Sumário

O HMGA2 fator de transcrição arquitectónico é abundantemente expresso durante o desenvolvimento embrionário. Em várias neoplasias malignas, incluindo o cancro da próstata, alta re-expressão de

HMGA2

está correlacionada com a malignidade e mau prognóstico. O

let-7

família miRNA é descrito para regular

HMGA2

negativamente. O saldo de

let-7

e

HMGA2

é discutida a desempenhar um papel importante na etiologia do tumor. Para analisar o papel da HMGA2 no cancro da próstata de um estábulo e altamente reprodutível

in vitro

sistema modelo é pré-requisito. Aqui nós estabelecemos uma linha CT1258-EGFP-HMGA2 de células de câncer de próstata canina superexpressão de forma estável HMGA2 ligada a EGFP e, além disso a linha de células de referência CT1258-EGFP expressar apenas EGFP para excluir os efeitos induzidos pela EGFP. Ambas as linhas celulares recombinantes foram caracterizados através de microscopia de fluorescência, citometria de fluxo e imunocitoquímica. O efeito proliferativo dos HMGA2 ectopicamente overexpressed foi determinada através de ensaios de BrdU. cariotipagem comparativo da derivada e as linhas de células iniciais CT1258 foi realizada para analisar a consistência cromossoma. O impacto da ectópica

HMGA2

expressão em seu regulador

deixe-7a

foi analisada por quantitativa PCR em tempo real. A microscopia de fluorescência e imunocitoquímica detectada expressão bem sucedida da proteína de fusão de EGFP-HMGA2 acumulando exclusivamente no núcleo. análises de expressão de genes confirmados

HMGA2

superexpressão em CT1258-EGFP-HMGA2 em comparação com CT1258-EGFP e células nativas. Significativamente maior do

deixe-7a

níveis de expressão foram encontrados em CT1258-EGFP-HMGA2 e CT1258-EGFP. Os ensaios BrdU detectou um aumento da proliferação de células CT1258-HMGA2-EGFP em comparação com CT1258-EGFP e CT1258 nativa. As análises citogenéticas de CT1258-EGFP e CT1258-EGFP-HMGA2 resultou em um cariótipo hyperdiploid comparáveis, conforme descrito para as células CT1258 nativas. Para investigar mais o impacto da HMGA2 overexpressed recombinante em células CT1258, outros alvos selecionados descritos estar subjacente à regulação HMGA2 foram rastreados além. A nova linha de células CT1258-EGFP-HMGA2 fluorescente é uma ferramenta estável que permita aos

in vitro

e

in vivo

análises dos efeitos mediados por HMGA2 em células e o desenvolvimento e patogênese do câncer de próstata.

Citation: Willenbrock S, Wagner S, Reimann-Berg N, Moulay M, Hewicker-Trautwein M, Nolte I, et al. (2014) Geração e caracterização de um canino EGFP-HMGA2 do cancro da próstata

In Vitro

Modelo. PLoS ONE 9 (6): e98788. doi: 10.1371 /journal.pone.0098788

editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Áustria

Recebido: 17 de fevereiro de 2014; Aceito: 07 de maio de 2014; Publicação: 10 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Willenbrock et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. No terceiro fundos do partido apoiaram este estudo. O estudo foi financiado com o orçamento interno da Clínica de Pequenos Animais, Universidade de Medicina Veterinária de Hanover. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Com isto, os autores confirmam que Jörn Bullerdiek, um co-autor no prazo de publicações anteriores de colaboração, é um membro do PLOS ONE Editorial Board. Isto não altera a adesão dos autores para PLoS ONE políticas editoriais.

Introdução

De acordo com recentes estatísticas de câncer globais, o câncer de próstata é o segundo mais frequente de câncer diagnosticados e sexta maior causa de morte entre homens em países economicamente desenvolvidos [1]. Além do homem, o cão é as espécies de mamíferos domesticados conhecidos apenas desenvolver câncer de próstata espontâneo com considerável interesse [2].

Ao contrário da situação em homens, a incidência de carcinomas da próstata canina é baixa contábil de 0,2 a 0,6% do neoplasias caninas [3]. No entanto, a doença é localmente invasivo em ambas as espécies com uma progressão comparável, padrão metastático e histopatologia [2], [4].

A média de idade no momento do diagnóstico em cães é de dez anos e, portanto, afeta predominantemente indivíduos idosos como também é reportado em homens [5] – [7]. Considerando a idade fisiológica ao diagnóstico de câncer de próstata, o respectivo tempo de vida é semelhante entre as duas espécies que mostram aumento da incidência com a idade [6].

Nos seres humanos, o câncer de próstata é geralmente um câncer bastante lento-progredindo enquanto próstata canina câncer está crescendo rapidamente, altamente agressivo e menos diferenciada apresentando um mau prognóstico [3], [8]. O câncer de próstata canina não responde à terapia retirada de andrógeno assemelhando-se cancro da próstata em sua maioria humano pouco diferenciado, androgênio refratário [4], [9]. Devido às semelhanças relativas à apresentação de câncer de próstata humana e canina, o cão ultimamente tem sido focada como modelo animal complementar natural, útil para avaliar terapias contra o câncer de próstata novos [10].

A detecção precoce do câncer de próstata em homens é actualmente a ser feito usando estabelecida marcadores moleculares bioquímicos, como antígeno específico da próstata (PSA) e antígeno de membrana específico da próstata (PSMA), com considerável sucesso.

em comparação com a situação em humanos, no câncer de cães de próstata é diagnosticado em um muito fase tardia da doença, devido à ausência de ferramentas bioquímicas marcador prognóstico específicos da próstata fiáveis ​​e o tratamento paliativo permanece ainda desde nenhuma abordagem terapêutica padrão para o tratamento de cancro da próstata canina está disponível [11], [12]. Apesar de vários estudos relatam imunorreatividade para PSA humano no câncer de tecido da próstata e da próstata não-neoplásica canino, até agora a PSA não pôde ser encontrado no plasma de câncer de próstata rolamento cães [9], [12] – [16].

por conseguinte, a identificação de biomarcadores moleculares fiáveis, tais como PSA e PSMA em homens, permitindo uma detecção precoce e prognóstico fiável do cancro da próstata canina seria de valor significativo para o desenvolvimento e a avaliação das estratégias terapêuticas futuro, bem como a avaliação de resposta ao tratamento [2].

neste contexto, a proteína de alta-Mobility-Grupo A2 (HMGA2) foi encontrado recentemente para servir potencialmente como um marcador de prognóstico para as neoplasias prostáticas caninas [17]. Aqui, a análise de um subconjunto de diferentes amostras de tecido de próstata canina mostrou claramente que a expressão de

HMGA2

aumenta significativamente em correlação com o grau maligna das amostras de tecido [17]. Além disso,

HMGA2

foi encontrado para servir como um potencial marcador de diferenciação de T- maligna canina e linfoma de células B [18] e a ser fortemente regulada no carcinoma epidermóide de boca canina (dados não publicados).

nos seres humanos, uma re-expressão de

HMGA2

foi também encontrado em vários tumores malignos, tais como a leucemia [19], [20], linfoma [18], mamaria [21], pâncreas [22] , pulmão de não-pequenas células [23], de células escamosas oral [24], e carcinoma da tiróide [25] sendo um indicador de mau prognóstico. Em um estudo recente, a expressão da proteína HMGA2 foi demonstrado ser significativamente mais elevada em tecidos tumorais em comparação com tecidos normais adjacentes [26]. Além disso, um

HMGA2

envolvimento na indução de epitelial-mesenquimal-a transição (EMT) na linha celular de cancro da próstata humano PC-3 foi encontrado [26].

Estes resultados sugerem que HMGA2 desempenha um papel central em diferentes entidades tumorais, incluindo câncer de próstata dentro de ambas as espécies apoiar fortemente

HMGA2

re-expressão como um marcador tumoral prognóstico.

em geral, a proteína HMGA2 altamente conservada é abundantemente expressa durante o desenvolvimento embrionário agir como um fator de transcrição arquitectónico no núcleo [27], [28]. Dentro deste papel, HMGA2 é amplamente relatado para ser envolvido numa variedade de processos celulares, tais como a expressão do gene, a indução de transformação neoplásica, e promoção da metástase [29], [30].

A expressão de

HMGA2

é regulada por meio de micro-ARN (miARN) de o

let-7

família por ligação a sequências situadas na região não traduzida a 3 ‘(UTR) do transcrito [31] – [35], todos os quais são conservados em roedores, cão, e galinha [36] – [38]. A ligação do

let-7

miRNAs para sequências complementares regula pós-transcricionalmente a expressão de

HMGA Página 2 de uma forma negativa [31], [35], [39], [40]. Recentemente, um desregulamentado

let-7 expressão

foi associada com pulmonar [41], [42], de mama [43] e câncer de próstata [44].

A próstata canina adenocarcinoma derivado CT1258 linha celular [45] – [47] utilizado na presente estudo também foi analisado para

HMGA2

expressão do marcador por nós revelando uma superexpressão forte (dados não publicados). Este resultado permite a hipótese de que a sobre-expressão de um gene alvo esta é provavelmente a desempenhar um papel importante no cancro de próstata canina, promovendo a proliferação de células tumorais.

Para verificar esta hipótese, a disponibilidade de ferramentas estáveis ​​que permitem avaliar o descrito

HMGA2 Restaurant –

let-7 eixo

no câncer de próstata

in vitro

e

in vivo

é condição prévia. linhas de células, portanto, nós estabelecemos transfectadas estavelmente de CT1258 proporcionando um

in vitro

sistema confiável para analisar os principais aspectos da nossa hipótese.

Foram analisados ​​os efeitos proliferativos de abundantemente expressa recombinante

HMGA2

em células CT1258. Portanto, uma linha celular estável expressando CT1258 HMGA2 marcaram-EGFP recombinante (CT1258-EGFP-HMGA2) foi gerado usando uma construção de vector de expressão contendo a sequência codificadora (CDS) do canino

HMGA2

gene que falta o 5’UTR e 3? UTR e, portanto, não subjacente os mecanismos directos regulação negativa por

let-7

[31].

para avaliar a funcionalidade do vector de expressão recombinante e HMGA2 para monitorizar a actividade biológica de o recombinante expressa HMGA2, um GFP-tag foi adicionado a

HMGA2

CDS gerando uma proteína de fusão GFP-HMGA2. Para excluir que a proteína GFP tem um efeito sobre a proliferação celular, uma linha celular CT1258 mais estável (CT1258-EGFP) expressando GFP exclusivamente foi gerado. O

HMGA2

e

deixe-7a

expressão foi determinada via quantitativa PCR em tempo real em CT1258-EGFP-HMGA2 e CT1258-EGFP em comparação com células CT1258 nativas.

Além disso, a expressão de selecionados HMGA2-alvos directos e indirectos, tais como

HMGA1

[48],

SNAI1

[49],

SNAI2

e

CDH1

[49] foi analisado.

Para caracterizar a proliferação das três linhas celulares descritas, os ensaios de incorporação de BrdU foram realizadas. cariótipo análises comparativas do recém-gerado e as linhas de células CT1258 iniciais foram adicionalmente realizados para identificar alterações citogenéticas que ocorrem possivelmente durante a integração do plasmídeo no genoma de CT1258 durante o estabelecimento das linhas celulares recombinantes estáveis.

Em resumo, a nova linha de células CT1258-EGFP-HMGA2 canino fluorescente fornece uma ferramenta valiosa para futuras investigações sobre os efeitos de proliferação mediada por HMGA2 e mecanismos de regulação HMGA2 elucidando o desenvolvimento e patogênese do câncer de próstata canina. Como o cão representa um modelo natural único para o câncer de próstata humana, as informações acerca do envolvimento de HMGA2 no cancro da próstata canina irá fornecer o benefício para ambos, humanos e cães, relativa ao desenvolvimento de estratégias terapêuticas e a avaliação do sucesso do tratamento.

Métodos

linha celular CT1258

as condições de cultura de células, assim como as características do canino carcinoma da próstata linha celular CT1258 foram descritos anteriormente [45], [46 por nós ].

pEGFP-C1

HMGA2

Expressão plasmídeo

a proteína sequência do canino de codificação

HMGA2

foi amplificado por PCR utilizando o par de iniciadores EcoRI_sA2_lo ( 5′-CGGAATTCCTAGTCCTCTTCGGCAGACT-3 ‘), BamHI_sA2_Up (5′-CGGGATCCCACCATGAGCGCACGCGGT-3’). Os produtos de PCR obtidos foram separados num gel de agarose a 1,5%, recuperou com o QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha), ligado ao vector plasmídeo pEGFP-C1 (BD Bioscience Clontech, Palo Alto, CA, EUA) e sequenciados por verificação. A transfecção com pEGFP-C1

HMGA2

construir leva à expressão de uma proteína de fusão de EGFP-HMGA2 recombinante que está prevista para ser localizada no núcleo.

geração de linhagens de células fluorescentes CT1258

a transfecção de células CT1258.

300.000 células CT1258 nativas foram semeadas em placas de 6 poços, 24 horas antes da transfecção e cultivada em condições padrão, usando meio 199 (Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha) suplementado com 10% de FCS (PAA Laboratories GmbH, Cölbe, Alemanha), e 2% de penicilina /estreptomicina (Biochrom AG, Berlim, Alemanha).

a transfecção foi realizada de acordo com as instruções do fabricante usando 7,5 ul Mirus Transit-2020 reagente (Mirusbio LLC, Madison, WI, EUA) em 250 de meio Opti-MEM I em soro reduzido ul (Life Technologies, Darmstadt, Alemanha) contendo 2,5 ug de pEGFP-C1 (BD Bioscience Clontech, Palo Alto, CA, EUA) ou plasmídeo pEGFPC1-HMGA2 recombinante. Após o tratamento, as células foram incubadas durante 24 horas em meio de cultura. A captação e expressão de DNA foi verificada por microscopia de fluorescência utilizando um microscópio de fluorescência Leica DMI 6000B (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar Alemanha).

ensaio de curva de mortalidade antibiótico selectivo G418.

geração anterior do linhas de células fluorescentes CT1258, a titulação da quantidade apropriada do antibiótico selectivo G418 (geneticina; syn. Life Technologies, Darmstadt, Alemanha), necessários para a selecção de células CT1258 foi realizada com um ensaio de curva de mortalidade. Diferentes concentrações de G418 foram aplicados (0, 100, 200, 400, 600, 800, 1000 ng /ml) em 100.000 células nativas CT1258 semeadas em poços de uma placa de 12 poços. Para a seleção de células positivas após transfecção foi utilizada a concentração em que nenhuma célula sobreviveu às condições superiores após sete dias.

Seleção de células CT1258 transfectadas de forma positiva.

variantes fluorescentes da linha celular CT1258 foram estabelecido para expressar constitutivamente a proteína verde fluorescente melhorada (EGFP) codificada pelo plasmídeo pEGFP-C1 vazio e uma proteína de fusão de EGFP-HMGA2 por expressão recombinante do pEGFP-C1

HMGA2

plasmídeo. Para estabelecer linhas celulares estáveis ​​CT1258, as células transfectadas foram seleccionadas com o antibiótico G418 (Life Technologies, Darmstadt, Alemanha).

Inicialmente uma concentração de 400 ug /ml de G418 no meio foi usada ao seleccionar para estável células. Um dia após a transfecção, o meio de cultura 199 foi substituído com meio contendo G418 199. Subsequentemente, o meio de selecção foi mudado cada 24 a 48 horas durante as primeiras duas semanas, o que conduz à selecção de células que tenham incorporado de forma estável o plasmídeo de GFP com o gene de resistência à neomicina codificada de antibiótico para selecção em células de mamífero em seu DNA genómico. As células que não expressam a construção será morto por G418. A concentração de G418 foi reduzido para 300 ug /ml depois de três meses de selecção consistente para manutenção das linhas de células fluorescentes gerados.

microscopia de fluorescência e citometria de fluxo (FCM)

expressão da GFP do linhas de células fluorescentes CT1258-EGFP e CT258-EGFP-HMGA2 foi analisada após a G418-selecção por microscopia de fluorescência e quantificada num citómetro de fluxo FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company, Heidelberg, Alemanha) com o canal FL-1 para determinar a percentagem de As células positivas para GFP. As células foram tripsinizadas durante 3-5 minutos, ressuspensos em BD FACSFlow bainha de fluido (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, EUA) contendo 1 uM de TO-PRO-3 (Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha), e numa número total de 1 × 10

4 eventos foi medida para cada uma das amostras por citometria de fluxo. TO-PRO-3 é uma mancha vermelho-distante impermeabilizante celular do ácido nucleico medido no canal FL-4 permitindo a detecção ultra-sensível do ADN de cadeia dupla de células mortas. A análise da citometria de fluxo de dados foi feita usando-se com software celular Quest (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, EUA).

Imunocitoqu�ica

incorporação das linhas celulares.

As suspensões de células de linhas de células em cultura foram fixadas em formalina a 4%. As pelotas de células obtidas por centrifugação foram embebidos em parafina e cortado em 3-4 mm fatias para a coloração imuno-histoquímico.

imunocitoquímica coloração.

Para a recuperação antigênica, aquecimento micro-ondas de cortes de parafina em ácido cítrico 0,01 M tampão (pH 6,0, durante 20 min) (Quartett, Berlim, Alemanha) foi realizada. A inibição da actividade de peroxidase endógena foi conseguido por imersão em 0,5% H

2O

2 (v /v) em metanol (20 min). Após a drenagem do soro de bloqueio, as secções foram incubadas com um anticorpo policlonal de cabra anti-humano HMGA2 (R D Systems, Minneapolis, MN, EUA) diluída 1:400 em solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,2, 0,15 M), aproximadamente 16-18 h a 4 ° C. Após lavagem em PBS, as secções foram incubadas com um anticorpo conjugado com biotina para IgG de cabra (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA). O reagente de biotina-avidina-peroxidase (Vector Laboratories) foi aplicado de acordo com as instruções do fabricante. O cromogénio utilizado foi 3’3-diaminobenzidina-tetrahidrocloreto (Sigma Aldrich, Munique, Alemanha) a 0,05% (w /v) com 0,03% H

2O

2 (v /v) como substrato em Tris 0,1 M solução salina tamponada (Tris-hidroximetil-aminometano; Merck, Darmstadt, Alemanha). As secções foram contrastadas com hematoxilina de Mayers e montadas. Os controlos negativos foram realizados substituindo os anticorpos primários por soro de cabra normal. Para estabelecer as reações de coloração imunocitoquímicos, foram utilizados cortes de parafina de um carcinoma epidermóide oral canina.

Isolamento RNA e cDNA síntese