Abstract

Yuanhuacine (YC), um diterpeno daphnane das flores de

Daphne genkwa

, exibiu uma actividade inibidora do crescimento potencial contra células de câncer de pulmão de células não pequenas humano (NSCLC). YC também suprimiu a invasão e migração de células de câncer de pulmão. No entanto, os mecanismos moleculares precisos permanecem por ser elucidados. No presente estudo, relatamos que YC activado significativamente proteína quinase ativada pela AMP (AMPK) via de sinalização e suprimiu via de sinalização a jusante mediada por mTORC2 em células NSCLC humanas H1993. AMPK desempenha um papel importante no metabolismo da energia e da biologia do cancro. Por conseguinte, os activadores de AMPK vias de sinalização pode ser aplicável para o tratamento do cancro. YC aumentou a expressão de p-AMPKα. O co-tratamento de YC e composto C (um inibidor da AMPK) ou metformina (um activador de AMPK) também confirmou que aumenta p YC-AMPKα. YC também suprimiu a activação do alvo da rapamicina em mamíferos expressão (mTOR), um alvo a jusante de AMPK. Outras estudo revelou que YC modula vias de sinalização a jusante associada-mTORC2 com uma menor expressão de P-Akt, p-proteína quinase C alfa (PKCα), p-ras relacionadas com a toxina botulínica C3 substrato 1 (Rac1) e actina filamentosa (F- actina) que são conhecidos por activar o crescimento celular e organizar do citoesqueleto de actina. Além disso, YC inibiu o crescimento do tumor em xenoenxerto implantado células H1993 modelo de ratinho nu. Esses dados sugerem a YC poderia ser um candidato potencial para agentes quimioterápicos para câncer derivadas de produtos naturais através da regulação da AMPK /mTORC2 percurso e organização do citoesqueleto de actina sinalização

Citation:. Kang JI, Hong JY, Lee HJ, Bae SY, Jung C, Parque HJ, et al. Atividade (2015) Anti-Tumor de Yuanhuacine regulando AMPK /mTOR via de sinalização e organização do citoesqueleto de actina em Non-Small Cell Lung Cancer Cells. PLoS ONE 10 (12): e0144368. doi: 10.1371 /journal.pone.0144368

editor: Cong Cao, Universidade de Suzhou, China

Recebido: 10 de fevereiro de 2015; Aceito: 17 de novembro de 2015; Publicação: 11 de dezembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Kang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo Programa de Pesquisa em Ciência básica através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia (2013R1A1A2012389 e nº 20100024361) . Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é uma das doenças mais comuns no mundo e a principal causa de morte relacionada ao câncer [1]. Existem duas formas principais da doença, cancro de células pequenas do pulmão (SCLC) e cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC), onde NSCLC é de aproximadamente 85% de todos os casos de cancro do pulmão. Juntamente com a cirurgia e radioterapia, a quimioterapia é um dos tratamentos mais comuns para a terapia do cancro do pulmão. No entanto, a quimioterapia ainda não é suficientemente eficaz para pacientes com NSCLC avançado com uma taxa de sobrevivência média de cerca de um ano [2, 3]. Portanto, o desenvolvimento de novos agentes anticancerígenos potentes ainda é necessária para tratar a doença.

Daphne genkwa

(Thymelaeaceae) é uma planta medicinal tradicional bem conhecido distribuídos principalmente na Coréia e China, e sua flor tem sido referido como exibindo abortivo, anti-câncer, antitússicos, diurética, e actividades expectorantes [4]. Vários compostos incluindo diterpenos do tipo daphnane foram isolados de

D

.

genkwa

[5]. Daphane do tipo diterpen�des mostrou vários efeitos biológicos, incluindo anti-câncer, transitória receptor potencial canal de cátion membro da subfamília V 1 (TRPV1) ativando, anti-fertilidade, pesticidas, neurotrófico, para baixar o colesterol, anti-hiperglicêmicos, irritante,-tumoral promover e actividades anti-vírus da imunodeficiência humana (VIH) [6]. Yuanhuacine (YC) é um componente importante de diterpenos do tipo daphnane isolado das flores em botão de

Daphne genkwa

. YC mostrou atividade anti-câncer em várias linhas celulares de cancro

in vitro

[7]. Também relataram que YC exibe actividade inibidora de crescimento relativamente selectiva contra células de cancro de pulmão humano A549 em comparação com as células MRC-5 epiteliais pulmonares normais [8]. No entanto, o mecanismo molecular subjacente de YC em células de cancro do pulmão humano não foi ainda elucidado.

da proteína quinase ativada por AMP (AMPK) é uma proteína quinase serina /treonina ubíqua constituída por uma subunidade catalítica α e duas regulador (subunidades p e y) [9], e é conhecido por regular o metabolismo da energia celular [10, 11]. A activação de AMPK é causada por stress celular, tal como o stress oxidativo, hipoxia e hipoglicemia, e leva a um aumento da relação entre o monofosfato de adenosina celular (AMP) e adenosina-trifosfato (ATP). AMPK também controla o crescimento celular, proliferação e autofagia através da modulação da actividade alvo de mamífero de rapamicina (mTOR), o que é consistente desregulado nas células cancerosas [12]. Existem dois tipos de mTOR, e mTORC1 mTORC2 que são estruturalmente e complexos de multi-proteínas funcionalmente diferentes [13]. Geralmente, mTORC1 controla o crescimento de células em resposta a disponibilidade de nutrientes e reguladores de crescimento. Em contraste, mTORC2 é um regulador chave do citoesqueleto de actina que está correlacionada com a metástase do câncer, e controla a fosforilação de Akt na Ser-473 por meio da interacção entre o companheiro rapamicina e minúsculas de mTOR (rictor) e mTOR [14, 15].

no presente estudo, a atividade anti-tumoral de YC e dos seus mecanismos moleculares subjacentes de ação foram investigadas tanto em células de câncer de pulmão H1993 humanos

in vitro

cultura e H1993-implantado xenotransplante ratinho nu modelo

in vivo

.

Materiais e Métodos

Reagentes

O dimetilsulfóxido (DMSO), ácido bicincon�ico (BCA), ácido tricloroacético (TCA), sulforrodamina B (SRB), a catalase e foram adquiridos da Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO, EUA), Instituto Roswell Parque Memorial (RPMI) 1640, soro fetal de bovino (FBS), uma solução de tripsina-EDTA (1X ), solução de antibiótico-antimicótico (100X) e solução salina tamponada com fosfato (PBS) (1X) foram adquiridos de Hyclone Laboratories, Inc. (South Logan, UT, EUA). Anti-p-AMPKα, anti-AMPKα, anti-P-ACC, anti-ACC, anti-P-mTOR, anti-mTOR, anti-P-4EBP1, anti-4EBP1, anti-P-eIF4E, anti-eIF4E, anti-p-p70S6K1, anti-p70S6K1, anti-P-RPS6, anti-RPS6, anti-rictor, anti-P-Akt, anti-Akt, e anti-e-caderina foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA , EUA). Anti-PKC-α, anti-P-Rac1, anti-Rac1, anti-PCNA, anti-β-actina, e todos os anticorpos secundários foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology. (Santa Cruz, CA, EUA). Anti-p-rictor foi adquirido a partir da Millipore (Temecula, CA, EUA). Anti-p-PKC-α, anti-F-actina, e anti-Ki-67 foram adquiridos da Abcam (Cambridge, MA, EUA). Gefitinib foi comprado de Selleckchem (Houston, TX, EUA) e a rapamicina foi adquirido a Tocris Bioscience (Bristol, Reino Unido).

Composto

Yuanhuacine (YC, a figura 1A) foi isolado e identificado a partir de as flores de

Daphne genkwa

como descrito anteriormente [8]. O composto foi dissolvido em 100% sulfóxido de dimetilo (DMSO) e diluída com meio para a preparação da amostra.

(a) a estrutura química de YC. (B) H1993 células foram tratadas com as concentrações indicadas de YC e gefitinib durante 72 h. A proliferação celular foi medida pelo ensaio de SRB. (C) H1993 células foram tratadas com várias concentrações de YC durante os tempos indicados, e a proliferação das células foi determinada com o ensaio de SRB. (D) As alterações morfológicas mediadas pelo tratamento de YC por 24 h foram observadas ao microscópio de contraste de fase.

Cultura de Células

As linhas de células NSCLC humanas (H358, H460, células Calu-1, H1299, A549, e H1993) foram adquiridos da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). As células foram cultivadas em RPMI1640 suplementado com FBS 10% e antibióticos e antimicóticos (PSA; 100 unidades /mL de penicilina G de sódio, 100 ug /mL de estreptomicina e 250 ng /mL de anfotericina B), num incubador humidificado a 37 ° C com 5% CO

2.

proliferação celular Ensaio

O efeito da YC na proliferação celular foi avaliada por método de coloração proteína celular SRB. As células foram semeadas em placas de 96 poços, com várias concentrações de amostras e incubou-se a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO

2. Após 72 h de incubação, as células foram fixadas com solução de TCA a 10% durante 30 min e corados proteínas celulares com 0,4% de SRB em ácido acético a 1% durante 1 h. As células coradas foram dissolvidas em tampão Tris 10 mM (pH 10,0). O efeito de amostras na viabilidade celular foi calculada como uma percentagem, em relação de controlo tratado com solvente para. Os sub

50 valores IC foram calculados por análise de regressão não-linear utilizando o software v5.01 Tabela 2D curva (Systat Software Inc., Richmond, CA, EUA).

Western Blot e análise de imunoprecipitação

para a análise de western blot, as células expostas a várias concentrações de amostras foram lisadas e as concentrações de proteína foram determinadas pelo método de BCA. Total de proteínas (40 pg) em cada ligado de células foram submetidas a resolução em várias concentrações (6-15%) de electroforese em dodecil sulfato de sódio-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e transferidos para membranas de PVDF-eletro. As membranas foram incubadas com tampão de bloqueio (albumina de soro bovino a 5% (BSA) em soro fisiológico tamponado com Tris e Tween 20 (TBST) durante 1 h à temperatura ambiente e em seguida incubadas adicionalmente com anticorpos específicos diluídos em 2,5% de BSA em TBST durante a noite a 4 ° C. Depois de se lavar com TBST, as membranas foram incubadas com peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpos secundários durante 2 h à temperatura ambiente e visualizados por kit de detecção de HRP quimioluminescente (Lab Frontier, Seul, Coreia do Sul) usando LAS-4000 Imager ( Fuji Film Corp., Japão).

Para imunoprecipitação do meio de cultura, o sobrenadante celular foi filtrada através de um filtro de 0,2 um, e os inibidores da protease e da fosfatase (Roche Applied Science, Penzberg, Alemanha) foram então adicionados . Para a imunoprecipitação das células de cultura, as células foram lisadas em tampão de lise IP inibidores da protease e da fosfatase (Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM e 0,5% de NP-40) contendo. O meio de cultura filtrou ou uma quantidade igual de lisados ​​de células foi pré-aclarados durante 30 min a 4 ° C com proteína G-Sepharose 4FastFlow (GE Healthcare, Little Chalfront, Reino Unido). Após a remoção de esferas (10 min, 12000 rpm, 4 ° C), o sobrenadante foi incubado com o anticorpo indicado durante a noite a 4 ° C. O imunocomplexo foi recolhido com esferas, a 4 ° C durante 2 h. As contas foram lavadas quatro vezes com tampão de lise de IP, e as proteínas ligadas foram eluídas com 2 x tampão de amostra de Laemmli a 95 ° C durante 10 min. As amostras de proteína coletados foram submetidos à análise de western blot.

Imunocitoqu�ica.

As células H1993 foram sub-cultivadas na lamela revestida com poli-L-lisina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) numa placa de cultura de 12 poços. As células tratadas foram lavadas três vezes com PBS frio, e foram fixadas em 2% de paraf ormaldeido durante 15 minutos, seguido de permeabilização com 0,5% de Triton X-100 em PBS durante 5 min. As células foram então lavadas com 0,1% de Triton X-100 em PBS (PBS-T) e incubadas em solução (BSA a 3% e soro de cabra normal a 1% em PBS-T) de bloqueio, durante 1 h. Os anticorpos primários foram adicionados à solução de bloqueio e as células foram incubadas durante 1 h a 37 ° C. Após lavagem com PBS-T, três vezes, as células foram incubadas com anticorpos secundários apropriados em solução de bloqueio durante 45 minutos à temperatura ambiente. As células marcadas foram lavadas com PBS-T para seis vezes e foram montadas com solução de fixação [100 mg /ml de octano 1, 4-diazabiciclo [2.2.2] octano (DABCO) em glicerol a 90%]. As lâminas foram observadas com um microscópio de laser confocal de varredura LSM710 (Carl Zeiss, Alemanha).

A migração celular Ensaio

Para avaliar o efeito de YC sobre a migração de células, um ensaio de cicatrização da ferida foi realizada como descrito previamente [16]. Resumidamente, as células H1993 foram semeadas em placas de seis poços e incubadas durante 48 h até que se atingiu confluência de 80-90%. Uma monocamada confluente de células H1993 foi artificialmente ferida com uma ponta de micropipeta, e as células isoladas foram lavadas com RPMI 1640 isento de soro e tratadas com compostos de teste em meio de crescimento durante 24 h. As células foram lavadas duas vezes com PBS. Imagens das feridas foram fotografadas em 0 e 24 h sob um microscópio invertido (CKX41, Olympus, Tóquio, Japão).

celular Invasion Ensaio

O efeito da YC na invasão celular foi realizada utilizando as células H1993 conforme descrito anteriormente [17]. As células foram semeadas em câmaras de topo de uma de 24 cavidades insertos de membrana de tereftalato de polietileno revestido com Matrigel-8 uM poros (Millipore, Billerica, MA, EUA). As placas foram revestidas com 10 uL de câmara de tipo I do inserto Transwell Matrigel-revestido. O meio das câmaras inferiores foi também continham 0,1 mg /mL de albumina de soro bovino como um quimioatractor. As células foram incubadas durante 48 h a 37 ° C. As células que tinham invadido a superfície externa da membrana foram fixadas com metanol e coradas com hematoxilina e eosina, e fotografados (CKX41, Olympus, Tóquio, Japão).

Análise de combinação de fármacos

As células (5 x 10

4 células /poço) foram plaqueadas em placas de 96 poços, com várias concentrações de YC e rapamyacin ou gefitinib. Após 48 h de incubação, a proliferação celular foi determinada utilizando o ensaio de SRB. O efeito da combinação foi avaliada por cálculo do índice de combinação (IC) valores como segue: IC = D

1 /(D

x)

1 + D

2 /(D

x)

2, em que D

1 e D

2 são as concentrações dos compostos de ensaio combinado, que permitam atingir o efeito esperado, e (D

x)

1 e (D

X )

2 são as concentrações que atingem efeitos semelhantes quando os compostos de teste são utilizados isoladamente. Neste estudo, 50% de inibição foi tomada como o nível eficaz. Os valores IC foram comparados com os valores de referência relatados por Chou [18].

In Vivo Tumor Estudo Xenoenxerto

ratos nus fêmeas [5 semanas de idade, BALB /c-nu (nu /nu )] foram adquiridas a partir de Central animal Laboratory, Inc (Coreia do Sul) e mantidas em condições sem agentes patogénicos. Todos os experimentos e cuidados com animais foram realizados de uma forma em conformidade com as diretrizes da Comissão Cuidado e Uso do animal de Ewha Womans University. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal de Ewha Womans University. células H1993 foram injectados subcutaneamente nos frascos de murganhos (1 x 10

7 células em 200 ul de meio), e os tumores foram deixados crescer. Quando o volume do tumor atingiu aproximadamente 90 milímetros

3, o tratamento medicamentoso foi iniciado. Os ratinhos foram divididos aleatoriamente em grupos de cinco animais por cada tratamento e controlo de veículo. YC (0,5 ou 1,0 mg /kg de peso corporal) ou gefitinib (10 mg /kg de peso corporal) dissolvido num volume de 100 ul de solução (etanol-Tween 80-H

2O, 1: 98: 1) foi administrado por via oral uma vez por dia durante 21 dias. O grupo de controlo foi tratado com um volume igual de veículo de DMSO. O volume do tumor foi monitorizado durante 21 dias cada 4 ~ 6 dias utilizando compassos de calibre, e o volume do tumor foi estimado de acordo com a seguinte fórmula: Volume do tumor (mm

3) = 3,14 x L x W x H /6, em que L é a comprimento, W é a largura, e H é a altura.

a imuno-histoquímica de tumores

tecidos de tumor excisadas foram fixadas em paraformaldeído a 4% (PFA) e embebidos em parafina. As secções em série dos espécimes embebidos foram desparafinizadas, re-hidratadas, e submetida a recuperação de antigénios. As lâminas foram incubadas com os anticorpos, que foi detectada utilizando o kit LSAB + System-HRP (Dako, Glostrup, Dinamarca) e contrastadas com hematoxilina. secções coradas foram observadas e fotografadas sob um microscópio de contraste de fase invertida.

ex vivo análise bioquímica de tumores.

Uma porção dos tumores congelados excisados ​​de ratinhos nus foi descongelada em gelo e homogeneizada usando um homogeneizador em Tampão de lise completa (Activo Motif, Carlsbad, CA, EUA). Os lisados ​​tumorais foram submetidos a ensaios de determinação da concentração de proteína e armazenaram-se aliquotas a -80 ° C.

Análise estatística

Os dados foram expressos como a média ± desvio padrão (D.P.). As análises estatísticas foram realizadas utilizando

t-

teste de Student. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas a

* p Art 0,05,

** p

. 0,01

Resultados

efeitos inibidores de crescimento de YC em células H1993 cultivadas

Os nossos estudos anteriores demonstraram que a YC tem uma actividade inibidora de crescimento relativamente selectiva contra células de cancro do pulmão humano em comparação com as células epiteliais normais do pulmão [8]. Portanto, no presente estudo, que alargado para avaliar a actividade anti-proliferativa de YC em várias linhas celulares de NSCLC. YC exibiram uma actividade inibitória de crescimento potencial em células NSCLC humanas cultivadas (Tabela 1). Em particular, a linha celular H1993 foi demonstrado ser o mais sensível com o CI

50 valor de 9 nM, após 72 h de incubação, e YC pareceu ser mais potente do que o gefitinib, uma droga anti-cancro para o tratamento de doentes com NSCLC em clínica, sob as mesmas condições experimentais (Fig 1B). Quando tratados com várias concentrações de YC para vários pontos de tempo (24, 48 e 72 h), YC inibiu a proliferação de células H1993 de uma forma sua concentração e do tempo-dependente (Fig 1C). Uma vez que a linha celular H1993 foi a célula mais sensível à YC, o estudo acção mecanismo para a actividade anti-proliferativa de YC foi realizada nas células H1993.

As alterações morfológicas das células tratadas com YC foram observadas ao microscópio de contraste de fase após 24 h de incubação. Os números de células foram diminuídos de uma forma dependente da concentração, e a forma poligonal de células de controlo foi transformado em dendrite-forma apertada e irregular das células (Fig 1D).

Efeitos de YC na via de sinalização da AMPK

Para melhor elucidar o mecanismo anti-proliferativo de YC, a regulação de uma via de transdução de sinal celular associada com o crescimento de células de cancro foi analisado utilizando transferência de Western. AMPK é considerada como uma molécula-chave que controla o crescimento de células, proliferação, e autofagia. Após 24 h de tratamento com YC, o nível da proteína de p-AMPK foi significativamente aumentada, e o nível da carboxilase de p-acetil-CoA (ACC), um alvo a jusante de AMPK, foi, subsequentemente, diminuiu de uma forma dependente da concentração (Fig 2A ). Uma vez que a activação da AMPK é um evento mais precoce [19, 20], a activação da AMPK por YC também foi monitorizado durante um curto período de tempo. O nível de p-AMPK foi medida até 8 h após o tratamento de YC (1 uM). O nível de proteína de p-AMPK foi significativamente aumentada após 2 horas de incubação de uma maneira dependente do tempo em células H1993 tratadas com YC cultivadas (Fig 2B). A activação da AMPK por YC foi ainda confirmada com o pré-tratamento do composto C (um inibidor específico da AMPK) ou metformina (um activador de AMPK). As células H1993 foram pré-tratados com o composto C (20 uM) ou metformina (10 mM) durante 1 h e, em seguida, co-tratados com YC (1 uM) durante um adicional de 2 h. Composto C suprimiu a expressão de AMPK activado (p-AMPK), mas o co-tratamento de YC recuperado a activação AMPK. Da mesma forma, YC, também aumentou significativamente a activação mediada por metformina de AMPK (Fig 2C). Além disso, YC activado eficazmente o nível de p-AMPK em várias linhas celulares de NSCLC (Figura 2D). Estas descobertas sugerem que a AMPK pode ser uma proteína alvo na actividade anti-proliferativa em células de YC NSCLC humanas.

H1993 (A) células foram tratadas durante 24 horas com as concentrações indicadas de YC e as expressões proteína eram medido por análise de Western blot. (B) H1993 células foram tratadas durante diferentes pontos de tempo curto com 1 uM de YC e as expressões proteína foram medidos por análise de Western blot. (C) H1993 células foram pré-tratadas durante 1 h com 20 ^ M de composto C, que é um conhecido inibidor de AMPK ou 10 mM de metformina, que é um activador de AMPK. Em seguida, 1 uM de YC foi tratada ou co-tratados durante 2 h, e as expressões de proteína foram medidos por análise de Western blot. (D) H358, H460, Calu-1, H1299, H1993 A549 e as células foram tratadas durante 2 h com 1 uM de YC e as expressões proteína foram medidos por análise de Western blot.

Efeitos de YC na via de sinalização de mTOR

é bem sabido que a AMPK mTOR regula negativamente a via de sinalização. Desde AMPK foi ativado por YC nas células H1993, que investigou também se YC também afeta via de sinalização mTOR. Descobrimos que YC regulada negativamente a activação de mTOR (p-mTOR (Ser2448)). Portanto, foram ainda determinados expressão de proteínas a jusante associada-mTOR. Desde YC não modular os níveis de proteínas relacionadas com mTORC1 tais como 4E-proteína de ligação 1 (4EBP1), tradução eucariótica fator de iniciação 4E (eIF4E), p70S6 cinase 1 (p70S6K1), e proteína ribossomal S6 (RPS6) (Fig 3A) , YC foi ainda analisada por efeito sobre outro complexo mTOR, mTORC2, um modulador de organização do citoesqueleto de actina. Como resultado, YC suprimida mTOR na autofosforilação Ser2481, um biomarcador molecular para a actividade mTORC2 (Fig 3B). Para investigar se a actividade mTORC2 YC inibida por afectar a associação de mTOR com rictor, rictor foi imunoprecipitada a partir de células tratadas com YC, e anticorpos de mTOR e rictor foram detectados por imunotransf erência, respectivamente. Como mostrado na Fig 3C, YC interrompido a associação de mTOR e rictor, e estes eventos subsequentemente suprimiu a activação dos alvos a jusante associada-mTORC2 incluindo Akt, proteína alfa quinase C (PKC-α), cicloalquilo C3 a toxina botulínica substrato relacionadas com ras 1 (Rac1), e a actina filamentosa (F-actina) por tratamento YC (Fig 3B). YC também activada a expressão de uma molécula de adesão celular E-caderina, um regulador negativo de F-actina em células H1993 (Figura 3B). O efeito supressor de YC na expressão de actina F foi também confirmada por análise imunocitoquímica (Figura 3D), sugerindo que a YC inibe eficazmente a organização do citoesqueleto de células NSCLC. Estes resultados são consistentes com a observação de alterações morfológicas celulares com o tratamento de YC nas células H1993.

H1993 (A) células foram tratadas durante 24 h com concentrações indicadas de YC e as expressões de sinalização relacionados com mTORC1 proteínas foram medidos por análise de Western blot. (B) H1993 células foram tratadas durante 24 h com concentrações indicadas de YC e as expressões de proteínas relacionadas com a sinalização mTORC2 foram medidos por análise de Western blot. (C) A interacção de mTOR e rictor foram analisadas por imunoprecipitação dos rictor com os seguintes imunoblots de lisados ​​de células (painel inferior) e imunoprecipitados (painel superior) com os anticorpos indicados. IP: imunoprecipitação. (D) H1993 células foram tratadas durante 24 horas com as concentrações indicadas de YC e a expressão de F-actina foi medida por imunocitoquímica.

Efeitos de YC na invasão e migração

é bem conhecido que a acumulação assimétrica de F-actina está associado com a invasão de células e a migração. YC suprimiu a expressão de F-actina em células NSCLC. Portanto, avaliou-se ainda mais o efeito de YC na invasão de células de cancro e a migração. O tratamento de YC durante 24 h inibiu a migração de células cancerosas em um ensaio de ferida de cicatrização de uma forma dependente da concentração (Fig 4A). Além disso, o ensaio de invasão de Matrigel foi realizada para estudar se YC influencia a capacidade de invasão de células cancerosas malignas. YC impedido células cancerosas de se mover para uma câmara de Matrigel em uma maneira dependente da concentração (Figura 4B). Estes dados sugerem que a YC inibiu eficazmente a migração e a invasão de células cancerígenas, que é em parte associada com a supressão da organização do citoesqueleto de actina via a regulação negativa da F-actina e a regulação positiva da expressão de E-caderina.

(A) células H1993 foram incubadas numa placa de 12 poços durante 24 h, feridos com uma ponta amarela, e tratou-se com as concentrações indicadas de YC. Após incubação durante 24 h, as células foram fotografadas usando um microscópio de contraste de fase. (B) H1993 células foram tratadas durante 48 h com as concentrações indicadas de YC. O ensaio de invasão de células foi realizada em um sistema de câmara de Matrigel-revestidas, como descrito em Materiais e Métodos.

Os efeitos anti-proliferativos com a combinação de agentes quimioterapêuticos para o cancro

Examinámos o efeito mais de YC em combinação com gefitinib ou rapamicina sobre a proliferação de células H1993. Diversos estudos relataram os efeitos benéficos da combinação de gefitinib, um inibidor de EGFR, com inibidores de mTOR no modelo pré-clínico. Neste estudo, a combinação de CA com gefitinib exibidos os efeitos inibidores sinérgicos significativos sobre as células H1993 (Figura 5A). Além disso, a combinação de rapamicina (um inibidor mTORC1) e YC inibiu eficazmente a proliferação celular de células H1993 em comparação com a rapamicina por si só (Fig 5B). Sabe-se que os blocos de rapamicina mTORC1 e não inibe mTORC2. inibição mTORC1 sem suprimir mTORC2 pode ativar PI3K /Akt e promover a sobrevivência do tumor. Portanto, este resultado sugere que a inibição do crescimento de YC combinação com rapamicina pode ser devido à regulação negativa do mTORC2 por YC.

As células foram tratadas com YC sozinho ou em combinação com gefitinib ou rapamicina durante 48 h . A proliferação celular foi medida utilizando um ensaio de SRB. (A) YC em combinação com gefitinib (B) YC em combinação com rapamicina.

Efeito inibidor do crescimento do tumor por YC no modelo de murganho de xenoenxerto de células H1993 implantado

O anti- tumoral dos YC foi avaliada utilizando um

In vivo

células H1993 modelo de rolamento do rato de xenotransplante nus. Quando o volume do tumor atingiu cerca de 90 milímetros

3 depois de implantado com as células H1993, YC (0,5 ou 1 mg /kg de YC) ou gefitinib (10 mg /kg) foi administrado oralmente a ratinhos, uma vez por dia durante 21 dias. O volume do tumor no grupo de controlo tratado com veículo foi de aproximadamente 750 milímetros

3 em 30 dias após o que as células foram implantadas subcutaneamente na região do flanco direito de cada ratinho. Em comparação com os grupos de controlo tratados com veículo, YC inibiu significativamente o crescimento do tumor em 33,4% e 38,8% a 0,5 mg /kg e 1,0 mg /kg, respectivamente, no final das experiências (Fig 6A). Os pesos dos tumores foram também significativamente inibida pelo tratamento de YC (Fig 6B). Resultados similares foram observados no tratamento de gefitinib (10 mg /kg). Não há alterações no peso corporal e toxicidade patente foram encontrados em

in vivo s.c.

experimentos com YC (Fig 6C).

H1993 células (A) foram injetados para os flancos de ratinhos nus e os tumores, e foram deixadas a desenvolver durante 21 dias. Quando chegaram cerca de 90 milímetros

3, foram iniciadas as concentrações indicadas de YC. Todos os medicamentos em estudo foram administrados oralmente uma vez por dia durante 21 dias. Os tamanhos dos tumores foram monitorizados a cada 4 a 6 dias. (B) O volume eo peso de cada xenoenxerto tumor foram medidos no final da experiência no dia 21. (C) Animais no controle e grupos tratados foram pesados ​​a cada 4 a 6 dias. O peso corporal médio de cada grupo é apresentado.

Além disso, uma análise bioquímica dos tecidos tumorais também confirmado a activação da AMPK pelo tratamento de YC utilizando Western blot (Figura 7A) e análise imuno-histoquímica (Figura 7B) de um modo dependente da dose. YC também exibiram a inibição da expressão dos marcadores de proliferação Ki-67 (figura 7C) e o antigénio nuclear de proliferação celular (PCNA) (Figura 7D) em tecidos tumorais. Estes dados sugerem que a YC eficazmente suprimido o crescimento do tumor de células H1993 o

in vivo

, e a sua actividade anti-tumoral pode em parte ser relacionado com a activação da via de sinalização de AMPK.

A proteína extractos foram obtidos a partir de tecidos tumorais H1993 modelo de xenoenxerto. As expressões de AMPK (A) foram medidos por análise de Western blot. (B) A expressão de p-AMPK foi medida por imuno-histoquímica. (C) A expressão de Ki-67 foi medida por imuno-histoquímica. (D) A expressão PCNA foi medida por imuno-histoquímica.

Discussão

Os produtos naturais têm sido desempenhado um papel importante na descoberta e desenvolvimento de medicamentos [21]. Em particular, terrestres produtos naturais à base de plantas têm sido fontes valiosas de agentes terapêuticos. Yuanhuacine (YC), um diterpeno daphnane, é um componente princípio das flores de

Daphne genkwa

. Estudos recentes do nosso grupo e outros relataram os fortes efeitos anti-proliferativa de YC contra várias linhas celulares de cancro [8, 22-24]. Um mecanismo plausível inclui o direccionamento dos complexos de ADN-topoisomerase, e YC é considerado como um agente danificador de ADN [25]. YC também mostrou a indução de G2 /M do ciclo celular fase prisão nas células da bexiga e cancro do cólon humano [26]. No entanto, o mecanismo molecular preciso de YC na actividade anti-cancro do pulmão de células cancerosas humanas, em especial, o crescimento de células NSCLC manteve-se a ser elucidados. Este estudo demonstra que YC regula a AMPK /via de sinalização mTOR e inibe a actina organização do citoesqueleto em células de câncer de pulmão H1993 humano.

Estudos recentes revelaram que AMPK /mTOR vias de sinalização estão fortemente ligados na regulação do crescimento de células cancerígenas, a proliferação e sobrevivência. Em particular, a activação de AMPK regula negativamente o crescimento das células cancerosas através de vias de sinalização a jusante de mTOR [26]. compostos De fato, muitos produtos naturais derivados incluindo galegine de

Galega officinalis

[27], o resveratrol a partir de uvas vermelhas, quercetina presente em muitas frutas e legumes, ginsenoside de

Panax ginseng

, a curcumina a partir de

Curcuma longa

, berberina de

Coptis chinensis

, epigalocatequina galato de chá verde, theaflavin de chá preto [28], e hispidulina de neve lótus [29] têm demonstrado a atividade anticancerígena pela ativação de vias AMPK. No presente estudo, também descobrimos que YC ativa eficazmente a AMPK e regula negativamente as vias de sinalização associadas ao mTORC2. A activação da AMPK por YC foi encontrado para ser ocorreu em um evento precoce em que as células H1993 e a activação da AMPK também foi confirmada por co-tratamento com um inibidor de AMPK (composto C) ou um activador (metformina). Estes resultados sugerem que a actividade anti-proliferativa de YC é, em parte associada com a activação de AMPK nas células NSCLC humanas.

AMPK exibe muitos alvo a jusante, tais como ACC, mTOR, p-p53, e COX 2 em células cancerosas.