Abstract

O objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade de EVO para diminuir a viabilidade celular e promover a interrupção do ciclo celular e apoptose em células de câncer de pulmão de pequenas células (CPPC). O cancro do pulmão tem as maiores taxas de incidência e mortalidade entre todos os cânceres. A quimioterapia é o principal tratamento para a SCLC; No entanto, as drogas que são actualmente utilizados para SCLC são menos eficazes do que os utilizados para o cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC). Por conseguinte, é necessário desenvolver novos fármacos para o tratamento de SCLC. Neste estudo, os efeitos de evodiamina (EVO) sobre o crescimento celular, a paragem do ciclo celular e apoptose foram investigadas nas linhas de células SCLC NCI-H446 humanos e NCI-H1688. Os resultados representam o primeiro relatório de que EVO pode inibir significativamente a viabilidade de ambas as células H446 e H1688 em modos da dose e dependente do tempo. EVO induziu a paragem do ciclo celular na fase G2 /M, a apoptose induzida por se-regulação da expressão da caspase-12 e proteína citocromo C, e induziu a expressão de ARNm de Bax e por regulação negativa da expressão de ARNm de Bcl-2 em ambos células H446 e H1688. No entanto, não houve qualquer efeito sobre a expressão de proteínas de caspase-8. Tomados em conjunto, os efeitos inibitórios da EVO sobre o crescimento de células H446 e H1688 pode ser atribuído ao G2 M prisão /e apoptose subsequente, através de vias induzidas pelo estresse-mitocôndrias dependentes e retículo endoplasmático (vias dependente de caspase intrínsecas), mas não através do via induzida pelo receptor de morte (via dependente de caspase extrínseca). Nossos resultados sugerem que EVO é um romance promissor e potente antitumor droga candidatos para a SCLC. Além disso, o ciclo celular, a mitocôndria e as vias ER stress são alvos racionais para o futuro desenvolvimento de um sistema de entrega EVO para tratar SCLC

Citation:. Fang C, Zhang J, Qi D, Fan X, Luo J, Liu G, et al. (2014) Evodiamine Induz G2 /M detenção e apoptose via mitocondrial e retículo endoplasmático Pathways em H446 e H1688 Humano Small-Cell Lung Cancer Cells. PLoS ONE 9 (12): e115204. doi: 10.1371 /journal.pone.0115204

editor: Irina V. Lebedeva, Universidade de Columbia, Estados Unidos da América

Recebido: 07 de maio de 2014; Aceito: 19 de novembro de 2014; Publicação: 15 de dezembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 fang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pela CSTC2012JJB10027 concessão de Chongqing Ciência e Tecnologia Comissão, Chongqing, República Popular da China. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a forma mais comum de câncer, sendo responsável por 12,5% de todos os casos anuais de cancro recentemente diagnosticados em todo o mundo. Além de uma prevalência elevada, o cancro do pulmão tem a maior taxa de mortalidade entre todos os tipos [1] cancerosas. O cancro do pulmão pode ser classificada em cancro de células pequenas do pulmão (SCLC) e cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC), com base em características histopatológicas da doença. Aproximadamente 10% a 15% de todos os cânceres de pulmão são SCLC [2]. Clinicamente, SCLC se distingue de NSCLC pelo crescimento tumoral rápida e metástase generalizada. De acordo com as diretrizes da American Cancer Society [2], a quimioterapia é o principal tratamento para a SCLC, e cisplatina, etoposide, carboplatina e irinotecano são as drogas mais utilizadas. No entanto, estes medicamentos só têm uma eficácia limitada e causam efeitos colaterais graves [3]. Na verdade, a taxa de sobrevivência de cinco anos para SCLC é bastante baixo (3~8%) em comparação com a taxa de sobrevivência de cinco anos para todas as formas de câncer de pulmão ( 15%) [4]. Novos e antitumorais eficazes medicamentos com menos e menos graves efeitos colaterais são urgentemente necessárias para melhorar os resultados clínicos.

Evodiamine (EVO), um dos principais alcalóide quinazolinecarboline em

Evodia rutaecarpa

, tem efeitos citotóxicos sobre diferentes tipos de células de cancro humanas, tais como células de glioblastoma [5], células de cancro gástrico [6], células de cancro da mama [7], células de cancro da bexiga [8] e células de cancro do pulmão. Especificamente, EVO exibiu efeitos citotóxicos nas diferentes linhas celulares de NSCLC, incluindo células de adenocarcinoma do pulmão A549 [9], células H1299 [10], as células CL1 [11] e células de carcinoma de pulmão de células grandes H460 [12], [13]. Em contraste com os efeitos citotóxicos do EVO em diversas células cancerosas [14], EVO tem pouco efeito sobre as células do sangue periférico humano normais ou no peso corporal de ratinhos portadores de tumor na sua dose eficaz [15].

por outro lado, algumas drogas que têm efeitos citotóxicos em NSCLC também ter efeitos óbvios sobre o SCLC, tal como wentilactone a, que é citotóxica para ambos H460 e H446 [16], e a glucosamina, que é citotóxico para as células A549 e H446 [17 ]. Portanto, embora tenha havido nenhum relato do efeito do EVO em CPPC até à data, EVO pode ser um potencial novo candidato a fármaco para o tratamento de SCLC.

Neste estudo, os efeitos da EVO sobre a viabilidade celular, o ciclo celular e a apoptose em linhas de células SCLC NCI-H446 humanos e NCI-H1688 foram investigados, e os mecanismos subjacentes foi ainda explorado. Os nossos resultados indicaram que os efeitos inibidores de EVO sobre o crescimento de células H446 e H1688 foram atribuíveis a G2M prisão /e apoptose subsequente através do-mitocôndrias dependente e do retículo endoplasmático (ER) vias de activação de caspases induzida por stress (por vias dependente de caspase intrínsecas ), mas não através da via de activação de caspases induzida por receptor de morte (via dependente de caspase extrínseca). Até agora, nenhuma droga tem sido relatado para induzir a apoptose em células SCLC pela via do ER stress. Os resultados representam o primeiro relatório de que EVO induz a apoptose nas linhagens de células H446 e H1688 SCLC pela via do ER stress. Além disso, não houve nenhum relatório prévio de um medicamento que induz a paragem do ciclo celular em simultâneo e a apoptose em células SCLC através de vias mediadas por mitocôndrias e ER stress. Nós relatamos pela primeira vez que a EVO induzida G2 /M detenção e apoptose via ambas as vias mediadas por mitocôndrias e estresse ER nas linhas de células H446 e H1688 SCLC

Materiais e Métodos

2.1. composto

Evodiamine (EVO) foi comprado de Yuancheng Technology Development Co., Ltd. (Wuhan, China), pureza 99,13%. EVO foi dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO) para preparar uma solução estoque de 40 mm, o qual foi diluído com Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Grand Island Biological Company, Grand Island, NY, EUA) contendo soro fetal bovino a 10% (FBS ) antes de cada experimento. A concentração final de DMSO não era mais do que 0,025% neste estudo.

Cultura

2.2 celular

O humano NCI-H446 e NCI-H1688 linhas de células SCLC foram adquiridos a partir da Academia Chinesa de Ciências Médicas (Pequim, China) e da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China), respectivamente. As células H446 e H1688 foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS, 100 UI /mL de penicilina e 100 ug /mL de estreptomicina (Gibco Co., Grand Island, NY, EUA). As células foram incubadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2.

2.3 Ensaios de viabilidade celular

O H446 ou H1688 células foram semeadas a uma densidade de 2 × 10

3 células /poço em microplacas de 96 poços (Corning Incorporated, Nova Iorque, EUA). As células foram cultivadas durante 12 h, e o meio foi substituído com meio RPMI 1640 contendo diferentes concentrações de EVO (1,25, 2,5, 5, 10 e 20 uM). Após o fim do período de incubação especificados (24 h, 48 h e 72 h), o meio foi trocado por meio fresco contendo 20 uL de 5 mg /mL de metilo tiazolilo solução de tetrazólio (MTT) (Sigma). Após incubação durante 4 h, a solução de MTT foi removido e substituído com 150 mL de DMSO, e as microplacas foram agitadas durante 5 min. A absorvância foi medida a 490 nm com um espectrofotómetro de microplaca Multiskan GO (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EUA). A viabilidade celular foi calculada como se segue: A viabilidade celular (%) = OD

grupo de teste /OD

grupo de controlo x 100%, em que OD

grupo de teste era a densidade óptica (OD) da EVO ou DMSO grupo de tratamento e grupo de OD

controle foi a densidade óptica do grupo de controlo negativo. células H1688 H446 não tratadas ou foram utilizadas como grupo de controlo negativo. A IC

50 valor refere-se à concentração de droga necessária para matar 50% das células [18]. As viabilidades celulares de diferentes concentrações EVO foram analisados ​​por software de OriginPro 7 (OriginLab Corporation, Northampton, MA, EUA), e, em seguida, foram obtidos os sub

50 valores de IC. As morfologias das células H446 incubadas com EVO por 24 h foram visualizadas sob um microscópio de fluorescência invertido (ECLIPSE Ti-S, Nikon Instruments Inc., Tóquio, Japão).

Ciclo

2.4 celular e Análise de apoptose

As células H446 ou H1688 foram cultivadas em 25 cm

2 frascos e tratadas com 10? M EVO durante 24 h. As células foram colhidas por centrifugação e trypsinzation, e em seguida fixadas com etanol a 70% a 4 ° C durante 12 h. Após lavagem duas vezes com solução tamponada com fosfato (PBS), as células foram ressuspensas em solução de coloração de DNA contendo 40? G de iodeto /mL de propídio (PI) e de 0,1 mg /mL de ARNase, a 25 ° C no escuro durante 30 min. As células foram analisadas com um citómetro de fluxo FACSVantage (Becton-Dickinson, San José, CA, EUA) equipado com o programa CellQuest [18]. Em seguida, a distribuição do ciclo celular foi determinado e analisado.

Quantificação das células

apoptose foi determinada utilizando um kit de anexina V-FITC /PI de detecção de apoptose (Beyotime Instituto de Biotecnologia, Xangai, China). A indução de apoptose foi detectada em H446 ou H1688 células após 24 h de tratamento com 10 uM EVO de acordo com o FITC-V /método de coloração de anexina PI. As células H446 foram observadas sob um microscópio de fluorescência Nikon Eclipse Ti invertido.

2,5 Espécies Reativas de Oxigênio (ROS), cálcio intracelular gratuito (Ca

2 +) e mitocondrial potencial de membrana (ψ

m )

ROS, Ca

2 + e ψ

níveis m foram determinados com um fluxo FACSVantage citômetro utilizando os seguintes três fluorocromos: 2 ‘, 7’-dichlorofluorescin diacetato (DCF-DA) (Beyotime Instituto de Biotecnologia, Haimen, Jiangshu, China), Fluo-3 /AM (Beyotime Instituto de Biotecnologia, Xangai, China), e JC-1 (Beyotime Instituto de Biotecnologia, Jiangshu, China), respectivamente [19]. Resumidamente, H446 ou H1688 células semeadas a uma densidade de 1 x 10

6 células /poço em placas de 6 poços (Corning Incorporação, Nova Iorque, EUA) foram tratadas com 10? M EVO durante 24 h. As células foram recolhidas, centrifugadas e ressuspensas numa solução de coloração contendo 10 uM DCF-DA (5 uM Fluo-3 /AM ou 5 ug /ml de JC-1) a 37 ° C durante 30 min (45 min ou 20 min) e então analisados ​​usando um FACSVantage citômetro de fluxo.

2.6 caspase-3, -8, -9 e ensaio de actividade

O ensaio de actividade, utilizando caspase-3, -8 e -9 níveis de atividade foram medidos kits (Beyotime Instituto de Biotecnologia, Haimen, Jiangsu, China). Resumidamente, H446 ou H1688 células foram colhidas depois de ser tratada com 10 uM EVO durante 24 h (48 h ou 72 h). Em seguida, as células foram lavadas com PBS frio, ressuspensas em tampão de lise (100 mL por 2 x 10

6 células), deixado em gelo durante 15 min e em seguida centrifugou-se a 18000 ×

g em

4 ° C durante 10 min. Os ensaios foram realizados em placas de microtitulação de 96 poços por incubação de uma mistura composta de 10 ul de ligado celular, 80 pL de tampão de reacção e 10 ul de caspase-3 (-8 ou -9) substrato (Ac-DEVD-pNA) a 37 ° C durante 4 h. A actividade da caspase-3 (-9 -8 ou) nas amostras foi quantificada utilizando um Multiskan GO Microplacas espectrofotómetro (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EUA) a uma absorvância de 405 nm

2,7. Ocidental Análise Blot

O citocromo C (Cit C), caspase-12, -8, -9 e -3, factor de suicídio associado (Fas) e necrose do tumor apoptose ligando indutor relacionado com o factor (Trail) foram medidos no o nível de proteínas por transferência de Western. As células H446 tratadas com 10? M EVO durante 48 h foram recolhidas e incubadas em ensaio de radio imunoprecipi tacão (RIPA) de tampão de lise (Beyotime Instituto de Biotecnologia, Haimen, Jiangshu, China) durante 60 min em gelo. Os lisados ​​celulares foram centrifugados a 13000 g durante 15 min, e as concentrações proteicas nos lisados ​​foram determinadas utilizando o ensaio de proteína Bio-Rad corante (Bradford) Reagente (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA). Quantidades iguais de proteínas foram resolvidas por electroforese em gel de poliacrilamida-sulfato (SDS-PAGE) e transferidos para membranas de transferência Immobilon-P (Millipore Corporation, Bedford, MA, USA).

As membranas foram bloqueadas com 5% desnatado leite em tampão TBST (20 mM Tris-HCl, 150 mM de NaCl e 0,05% de Tween 20). Cit C, caspase-12, -8, -9 e -3, Fas e Trail foram detectadas utilizando anticorpos primários (coelho anti-Cit C, caspase-12, -8, -9 e -3, Fas e Trail) e secundário (IgG de cabra anti-coelho (H + L), a peroxidase de rábano conjugada) anticorpos. Todos os anticorpos foram adquiridos a partir de Pequim Biossíntese Biotecnologia Co., LTD., Beijing, China e eles foram diluídos 1:200 com TBST 5% de leite desnatado (Sigma) antes do uso. A concentração final dos anticorpos foi de 20 ug /mL. Da mesma forma, Cit C e caspase-12 e -8 foram medidos em células H1688 tratadas com EVO durante 48 h por Western blotting.

2,8 Transcrição Reversa de Reacção em Cadeia da Polimerase (RT-PCR)

total o ARN celular a partir de células isoladas de fresco H446 foi isolado utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). O ADNc foi sintetizado utilizando transcriptase reversa (Genecopoeia Inc., Rockville, MD, EUA). O produto do gene específico foi amplificado por PCR com ADN-polimerase Taq (Fermentas, Waltham, MA, EUA). Os conjuntos de iniciadores para PCR foram como se segue:

Bax de cadeia de sentido: 5′-TTTGCTTCAGGGTTTCATCCA-3 ‘;

Bax cadeia anti-sentido: 5′-CCAGCCTTGAGCACCAGTTT-3′.

Bcl-2 de cadeia de sentido: 5′-ACTTCGCCGAGATGTCCAGC-3 ‘;

Bcl-2 antisense vertente: 5′-GCACCTACCCAGCCTCCGTTAT-3′;

2.9 Análise estatística

cada experiência neste estudo foi repetido 3 vezes. Todos os dados são apresentados como a média ± desvio padrão (SD), salvo indicação em contrário. As análises foram realizadas utilizando o programa Statistical Package for the Social Sciences (versão 13.0, SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). O teste t de Student foi utilizado para determinar a significância estatística das diferenças entre os grupos experimentais. A significância estatística foi estabelecido em

P

. 0,05

Resultados

3.1 efeitos inibitórios de Evodiamine no celular Crescimento

Os efeitos inibitórios da EVO sobre crescimentos de células SCLC H446 e H1688 humanos foram avaliados utilizando ensaios de citotoxicidade MTT. Como mostrado na Fig. 1A, inibiu o crescimento do EVO SCLC H446 humano de uma forma dose e dependente do tempo. A taxa de viabilidade das células tratadas com H446 a 10 uM EVO durante 24 h (~66%) diminuiu -16% em comparação com a de células tratadas com 1,25? M EVO (~82%). A taxa de viabilidade das células tratadas com H446 a 10 uM EVO durante 72 h (~ 35%) diminuiu ± 22% em relação ao que para as células tratadas com 1,25? M EVO (~57%). A IC

50 valores para-tratados EVO H446 células durante 24 h, 48 h e 72 h foram 20 pM, 18,07 uM e 1,80 uM, respectivamente

A viabilidade celular foi medida pelo ensaio de MTT. . As células foram fotografadas usando o microscópio. Cada experiência foi repetida 3 vezes. Dados apresentados como média ± desvio padrão (n = 3). *

P Art 0,05 mostraram diferença significativa entre dois grupos. células H1688 H446 não tratadas ou foram utilizadas como grupo de controlo negativo. O grupo 0? M EVO continha 0,025% de DMSO. O DMSO a 0,025% foi utilizado para preparar 20 uM EVO (a concentração máxima de solução EVO no estudo). *

P

0,05 quando comparado com o grupo tratado EVO correspondente às 24 h.

#

P Art .. 0,05 em comparação com o correspondente EVO grupo tratado às 48 h

EVO inibiu o crescimento de células SCLC H1688 humana de uma forma ligeiramente diferente (Fig 1B ): (1) EVO inibiu o crescimento de células SCLC humano H1688 de uma forma dependente da dose dentro de 72 h. As taxas de viabilidade de células H1688 tratadas com 10? M EVO (~49% às 24 h, ~33% às 48 h e ~ 30% em 72 h, respectivamente) diminuíram ~19%, 19% e 21% em relação ao que tratada com 1,25 uM EVO (~68% durante 24 h, ~52% durante 48 h e ~51% durante 72 h, respectivamente). (2) H1688 EVO inibiu o crescimento de uma forma dependente do tempo em concentrações variando entre 1,25 uM a 10 uM dentro de 48 h e a uma concentração de 20 uM no prazo de 72 horas. (3) As taxas de inibição após um tratamento de 48 horas foram quase os mesmos que aqueles depois de 72 h de tratamento com EVO em concentrações variando entre 1,25 uM a 10 uM. (4) A IC

50 valores de EVO H1688 em células diminuiu de 8,14 uM (a 24 h) a 2,08 uM (a 48 h) ou 1,37 uM (a 72 h).

após tratamento com 10 uM EVO, as taxas de viabilidade de células H446 ou H1688 foram ~66% ou ~49% (24 h), ~56% ou ~33% (48 h), e 35% ou ~ 30% (72 h), respectivamente . Devido ao efeito inibitório evidente de 10 uM EVO em H446 ou H1688 células, a dose intermédia de EVO (isto é, 10 uM) foi seleccionado para ser utilizado em todos os testes seguintes, a menos que indicado de outra maneira.

fig. 1C indicaram que as morfologias das células H446 tratadas com diferentes concentrações de EVO durante 24 h foram substancialmente alteradas. Quando a concentração aumentada EVO, tornou-se mais células H446 rodada e separado da placa de cultura quanto sua pseudopodia gradualmente retraída. EVO inibiu o crescimento celular H446 de uma forma dependente da dose, a não ser que as células tratadas com H446 EVO a 5 uM, 10 uM ou 20 ^ M durante 24 h teve os efeitos de citotoxicidade semelhantes.

Tomados em conjunto, o constituinte à base de plantas naturais EVO inibiu significativamente as viabilidades de células H446 e H1688 SCLC em maneiras dose e tempo-dependente.

3.2 Efeitos da Evodiamine no ciclo celular e apoptose

para examinar a interrupção do ciclo celular foi responsável por a inibição do crescimento celular mediada por EVO, estudou-se a distribuição do ciclo celular. Como mostrado na Fig. 2A e 2B, EVO preso selectivamente o ciclo celular na fase G2 /M (de fase i.e., a pré-mitótico /mitótico). Após o tratamento com 10 uM EVO durante 24 h, o número de EVO tratados com H446 ou H1688 células em G2 /M (ou ~63% -50%) era de aproximadamente 5 vezes ou 2,5 vezes a das células não tratadas (controlo em branco , ~13% ou 20%). Enquanto isso, os números (ou ~31% ~29%) de Evo-tratada H446 ou H1688 células em fase S (fase de síntese do durante o qual os cromossomas são replicados) foram quase os mesmos que os das células não tratadas (~ 30% ou ~29%).

ciclo celular foi detectada por ensaio PI. A apoptose foi detectada utilizando um ensaio de dupla marcação anexina V /PI. As células H446 coradas com Anexina V /PI foram observados sob um microscópio de fluorescência invertido. Cada experiência foi repetida 3 vezes. Dados apresentados como média ± desvio padrão (n = 3). *

P Art 0,05 em relação ao grupo de controle correspondente. células não tratadas H446 ou H1688 foram utilizados como grupo controle negativo.

A apoptose é também referido o suicídio como celular ou morte celular programada. Para determinar se EVO apoptose induzida em SCLC H446 e H1688 células, as taxas de apoptose foram detectados por dupla marcação anexina V-FITC /PI. Após o tratamento com EVO durante 24 h, como indicado na Fig. 2C e 2D, a taxa de apoptose de H446-tratada EVO (-15%) ou H1688 (-11%) células era muito mais elevada do que a de células não tratadas (controlo em branco, ~ 5% ou ~ 4%); como mostrado na Fig. 2E, características típicas de apoptose, tais como a condensação da cromatina ea marginalização, a segmentação nuclear e formação de corpos apoptóticos, foram observadas em células H446 tratados EVO. Em suma, EVO induzida significativamente a apoptose em células H446 e H1688. Deve notar-se que nas nossas experiências preliminares, avaliou-se os efeitos apoptóticos de doses mais baixas de EVO (tais como 1,25 uM e 2,5 uM). As taxas de apoptose de células SCLC H446 tratadas com 1,25 uM ou 2,5 uM EVO EVO foram quase os mesmos que os dos controlos em branco correspondentes (dados não mostrados).

3.3 Efeitos da Evodiamina sobre o ROS, Ca

2+ e ψ

m níveis

o ROS, Ca

2 + e ψ

níveis m foram fatores críticos que indicam a possível ativação de vias de apoptose. A maioria das ROS são os radicais livres que causam ADN, proteína e danos biomembrana [18]. cálcio intracelular é um importante fator de sinalização intracelular. Ψ

m é um indicador chave da saúde celular, porque ela está relacionada com a capacidade ATP geração de células. Neste estudo, o ROS, Ca

2+ e ψ

m foram medidos com sondas fluorescentes utilizando um citómetro de fluxo FACSVantage [18]. Após o tratamento com EVO durante 24 h, em comparação com os grupos de controlo, (1) os níveis de ROS nas células SCLC-H446 tratadas EVO aumentou em mais de um quarto (~28%), e em células H1688, os níveis de ROS mais de duplicou (~104%) (Fig 3A e 3B.); (2) o intracelular de Ca

2 + em ambos os níveis das células H446 e H1688 aumentada da metade (~51% ou ~48%) (Figura 3C e 3D.); (3) o ψ

m níveis decresceram quase um terço (~32%) e por um sétimo (~14%) na H446 e H1688 células, respectivamente (Fig. 3E e 3F). Os resultados sugerem que EVO aumentou os níveis de ROS em células SCLC. O excesso de ROS não só o ADN danificado, mas também danificado da membrana mitocondrial e aumento da permeabilidade da membrana mitocondrial. Mais de cálcio foi libertado da mitocôndria e entrou no citoplasma. A concentração de cálcio intracelular aumentou, e o potencial de membrana mitocondrial foi parcialmente despolarizada. EVO apoptose induzida em ambas as células SCLC H446 e H1688 através da via mitocondrial ROS mediada.

ROS, Ca

2 + e ψ

m foram detectados separadamente por DCF-DA, Fluo-3 /AM e JC-1 ensaios. Cada experiência foi repetida 3 vezes. Dados apresentados como média ± desvio padrão (n = 3). células H1688 H446 não tratadas ou foram utilizadas como grupo de controlo negativo. *

P

. 0,05 em relação ao grupo de controle correspondente

3.4 Efeitos da Evodiamine sobre Caspase-8, -9 e -3 Ensaio de Actividade

As caspases são enzimas proteolíticas que são mediadores críticos de apoptose. As actividades de caspase-8, -9 e -3 foram determinadas por espectrofotometria. Em comparação com os grupos de controlo correspondentes, aumentos significativos nas actividades de caspase-8, -9 e -3 foram encontrados em células H446 tratadas com 10? M EVO durante 24 h, 48 h e 72 h, com a excepção do aumento da caspase -8 atividade em células EVO-tratados após 24 h, que não foi estatisticamente significativa. Os níveis mais elevados de caspase-8 (~213%, Fig. 4A) e a actividade da caspase-9 (~240%, Fig. 4B) foram observadas após o tratamento com EVO durante 48 h, enquanto que o nível mais elevado de actividade da caspase-3 ( ~564%) foi observada às 24 h (Fig. 4C). No entanto, as mais elevadas actividades de caspase-8 e -9 eram ainda mais baixos do que a actividade da caspase-3 (~278%) de células tratadas com EVO às 48 h. Estes resultados sugerem que a apoptose induzida EVO através de vias dependentes de caspase.

Os lisados ​​celulares foram analisados ​​através de um ensaio colorimétrico de Ac-DEVD-pNA. Cada experiência foi repetida 3 vezes. Dados apresentados como média ± desvio padrão (n = 3). actividades de caspase foram dadas como unidades arbitrárias (UA) por miligrama de proteína. As células H446 não tratadas foram utilizados como um grupo de controlo negativo. *

P

0,05 quando comparado com o grupo de controlo correspondente.

#

P

0,05 em comparação com grupo tratado correspondente EVO às 24 h.

P

. 0,05 em comparação com o correspondente EVO grupo tratado às 48 h

3,5 Efeitos da Evodiamine sobre a expressão da proteína de Cit C, Caspase-12, – 8, -9 e -3, Fas e fuga

Cit C é uma proteína mitocondrial envolvida na iniciação de apoptose mediada por mitocôndrias. As caspases são proteases de cisteína ácido aspártico que são essenciais para a apoptose. A caspase-12, está localizada ao ER e envolvido em apoptose mediada por ER. A caspase-8 medeia transdução de sinal a jusante dos receptores de morte (DR) localizados na membrana de plasma e é, portanto, envolvido na apoptose mediada por DR. A interacção de DR com os seus ligandos naturais (tais como a FasL e percurso) induz a activação de caspase-8. Caspase-9 é uma protease específica do ácido aspártico. Caspase-3 é um executor a caspase responsável pela condensação de cromatina e fragmentação do ADN na apoptose. Cit C e caspase-12 e -8 desencadear a activação da caspase 9 (caspase iniciador) e caspase-3 (caspase efectora) antes de finalmente induziu apoptose.

Para EVO-tratados H446 ou H1688 células, em comparação com os grupos de controlo correspondentes (o nível foi definido como 100% em cada um dos controlos), (1) a proteína C níveis de cit expressão foram significativamente aumentada por ~220% e ~367% (ver Fig. 5A e 5B), respectivamente , (2) a expressão da proteína níveis de caspase-12 estavam significativamente aumentados por ~248% e ~190% (ver Fig. 5C e 5D), respectivamente, e (3) a expressão da proteína níveis de caspase-8 foram quase inalterada ( ~94% e ~112%, respectivamente) (ver Fig. 5E e 5F). Outras investigações de células tratadas com H446 EVO revelou que a elevação acentuada do nível de Cit C resultou num aumento da caspase-9 e -3 expressão por ~275% e 204%, respectivamente (ver Fig. 5G e 5H). Além disso, FasL e Trail, que são activadores de caspase-8, não permaneceram inalterados (~102% e ~105%, respectivamente) (ver Fig. 5I e 5J). Os resultados de Western blot sugerido que o aumento EVO Cit C e caspase-12 em ambos os níveis de células H446 e H1688 SCLC, assim EVO apoptose induzida através de ambas as vias mitochondria- e ER-mediadas. Além disso, a expressão de proteína elevada de caspase-9 e -3 EVO indicaram que a apoptose induzida através de uma via dependente de caspase-3-. Contrariamente, a EVO não teve efeito sobre a expressão de proteínas de caspase-8 em células quer H446 ou H1688 SCLC, o que sugere que não induzem apoptose através de uma via mediada por DR.

Os lisados ​​celulares foram analisados ​​por? Western blot? . Cada experiência foi repetida 3 vezes. Dados apresentados como média ± desvio padrão (n = 3). células H1688 H446 não tratadas ou foram utilizadas como grupo de controlo negativo. *

P Art 0,05 em relação ao grupo de controle correspondente. Fas: Fator de suicídio associado; fator relacionado apoptose ligando indutor de necrose tumoral;: Trail Cit C: citocromo C.

3.6 Efeitos da Evodiamine sobre a expressão de mRNA de Bax e Bcl-2

BAX é também conhecida como Bcl-2 como a proteína Bcl-4 ou X 2-associado; Bcl-2 meios linfoma de células B promove a apoptose Bax 2. antagonizando a Bcl-2, o qual é considerado especialmente importante uma proteína anti-apoptótica. Simultaneamente, a BAX e Bcl-2 são codificados separadamente pelos genes BAX e Bcl-2. Aqui, os níveis da Bax e Bcl-2 genes de expressão foram determinados por RT-PCR. Em comparação com os controlos correspondentes, (1) o ARNm de níveis de expressão do Bax em H446 ou H1688 células tratadas com EVO foram significativamente aumentados por ~215% ou ~135% (às 24 h), ~397% ou ~172% (em 48 h) e ~514% ou ~185% (às 72 horas), respectivamente (Fig. 6A e 6B). (2) Pelo contrário, os níveis de expressão de ARNm de Bcl-2 em EVO-tratada H446 ou H1688 células foram significativamente diminuído por -10% ou -11% (às 24 h), -60% ou ~28% (em 48 h), e ~66% ou ~53% (às 72 horas), respectivamente (Fig. 6C e 6D). Tomados em conjunto, EVO aumentou a proporção de Bax /Bcl-2 ao nível da transcrição, que se espera venha a aumentar ainda mais a proporção de Bax /Bcl-2 ao nível da proteína e, eventualmente, promover a apoptose.

lisados ​​celulares analisada por RT-PCR. Cada experiência foi repetida 3 vezes. Dados apresentados como média ± desvio padrão (n = 3). células H1688 H446 não tratadas ou foram utilizadas como grupo de controlo negativo. *

P

0,05 quando comparado com o grupo de controlo.

#

P

0,05 em comparação com grupo tratado correspondente EVO às 24 h.

P Art 0,05 em comparação com o correspondente EVO grupo tratado às 48 h

Discussão

Neste estudo, nós mostramos pela primeira vez. EVO que inibe significativamente a viabilidade das células SCLC. A IC

50 valores de EVO em células H446 diminuiu de 20 uM (24 h) a 18,07 uM (48 h) ou 1,80 m (72 H); e em células H1688, o IC

50 diminuiu de 8,14 uM (24 h) a 2,08 uM (48 h) ou 1,37 m (72 H). EVO exerceu efeitos inibidores sobre células H446 e H1688 em maneiras concentração e do tempo-dependente. Foi anteriormente documentado que o IC

50 valores de EVO em células NSCLC humanas foram 12 uM (48 h, as células H460) [13], 13,2 uM (72 h, (R) -EVO, H460 células) [12] , 2,6? M (72 h, (S) -EVO, H460 células) [12], e 100 um (72 h, as células A549) [9]. Em suma, a EVO exibiram actividade antitumor em CPPC, além de células NSCLC. Além disso, na maioria dos casos, a EVO inibiu o crescimento de células H446 SCLC de forma mais eficiente do que a de células H460 e A549 NSCLC.

A investigação da distribuição do ciclo celular demonstrou que a perturbação do ciclo celular foi responsável pela evo- inibição do crescimento celular mediada. O número de células H446 e H1688 em fase S era quase inalterados após tratamento EVO comparação com o controlo. No entanto, EVO desencadeou uma prisão na fase G2 /M, ou seja, EVO-tratados H446 e H1688 células acumuladas na fase G2 /M. Uma prisão de células na fase G2 /M, em resposta ao stress genotóxico (tais como agentes de stress oxidativo e intercalantes de ADN) pode induzir danos no ADN, tanto de forma (por ROS) dependente de p53 [20] e independente de p53 [21].

foi documentado que EVO apoptose induzida em diferentes células cancerígenas humanas através de vias diferentes. Por exemplo, no NSCLC células H1299 apoptose foi induzida através da supressão do factor nuclear (NF) via activação -κB [10]; e em células SW1990 pancreáticas, a apoptose foi induzida através da regulação da via de PI3-K /Akt [22], em células cancerosas da bexiga T24 e 253J, a apoptose foi induzida através de mTOR downregulation /mediada por S6K1 de [8] Mcl-1. indução de apoptose pela EVO em células H446 ou H1688 SCLC foi caracterizado por dupla marcação anexina V-FITC /PI, e alterações morfológicas eram evidentes em H446 células. Além disso, os resultados do presente estudo sugerem que a prisão /ciclo celular de fase G2 M parou o crescimento de células H446 e H1688 e, eventualmente, conduziu à morte celular por apoptose por meio de duas vias dependente de caspase intrínsecas, mas não através da via dependente de caspase extrínseca (Fig . 7):

a apoptose foi induzida através da via de ativação caspase mediada por mitocôndrias. Os resultados mostraram que a apoptose desencadeada EVO mitocondrial acompanhado pela acumulação de ROS. Neste estudo, a alteração da permeabilidade da membrana mitocondrial induzida por geração de ROS levou à activação da libertação de cálcio intracelular, a perda de potencial de membrana mitocondrial, e a libertação subsequente de Cit C. Sendo um factor de apoptose, Cit C desencadeada no seguimento da activação de 9 caspase (caspase iniciador), seguida pela activação da caspase-3 (caspase efectora), a indução da clivagem de PARP e a indução de apoptose final de [23]. Xu et al.