Abstract

microRNAs soro são uma grande promessa como biomarcadores facilmente acessíveis e mensuráveis da doença. No cancro da próstata, assinaturas de miARN soro têm sido associados com a presença da doença, bem como correlacionada com modelos de risco previamente validados. No entanto, não está claro se miRNAs pode fornecer informações prognóstico independente para além de modelos de risco atuais. Aqui, vamos nos concentrar em um grupo de pacientes com câncer de próstata de baixo risco que eram elegíveis para a vigilância ativa, mas escolheu a cirurgia. Um dos principais critérios para a categoria de baixo risco é uma pontuação de Gleason de 6 ou inferior com base na biópsia pré-operatória. No entanto, um terço destes pacientes são atualizados para Gleason 7 na pós análise patológica cirúrgico. Tanto em uma descoberta e uma coorte de validação, descobrimos que os níveis séricos pré-cirúrgicos de miR-19, miR-345 e miR-519c-5p pode ajudar a identificar esses pacientes, independentemente da sua idade pré-cirúrgica, PSA, palco, e por cento envolvimento biópsia. Uma combinação dos três miARNs aumento da área sob uma curva de características de operação do receptor 0,77-0,94 (

P

0,01). Além disso, quando combinado com o modelo de risco Capra o assinatura miARN melhorada significativamente predição de pacientes com doença de Gleason 7. In situ hibridações de tumores correspondentes mostrou miR-19 supra-regulação de transformada contra epitelial com aparência normal de tumor, mas independente do grau do tumor, sugerindo uma fonte alternativa para o aumento no soro miR-19a níveis /B ou a libertação dos pré-existente intracelular miR -19a /b mediante a progressão. Em conjunto, estes dados mostram que miARNs soro pode prever relativamente pequenos passos na progressão tumoral, melhorando a capacidade para prever o risco de doença e, por conseguinte, potencialmente conduzir as decisões clínicos em doentes com cancro da próstata. Será importante para validar estes resultados em um maior estudo multi-institucional, bem como com as metodologias independentes

Citation:. Wang SY, Shiboski S, Belair CD, Cooperberg MR, Simko JP, Stoppler H, et al . (2014) miR-19, miR-345, os níveis séricos miR-519c-5p Predict Patologia adverso na próstata pacientes com câncer elegível para o Active Surveillance. PLoS ONE 9 (6): e98597. doi: 10.1371 /journal.pone.0098597

editor: Fabio Martelli, IRCCS-Policlinico San Donato, Itália |

Recebido: 12 Agosto, 2013; Aceito: 05 de maio de 2014; Publicação: 03 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde R21 CA161615 e uma doação privada por John e Donna Shoemaker. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Enquanto -screening antígeno específico da próstata (PSA) diminuiu as taxas de mortalidade CaP em os EUA, que tem feito até ao custo de detecção de fase /série início CaP que pode não afetar a vida de um paciente, se não tratada (overdiagnosis) [1] – [4]. Tratar as pessoas com doença de baixo risco resulta em morbidades desnecessários associados com intervenções radicais como a cirurgia ou radioterapia (overtreatment) [5].

A vigilância activa (AS) é uma estratégia desenvolvida para reduzir o tratamento de pacientes com baixo risco CaP. Tais pacientes são monitorados com exames físicos, imagem latente seletiva, avaliações de PSA de série, e biópsias repetidas. O tratamento é então oferecido para aqueles com sinais de progressão. Os candidatos para os protocolos de vigilância activa incluem aqueles com um grau de biópsia Gleason de 6 ou menos (sem padrão 4 ou 5), de PSA de 10 ng /ml ou menos, e fase T1 ou T2 doença [6]. Embora as evidências a partir de múltiplas instituições sugere que AS é uma opção viável para os homens com baixo risco CaP, existem taxas de erro de classificação consideráveis ​​na identificação de candidatos para AS [6], [7]. Em um estudo de pacientes com critérios para AS, mas submetidos à prostatectomia radical imediata de 28% foram encontrados para ter um maior grau de Gleason e 21% foram encontrados para ter a doença T3 em patologia cirúrgica [8].

Vários modelos de risco destinam para prever patologia pós-cirúrgico em pacientes de baixo risco, utilizando características clínicas, tais como idade, PSA, estágio, extensão do envolvimento do tumor dentro de biópsias foram desenvolvidos. No entanto, eles demonstram uma precisão de apenas 61-79% complicando a tomada de decisões [9]. Devido às limitações do PSA como um substituto para a progressão da doença e legítimas preocupações significativas sobre erros de amostragem da biópsia, os pacientes e os médicos temem que o tratamento tardio compromete a capacidade de curar a doença [10]. marcadores novos que distinguem de forma confiável entre baixo risco versus doença intermediário /alto risco seria uma solução para otimizar AS protocolos.

A evidência crescente sugere microRNAs (miRNAs) marcadores como potencialmente promissores para várias doenças malignas [11]. Estas pequenas moléculas de RNA, de cadeia simples, não codificantes estão envolvidos na regulação de genes pós-transcricional e tem um perfil de expressão alterada no tecido CaP [12] – [14]. Além disso, miARNs detectados no soro foram usadas para identificar pacientes com CaP, sugerindo o seu potencial como parte de um painel de marcadores de soro à base de [15], [16]. Anteriormente, foi utilizado um multiplex quantitativa da transcriptase reversa da polimerase reação em cadeia microfluídico baseado em (qRT-PCR) método para identificar assinaturas de soro de miRNA em homens com CaP que se associam com o Cancer validado da Avaliação de Riscos da próstata (Capra) pontuação para a avaliação dos riscos [17 ]. No entanto, este estudo prévio não determinar se algum destes miRNAs poderia fornecer valor prognóstico independente. Portanto, aqui nós teve como objetivo identificar um miRNA assinatura soro que poderia subcategorizar pacientes pré-cirúrgicos com notas de avaliação de baixo risco para aqueles com maior ou menor risco de progressão. Devido ao longo período de acompanhamento necessário para identificar pacientes que clinicamente progresso e relativamente curto espaço de tempo em que, como tem sido, na prática, nós avaliamos a patologia pós-cirúrgica como um marcador substituto. Encontramos uma assinatura de três miRNA que poderiam predizer a doença patológica pior do que o previsto com base na biópsia pré-operatória. Propomos que uma tal assinatura tem o potencial para identificar um grande número de pacientes que não são susceptíveis de beneficiar da cirurgia (escore clínico ou seja baixo combinado com a ausência de uma assinatura miRNA positivo) imediato, embora tal conclusão aguarda uma maior inter-institucional estudo, com longo prazo de seguimento.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

soro e amostras de tecidos, bem como dados clínicos foram coletados entre 2002 e 2012. Todos os pacientes forneceram consentimento por escrito para ter suas amostras e dados clínicos ligados inclinadas para fins de pesquisa clínica e básica. O Comité de UCSF em Pesquisa com Seres Humanos aprovado o processo de consentimento. Para este estudo, todas as amostras e os dados foram de-identificados e, portanto, não exigem qualquer aprovação IRB adicional.

Design Estudo

O desenho do estudo seguiu o princípio da coleta da amostra prospectiva e retrospectiva avaliação cega (sonda) o projeto [18] e relatou seguindo as orientações OBSERVA [19]. Todas as amostras de soro foram recolhidas rotineiramente na altura da cirurgia, após a indução da anestesia, mas antes de qualquer intervenção processual e armazenado a -80 ° C até à sua utilização. -Fixados em formalina,-embebidos em parafina (FFPE) blocos de tecido de prostatectomia radical foram arquivados e disponíveis para análise.

Os pacientes incluídos no estudo foram os que optam pela prostatectomia radical imediato que preencheram os critérios de baixo risco UCSF para AS, incluindo biópsia Gleason 2-6 (nenhum padrão 4 ou 5), PSA inferior a 10 ng /ml, menos de 34% de núcleos de biópsia envolvidos, menos do que 50% em qualquer envolvimento de um só núcleo, e doença fase T1-T2 clínica. Uma pontuação patológico de Gleason de 7 de elevada está associada com um risco aumentado de mortalidade CaP [20] e, por conseguinte, foi utilizada para definir patologia adversa. A coorte descoberta consistiu de 48 pacientes com uma pontuação de Gleason patológica pós-cirúrgico de 7 ou superior (grupo caso) e 48 pacientes com uma pontuação patológico de Gleason de 6 (grupo controle). A coorte de validação consistiu de 25 casos e 35 controles. Os pacientes foram escolhidos a partir de amostras disponíveis mantidos em um banco de tecidos UCSF. critérios de montagem pacientes acima foram selecionados a partir da piscina disponíveis com base em um gerador de número aleatório. Um diagrama esquemático do desenho do estudo é ilustrada na Figura 1.

Microfluidics multiplex com base de perfis de qRT-PCR miARNs

Um método de qRT-PCR em multiplex-microfluidos com base foi usada para detectar miARNs como previamente descrito [17]. foram utilizadas bibliotecas de primers 672 haste-laço, primers para a frente, e sondas Taqman representando sequências miRNAs humanos mais conhecidos (as sequências em https://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols/miRNAqPCRsequences.txt). Cada matriz de microfluidos avaliados quanto à expressão de 96 miARNs para 96 ​​amostras. Um total de 7 matrizes foram realizados na descoberta coorte (672) ensaios de miARN. Uma matriz foi realizada na coorte de validação focando apenas aquelas miARNs detectados (ver abaixo) na coorte de descoberta.

parcelas de amplificação e de ciclo limiar (Ct) valores, uma medida do número de ciclos de PCR para alcançar um a linha de limiar definido dentro da fase exponencial de amplificação, foram obtidos a partir de software proprietário no sistema BioMark (Fluidigm). Um Ct elevada reflecte inferior de entrada de miARN medido. Os valores Ct foram confirmadas através da análise de lotes de amplificação de qualidade. MiRNAs com um elevado valor de Ct (Ct 30) na 70% das amostras foram consideradas sem ser detectado e excluídos da análise. A normalização foi realizada para o valor da mediana do Ct de todos os miARNs detectados dentro de uma matriz para cada paciente individual, resultando em um valor ΔCT (Tabelas S1-2). A normalização foi realizado para conta para variações sistemáticas nos níveis de expressão de miRNA em todo os indivíduos e as matrizes, de modo que as diferenças biológicas podem ser mais facilmente distinguidos [21]. No entanto, a análise dos dados da ONU normalizada, controlados por quantidade de soro de entrada levou a conclusões análogas. A identidade das amostras foi mascarado até os valores ΔCT foram obtidos.

Análise Estatística

distribuições As análises iniciais comparação de valores ΔCt normalizados de miRNAs entre casos e controles na amostra descoberta usando resumos gráficos ea Wilcoxon teste da soma de classificação para avaliar a significância. Modelos de regressão logística foram então montado miRNAs candidatos individualmente, o ajuste para idade, PSA, palco, eo grau de envolvimento biópsia incluindo por cento núcleos tumor positivo e por cento do comprimento total de núcleos envolvidos. miRNAs candidatos foram incluídos em modelos tanto como medidas contínuas, e como variáveis ​​categóricas binárias. Os valores-limite para estes últimos foram determinados usando modelos de árvore de classificação separadas ou pela mediana para cada miRNA. Ambos os pontos de corte deu resultados semelhantes.

desempenho de previsão dos modelos foi distinguido usando receiver operating área característica (ROC), sob a valores curva (AUC). Uma análise separada com base em um modelo de classificação Floresta aleatória [22] Também foi realizado incluindo todos os miRNAs detectáveis, bem como a idade, PSA, estágio e grau de envolvimento biópsia como preditores. Os resultados desta análise foram usadas para fornecer uma avaliação independente de importância variável, e para confirmação dos resultados de modelos logísticos simples

Para a coorte de validação, apenas os miARNs que foram detectados em . 30% de as amostras na coorte descoberta foram medidos. Normalizando a todos os miRNAs detectados são executados em uma única matriz mudou a amplitude ofΔCt valores para um determinado miRNA, melhorando muitas vezes diferenças entre casos e controles. abordagens analíticas descritas acima para a descoberta foram similarmente aplicado na coorte de validação. análises finais focada em miRNAs detectado como preditores significativos na coorte de descoberta que também foram significativas no conjunto de validação. Somente marcadores com ajustado

foram considerados p

-Valores (com base em métodos de taxa de descoberta de falsas) de, no máximo, 0,1 em análises Discovery. Estas foram modeladas individualmente e em conjunto a modelos de regressão logística também controladores para as mesmas características consideradas nas análises para a coorte de descoberta. Além disso, investigou-se a utilização de miARNs seleccionados para complementar a marcar Capra bem validado [23] como um índice de risco de doença, tal como descrito em mais detalhe nos resultados.

análises descritivas adicionais foram realizadas para comparar paciente seleccionado características entre a descoberta e validação coortes. teste formal foi baseado no teste Exato de Fisher (para características categóricas) eo teste de soma de postos de Wilcoxon (para características quantitativas).

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando-R (versão 3.02) e Stata (versão 13.1).

hibridizações in situ

Slides com seções (5 mm) de amostras tumorais FFPE da coorte de paciente foram desparafinados em xileno e hidratados através da diminuição das concentrações de etanol em PBS. As lâminas foram então tratadas com 300 ul de proteinase-K (15 ug /ml em tampão de PK, 5 mM Tris-HCl pH 7,4, EDTA 1 mM, NaCl a 1 mM) a 37 ° C num hybridizer (Dako) durante 10 minutos . Após duas lavagens com PBS, as secções foram desidratadas através de concentrações crescentes de etanol e durante 15 minutos, secou-se ao ar. ácido (LNA) sondas bloqueadas-Duplo nucleico marcada com DIG (Exiqon) para miARNs individuais foram desnaturadas por aquecimento a 90 ° C durante 4 minutos e depois diluída para 40 nM em tampão, utilizando hibridação in situ (Enzo Life Sciences). As secções foram hibridizadas com 50 ul de sonda diluída a 54 ° C durante a noite, em seguida lavou-se em concentrações decrescentes SSC à temperatura de hibridação. Após uma incubação de 5 minutos em 0,2x SSC à temperatura ambiente, as lâminas foram lavadas em PBS e bloqueadas com 2% de solução de bloqueio (Roche) durante 15 minutos. As secções foram depois tratadas com a fosfatase alcalina (AP) -conjugated anti-DIG (Roche) diluído em solução de bloqueio 1:800 contendo 2% de soro de ovelha durante 60 minutos. Após duas lavagens em tampão de AP (Tris 100 mM pH 9,5, MgCl2 50 mM, NaCl 100 mM, 0,1% de Tween-20, levamisole 2 mM), as secções foram incubadas em BM roxo AP substrato (Roche) no escuro a 4 ° C durante a noite. As lâminas foram então lavadas duas vezes em PBS contendo 0,1% de Tween-20 e lavadas duas vezes em água. Após um segundo tratamento com 30 vermelho Nuclear Fast-(Vector), os slides foram desidratados embora concentrações crescentes de etanol, em seguida, montado. As lâminas coradas foram avaliados e classificados cegamente.

Resultados

profiling Mirna em Discovery Cohort

O objetivo foi determinar se miRNAs de amostras de soro pré-cirúrgicos poderia prever pós-cirúrgica atualização patológico. As características clínicas dos pacientes de nossa coorte descoberta estão resumidos na Tabela 1. Case (pós-cirúrgico Gleason 7) e controle (pós-cirúrgico Gleason 6) grupos tiveram distribuições semelhantes de raça e características clínicas. Casos eram significativamente mais velhos do que os controles (

p

= 0,005). Os níveis de PSA eram também ligeiramente mais elevados nos casos (

p

= 0,07). Dos 672 miARNs testados, 36 tinham Ct 30 em, pelo menos, 30% dos pacientes, o que estabelecidas como ponto de corte de detecção (Tabela 2). Existem muitos miARNs como aglomerados, onde dois ou mais miARNs são produzidos a partir de um único transcrito. Nove dos 36 miRNAs são membros de um único cluster, o cluster miR17-92. MiRNAs também são agrupadas em famílias com base em uma sequência comum na sua extremidade 5 ‘a sequência de chamada semente, que define, em grande parte os seus alvos a jusante [24]. miR-17, miR-20a, miR-92a e miR-106a, por exemplo, são todos parte de uma família. Portanto, em todos esses pacientes APC, houve um enriquecimento aparente para grupos e famílias de miRNAs específicos.

A seguir, comparou os níveis séricos da 36 detectado miRNAs entre os grupos caso e controle da coorte descoberta. Quatro dos miRNAs detectados demonstraram diferenças nos níveis séricos entre os casos e controles. MiR-19a e miR-19b exibido valores ΔCt inferiores no grupo de casos em relação aos controles (Figura 2A,

p

= 0,06 e

p

= 0,07, respectivamente), consistentes com níveis séricos mais elevados no casos. Por outro lado, miR-345 e miR-519c-5p tinham valores ΔCt significativamente maior no grupo caso quando comparados com os controles (Figura 2a,

p

= 0,04 e

p

= 0,02, respectivamente) , consistente com os níveis séricos mais baixos no grupo caso. Modelos de regressão logística para predizer o estado caso /controle baseado em miRNAs individuais representados como indicadores binários (com valores de corte selecionados usando árvores de classificação) mostrou todos os quatro miRNAs como preditores altamente significativos de status de resultado (odds ratio) mesmo quando controlando para idade, PSA , estágio clínico e grau de envolvimento biópsia (Tabela 3). Os resultados não foram sensíveis para se miARNs foram incluídos em modelos de previsão de como variáveis ​​contínuas ou como indicadores binárias com base em níveis detectáveis ​​mediana (dados não mostrados). Um classificador Floresta aleatória não paramétrico, incluindo todos os miRNAs detectáveis ​​(representados como medidas contínuas), bem como a idade, PSA, palco, e envolvimento biópsia classificou as seguintes variáveis ​​de previsão como as seis mais importantes (em ordem decrescente): idade, miR-519c-5p , miR_19b, miR-345, PSA e miR_19a (Figura 3). Nenhum dos outros miRNAs medidos foram significativamente associados com status de resultado.

Delta Ct representa a diferença entre o Ct de miRNA individual e valor Ct média entre miRNAs detectados dentro de cada paciente. As barras horizontais representam a média +/- SEM.

variáveis ​​incluídas estão listados no eixo vertical, com a correspondente importância variável para cada no eixo horizontal, a importância é determinado usando “precisão permutação condicional”, calculado como um a diferença média de precisão do modelo entre o modelo equipada e versões alternativas obtidos via permutações aleatórias dos valores das variáveis. Variáveis ​​são consideradas preditores significativos na floresta aleatória se o seu valor importância variável está acima do valor absoluto da variável menor pontuação negativa [43].

Validação da assinatura miRNA na coorte independente

Para confirmar nossas associações de miRNA, foi realizado um estudo de validação se concentrar apenas sobre os miRNAs que estavam medida em pelo menos 30% das amostras de soro dos pacientes (Tabela 2). As características dos pacientes para a coorte de validação são resumidos na tabela 1. Semelhante ao coorte descoberta, não houve diferenças estatisticamente significativas na raça ou estágio clínico entre casos e controles, enquanto que as diferenças de idade e PSA foram significativas (

p

= 0,002 e 0,04, respectivamente). Como pode ser visto na coorte de descoberta, o miR-19b e miR-19a mostrou valores significativamente mais baixos ΔCt no grupo de casos em comparação com os controlos (Figura 2B). Na verdade, as diferenças foram ainda mais impressionante na coorte de validação (

p Art 0,001 para ambos), provavelmente devido à normalização com base em todos os miRNAs detectado em uma única matriz (versus espalhados por várias matrizes em coorte de descoberta) . Em contraste com o miR-19b e miR-19a, as diferenças nos valores ΔCt para miR-345 e miR-519c-5p entre os casos e os controlos não foram estatisticamente significativas (Figura 2b,

P

= 0,333 e

p

= 0,154, respectivamente). No entanto, nos modelos de ajuste para a idade e o PSA, o miR-345 e miR-519c-5p permaneceu significativa quando incluído como preditores binários (ver abaixo). Os resultados de análises, incluindo miR-519c-5p foram baseadas em 55 pacientes (24 casos e 31 controles) devido a valores ausentes para esta variável resultante de reações de PCR falhadas em 5 pacientes.

Valor prognóstico de três miRNA assinatura

para avaliar a capacidade dos miRNAs confirmados para discriminar pacientes com a patologia adversa no conjunto de validação, eles foram incluídos em modelos de regressão logística também o ajuste para idade, estágio, PSA e grau de envolvimento biópsia. Quando considerados individualmente, todos os quatro miRNAs mostrou fortes associações com estatuto de caso, com odds ratio de 9,22, 12,67, 0,03 e 0,06 (

p

valores 0,01) (Tabela 3), apesar de, devido à amostra relativamente pequena tamanho, intervalos de confiança para razões de chances estimadas apresentaram baixa precisão. Estes miRNAs individualmente também mostraram melhor capacidade discriminatória com AUC de 0,85, 0,86, 0,84, e 0,83 em relação a uma AUC de 0,77 para um modelo incluindo apenas a idade, PSA, palco, e envolvimento biópsia (Tabela 3). Essas melhorias não atingiu significância ao nível de 5% (embora os resultados para miR-19b e miR-345 foram significativos ao nível de 10%). Em seguida, avaliamos modelos usando diferentes combinações dos miRNAs (Tabela 4). Notavelmente, o miR-19a e miR-19b parecia ser co-dependente, consistente com o facto de que eles são expressos a partir de uma transcrição comum, o miR-17-92. Modelos que consistem de uma combinação quer de miR-19a ou miR-19b em conjunto com o miR-345 e miR-519c-5p mostrou uma AUC de 0,94, atingindo significância elevada (

P

= 0,02 e 0,017, respectivamente) (Tabela 4 e Figura 4a).

A) curvas ROC para a idade, PSA, e estágio mais /menos miRNAs individuais ou a combinação de todos os 3 miRNAs. B) Percentagem dos pacientes com Gleason 6 (cinza claro) ou Gleason 7 (cinza escuro) pós-operatório em relação ao pré-operatório pontuação CAPRA. C) O mesmo que B, mas com adição de miARN. Um valor de 1 é dada para cada miRNA positivo e adicionado à pontuação CAPRA. CAPRA nomograma combina as seguintes variáveis: idade no momento do diagnóstico, PSA no momento do diagnóstico, a pontuação de Gleason de biópsia pré-operatória, estágio clínico, e por cento de biópsias envolvidos

A fim de identificar uma pontuação. mecanismo acessível para os médicos e seus pacientes, foi avaliada a utilidade de adicionar valores miRNA a um modelo de risco estabelecida, o CAPRA marcar [23]. Notavelmente, nossa coorte apresentaram escores Capra baixos (variando de 0-2 em 10) como se espera para os pacientes AS-elegíveis. Ao adicionar um ponto a pontuação para cada uma das três miRNAs (miR-19a ou 19b, miR-345 e miR-519c-5p) que foi observada a exceder o valor de corte binário, os pacientes poderiam ser separados em aqueles propensos a ter Gleason 7 e, consequentemente, do risco de doença intermediário versus aqueles que não o fez (Figuras 4b-C). A tendência linear foi altamente significativa (

p Art 0,001). De fato, 100% dos pacientes com uma pontuação de 4 ou 5 tinham doença Gleason 7 pós-cirurgicamente versus 7 fora de 24 dos pacientes com pontuação de 1 ou 2.

Origem do miRNAs soro

os miARNs soro descobertas podem surgir directamente a partir do tumor ou da resposta do organismo ao tumor. A fim de determinar se os miARNs preditivos estão presentes em tumores da próstata, foi realizada hibridações in situ com sondas para miR-19b em amostras tumorais FFPE de pacientes em nossa coorte (

N

= 10). Estamos focados em miR-19b, uma vez que atingiu significância em ambos os de descoberta e validação conjuntos. Note-se que a sonda de miR-19b é improvável para discriminar entre o miR-19a e miR-19b, devido às suas sequências altamente semelhantes. A coloração para miR-19b era forte em áreas de PIN de alto grau, Gleason 3, e padrão de Gleason 4, mas ausente no epitélio aparecendo normal (Figura 5). No entanto, não houve nenhuma diferença óbvia na intensidade de coloração com o aumento do grau de PIN para Gleason 4. Por conseguinte, enquanto o miR-19 níveis celulares aumentaram claramente com a transformação, não ficou claro se houve qualquer aumento adicional no interior das células com a progressão patológica.

Imagens mostram na coloração hibridização in situ para miR-19b (esquerda e painéis centrais) e controle negativo, miR-295 (painéis da direita). Painéis superiores mostram a área da neoplasia intra-epitelial da próstata (PIN). painéis Média mostrar a área de Gleason 3. painéis de fundo área de Gleason 4. Áreas de PIN, Gleason 3 e 4 Gleason toda mancha fortemente para a sonda de miR-19b (coloração azul) mostram. Nota cada painel tem uma área do epitélio com aparência normal, mais claramente visto no lado esquerdo de cada painel central. Estas áreas apresentam coloração muito menor. painéis direito e esquerdo, 100 × ampliação. painéis centrais, 400 × ampliação. painéis centrais representam áreas em caixas em painéis esquerdo.

Discussão

Como reguladores pós-transcricional da expressão do gene, miRNAs atuam como oncogenes e supressores de tumor [25], [26]. assinaturas de miARN aberrante tem sido demonstrada em amostras de tumor da próstata e foram detectados no soro de homens com CaP [12] – [16], [27], [28]. Nós previamente identificada uma assinatura miRNA associado com o risco do paciente, conforme calculado por dezenas Capra, que prevêem metástases, mortalidade APC, e as causas de toda a mortalidade [17]. No entanto, nenhum desses estudos anteriores abordados se miRNAs poderia fornecer informações adicionais para além do que pode ser previsto pelos parâmetros atuais, incluindo PSA, de imagem e biópsia. Aqui, nós descobrimos e validados quatro miRNAs soro, miR-19a, miR-19b, miR-345 e miR-519c-5p que em combinação e quando adicionado aos parâmetros atuais, melhorou significativamente a previsão de patologia adversa dentro da próstata. Individualmente, apenas miR-19a /b alcançou significância em ambos os de descoberta e validação conjuntos.

Um modelo preditivo incluindo idade, PSA, palco, e envolvimento biópsia demonstrou um valor de AUC de 0,77 na identificação de patologia adversa no pós espécimes cirúrgicos, a adição de 3 miARNs (miR-19a ou 19b mais miR-miR-345 e miR-519c-5p) demonstraram um valor de AUC de 0,94. Além disso, a inclusão da assinatura miRNA em um escore de risco usado atualmente (Capra) melhorou a previsão de atualização pós-cirúrgica apoiando sua utilidade clínica. Estas melhorias são a primeira demonstração ao nosso conhecimento do valor preditivo independente para miRNAs no soro acima medidas clínico-patológicos atualmente disponíveis em um cenário altamente relevante. Enquanto quase 50% dos pacientes recém-diagnosticados agora cumprir os critérios de baixo risco para os protocolos AS, apenas 10% desses pacientes são submetidos AS [29], [30]. Tendo marcadores adicionais que podem segregar ainda mais pacientes será fundamental para melhorar esses números.

marcadores à base de soro são vantajosos como tais testes são relativamente não-invasivo e pode ser convenientemente utilizado para monitorar pacientes. Marcadores obtidos a partir do soro evitar preocupações de erro de amostragem de biópsia, a qual é uma limitação significativa de ensaios baseados em tecidos [31], [32]. As origens de miRNAs no soro humano permanecem em grande parte obscura. A hibridação in situ em amostras de próstata de pacientes na coorte demonstrou a presença de miR-19b em todas as áreas do epitélio transformado de PIN de grau elevado a 4 de Gleason padrão. Em contraste pouca ou nenhuma coloração foi visto no estroma ou epitélio com aparência normal. A presença do miR-19b no interior do tecido do tumor de baixo grau, mas níveis reduzidos no soro correspondente levanta a questão de a fonte de miARN no soro de pacientes com tumores de grau mais elevado. Uma possibilidade interessante é que o miR-19b é apenas segregada mediante a progressão mesmo que é expressa nas células transformadas cedo no desenvolvimento do tumor. Alternativamente, as células podem necessitar de romper os elementos estruturais no interior do tecido para miR-19b para atingir o sangue. Finalmente, os miARN pode derivar de resposta do organismo ao tumor (por exemplo, a resposta imunitária). Em resumo, as origens celulares para as alterações nos níveis de miARN no soro com a progressão patológica ainda não foi determinado.

miR-19 é uma parte do grupo de miARNs processados ​​a partir de um único transcrito, o miR-17-92 aglomerado [9]. Este cluster produz seis miRNAs maduros (miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b, miR-92) e está localizado no 13q31.3, uma região amplificada em hematopoiéticas múltipla e doenças malignas de tumores sólidos [ ,,,0],33] – [35]. Em um modelo de linfoma de células B, a sobre-expressão de

miR-17-92 com

c-myc

promove a formação de tumor, demonstrando a actividade oncogénica do cluster [35]. miR-19 parece ser um componente essencial de oncogénica

miR-17-92

alvejando o supressor de tumor,

Pten

, resultando na activação da via de Akt-mTOR [36], [ ,,,0],37]. Dado o papel bem documentado de

Pten

no câncer de próstata e que a alteração é encontrada em 30-70% dos pacientes no momento do diagnóstico, parece altamente provável que a elevação de miR-19a miR-19b visto no tecido está funcionalmente associado com o desenvolvimento de tumores [38] – [40]

Outros miARNs soro que diferem das que aqui foram descobertos encontrada em níveis elevados em doentes com cancro da próstata.. Um exemplo particularmente interessante é Mir-141, o qual tem sido mostrado a ser elevada em doentes com cancro da próstata com doença avançada, tais como em pessoas com linfonodo ou metástases ósseas [15], [27], [28]. Em nosso estudo, miR-141 não foi detectada em pacientes que preenchem os critérios de baixo risco para o AS. Portanto, apesar de miR-141 pode ser um marcador potencial para pacientes com PCA mais avançado, é pouco provável que tenha valor para os candidatos de AS decidir se submeter a tratamento radical. Para além do estado da doença, os resultados entre os estudos conflitantes pode também ser devido a variações entre os métodos de perfilamento miARN soro. Individuais protocolos baseados em qRT PCR e ensaios de microarray pode produzir diferentes assinaturas de miRNA. Embora atualmente não há padrão ouro para detecção de soro de miRNA, temos mostrado previamente que o nosso método qRT-PCR multiplex é preciso medindo os níveis de miRNA em sistemas knockout falta canónica ou ambos os miRNAs canônicos e não canônicos [17].

neste estudo, patologia adverso foi definido como uma pontuação de Gleason de 7 na amostra de pós-cirúrgicas. A pontuação de Gleason de 7 está associado com um risco aumentado de mortalidade específica da doença e continua a ser o melhor preditor único para o comportamento da doença [20]. No entanto, uma pontuação de Gleason de 7 não é uma garantia de futuro progressão clínica. Estudos recentes sugerem que mesmo os pacientes de risco intermediário com uma pontuação de Gleason de 7 demonstram excelente sobrevida em AS com curto para follow-up intermédio [41]. À medida que mais pacientes se inscrever no AS e dados de ensaios em curso amadurecer, os estudos deverão ser realizados para determinar se os miRNAs prever a metástase futuro ou mortalidade de doenças específicas. Além disso, estudos prospectivos serão necessários para determinar se eles são ferramentas valiosas para monitorar pacientes quando submetidos a AS.

Em conclusão, este estudo identifica um miRNA assinatura soro que pode atuar como um marcador de prognóstico independente em CaP. Além disso, como mostra miARNs soro pode ser usada para identificar relativamente pequenos passos na progressão tumoral, permitindo aumentar o refinamento do estado clínico da doença. Estudos futuros serão necessários para validar estes marcadores em uma grande coorte entre as instituições, bem como a associar com resultados a longo prazo, especialmente morbidade e mortalidade dos pacientes.