~1.6 vezes de coloração nuclear BG4 em tecidos de adenocarcinoma ( P . 0,01, Figura S3)

no geral, nossos resultados demonstram que o G-quadruplexes pode ser visualizado por IHC em tecidos não-neoplásicas e câncer humano estender nossas descobertas anteriores que revelaram a presença de estruturas G-quadruplex em os núcleos de linhas celulares de cultura [9]. É digno de nota que foi observado um aumento no número de células-G-quadruplex positivo para alguns tecidos de cancro em comparação com os casos não neoplásicas. Os dados que se apresentam em si não explicar porque mais G-quadruplexes são evidentes nos casos de cancros do estômago e do fígado. No entanto, existem várias linhas de evidência na literatura que sugerem uma potencial associação ou ligação causal entre a G-quadruplexes e mecanismos que contribuem para o desenvolvimento ou progressão do câncer. Por exemplo, estruturas de G-quadruplex, se não resolvido durante a replicação de ADN, podem representar locais frágeis que promovem a instabilidade do genoma, que é uma característica bem conhecida de cancro [24]. Com efeito, os motivos de sequência G-quadruplex são encontradas em ADN pontos de interrupção que levam a translocações dentro do gene BCL2 em linfomas e dentro do gene HOX11 em leucemias de célula T [25], [26]. análises computacionais também sugeriram possíveis associações de G-quadruplexes e regiões de ponto de interrupção em vários tipos de câncer [19].

Nossa hipótese é que um aumento na genômicas G-quadruplexes no cancro pode surgir de mutações em enzimas que processam G-quadruplexes e /ou instabilidade genómica em locais G-quadruplex. Por exemplo, anemia de Fanconi, síndromes de Bloom e Werner é, tudo instabilidade visor genoma com uma predisposição para o cancro [27] – [29] e resultam de mutações nas enzimas ADN helicase que têm G-resolver-quadruplex actividade [30] – [32] . Estudos recentes do genoma também destacou o reconhecimento de sequências G-quadruplex por helicases resolver adicionais, tais como ATRX, PIF1 e XPB /D [20] – [22]. Além disso, PIF1 tem sido sugerido para suprimir a instabilidade genómica em G-quadruplexes [22], enquanto que a perda ATRX está associada com instabilidade cromossómica em tumores neuroendócrinos pancreáticas [33], e mutações XPD perturbar nucleótidos de reparação do ADN excisão que conduz a doenças cancerosas propensas tais como xeroderma pigmentoso [34].

parece que os cancros do fígado e do estômago são altamente heterogênea e não são caracterizadas por uma assinatura genética comum ou uma mutação condução altamente representados que podem simplesmente explicar o aumento observado em estruturas G-quadruplex . Enquanto muitos cancros do fígado estão associados com hepatite B ou C, a informação obtida com a patológica TMA indica que não existe uma correlação com coloração BG4. Como parte do trabalho futuro, que será de grande utilidade para analisar amostras não-neoplásicas e malignas do tumor para os casos em todo o genoma de sequenciação tem sido empregada para elucidar o fundo genético do tumor pares /não-neoplásicas, a fim de estabelecer a relação entre genótipo e formação G-quadruplex no câncer.

em conclusão, relatamos o uso do anticorpo G-específicas do quádruplo, BG4, no IHC experimentos de coloração de tecidos não-neoplásicas e cancerosas humanas. Este estudo permitiu identificar uma presença significativamente maior de DNA estruturas G-quadruplex nos núcleos das células do estômago e câncer de fígado em comparação com os tecidos não neoplásicas correspondentes. Nossa hipótese é que estas diferenças podem ser dependente de alterações de processos celulares que regulam a estabilidade do genoma ou mudanças no estado de cromatina em locais G-quadruplex em tecidos de câncer. Os resultados suportam a possibilidade de que células cancerosas podem fornecer uma janela de selectividade que iria torná-los mais sensíveis do que as células não neoplásicas no sentido de uma G-alvejando-quadruplex estratégia de molécula pequena.

Materiais e Métodos

Fixação, a incorporação, de corte e coloração de pelotas de células foram realizados pelo serviço principal histopatologia no Research UK Cambridge Cancer Institute. A imuno-histoquímica (IHQ) foi realizada utilizando métodos padrão sobre uma plataforma automatizada Leica ligação com pequenas variações. Resumidamente, os tecidos foram fixados durante 24 h à temperatura ambiente (TA) em 10% de formalina tamponada neutra e processado utilizando um processador de tecidos com ASP300 de-hidratação através de uma série de etanol graduada, limpando em xileno e infiltração com cera de parafina fundida. Incorporação foi realizada numa estação de incorporação Leica EG1160 e secções foram cortadas a 3 um com um micrótomo, flutuou num banho de água regulado para ~45-50 ° C até ficar lisa e plana, antes da recolha numa lâmina de microscópio e secagem a 60 ° C durante 1 h. De-depilação e re-hidratação foram realizados usando um ST5020 Multistainer automatizado Leica. células de adenocarcinoma da mama humano MDA-MB-231 foram obtidas a partir de ATCC LGC Standards. Para sedimentos de células MDA-MB-231, de recuperação de epítopo foi realizada a 100 ° C durante 20 min, com recuperação de Bond epitopo Solução 1 (tampão à base de citrato de pH 6,0) ou bond solução de recuperação de epítopo 2 (Tris /tampão à base de EDTA pH 9,0) ou a 37 ° C durante 10 minutos com o kit de ligação de enzima pré-tratamento (100 ug /ml de proteinase K em Tris-tamponada salina, agente tensioactivo e 0,35% de Proclin 950) para encontrar a melhor condição. microarrays de tecido humano comercialmente disponíveis com aprovação ética competente do país de origem foram adquiridos de introspecção Bio UK (para US Biomax Inc. matrizes) e Biocat, Alemanha ou Stretton Scientific, Reino Unido (para Accumax, matrizes Isu Abxis). Epitopo recuperação foi efectuada a 100 ° C durante 20 min com tampão de citrato. BG4 coloração foi realizada à TA de um instrumento Leica bond automatizado com um kit de polímero de coelho (Leica) após uma incubação de 15 min com um BG4 e 8 minutos de incubação com um anticorpo policlonal de coelho anti-FLAG (Cell Signaling Technology). As lâminas foram então contrastadas durante 5 min com hematoxilina 0,02% para visualizar os núcleos celulares. De-hidratação e de compensação foram feitas em um Multistainer automatizado Leica ST5020, e a montagem foi realizada sobre um vidro automatizado coverslipper CV5030 Leica. As lâminas foram digitalizadas com um sistema de digitalização de slides Aperio XT120 (Leica) e imagens analisadas utilizando o software v9 Aperio Imagescope Nuclear. As análises estatísticas e valores de P foram calculados utilizando o teste t de Student. gráficos de frequência de distribuição foram plotados usando GraphPad Prism (GraphPad Software).

Informações de Apoio

Figura S1. coloração

BG4 em sedimentos de células MDA-MB-231 embebidas em parafina. A. humanos MDA-MB-231 sedimentos de células do cancro da mama foram fixadas e processadas para IHC utilizando o BG4 anticorpo específico G-quadruplex-embebidos em parafina. coloração BG4 forte (marrom) pode ser apreciado em núcleos de células após a recuperação epitopo com Tris /baseados em EDTA pH 9.0. Barra de escala corresponde a 20 um. Os núcleos são contrastadas com hematoxilina (azul). B. BG4 coloração forte (castanho) resulta em núcleos de células após a recuperação de epítopo com proteinase K. C. Nenhuma coloração nuclear é observada na ausência do anticorpo BG4 após a recuperação de Tris /EDTA epitopo. D. coloração Nenhum nuclear é visto após o tratamento DNase antes da coloração BG4 após a recuperação epitopo com EDTA. E. altos níveis de coloração não específica na ausência de BG4 após a recuperação epitopo com proteinase K.

doi: 10.1371 /journal.pone.0102711.s001

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Figura S2. tecidos humanos

não neoplásicos mostram coloração variável BG4. tecidos não neoplásicas foram coradas por IHQ utilizando o BG4 anticorpo G-específicas do quádruplo. coloração A. BG4 (marrom) no córtex renal mostra uma gama de intensidades de coloração nuclear em glomérulos e estruturas associadas. os núcleos das células foram contrastadas com hematoxilina (azul). Barra de escala corresponde a 50 um B. Fracamente BG4 coloração positiva é visto nos núcleos tubulares de recolha da medula renal. C. pele mostra uma gama de intensidades bg4 na epiderme com núcleos positivos e negativos espalhados por toda parte, enquanto a derme é mais positivo. D. A maioria dos núcleos no cólon são BG4-positiva. E. No corpo do útero, o epitélio escamoso estratificado é em grande parte BG4 negativo passo que a coloração positiva é visto mais superficialmente. F. Ao longo dos lóbulos ductal de mama, ambas as células mioepiteliais e luminais mostrar forte coloração geral BG4 com células negativas apenas ocasional

doi:. 10.1371 /journal.pone.0102711.s002

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Figura S3. presença

elevada de estruturas G-quadruplex em tecidos de câncer de pâncreas humano. tecidos pancreáticos não-neoplásicas e do cancro foram coradas por IHC utilizando o BG4 anticorpo específico G-quadruplex-, e o número de núcleos BG4-positivas foi marcado usando o software Aperio Imagescope. A. Os núcleos de show de tecido pâncreas coloração BG4 moderada não-neoplásica (marrom) com muitos núcleos não corados também presente. os núcleos das células foram contrastadas com hematoxilina (azul). Barra de escala corresponde a 50 um. coloração B. BG4 no tecido adenocarcinoma de pâncreas é mais extensa com maior intensidade. quantificação de C. Em geral o número de núcleos bg4-positivo em todos os tecidos de cancro não-neoplásicas e pancreáticas. As barras de erro representam o S.E.M. * P 0,01, n = 6 e 12 para núcleos não neoplásicas e câncer, respectivamente

doi:. 10.1371 /journal.pone.0102711.s003

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