Abstract

A nova entidade molecular quinoxalinhydrazide derivado NVX-412 foi identificado como um candidato droga promissora para o tratamento de vários tipos de câncer, devido à sua atividade citotóxica forte e especificidade relativa. Aqui, nós fornecemos primeiros dados sobre os mecanismos de ação da NVX-412. Mostramos que NVX-412 exerce a sua actividade anti-neoplásica de um modo independente de p53 e induz a paragem da fase S e danos no ADN tal como avaliado por coloração com γH2AX. Sugerimos um bi-modal modo (dose-dependente) de ação da NVX-412, sendo principalmente citostático em baixa e predominantemente citotóxico em concentrações mais elevadas. Com base na ampla e consistente actividade anti-neoplásica observada, NVX-412 é uma promessa como um candidato medicamento eficaz para o tratamento de vários tipos de câncer, especialmente para doenças malignas hematológicas com necessidade médica não atendida altamente

Citation:. Hebar A , Rütgen BC, Selzer e (2012) NVX-412, um candidato New Oncologia drogas, induz S-Phase Detenção e danos no DNA em células de câncer de Forma p53-Independent. PLoS ONE 7 (9): e45015. doi: 10.1371 /journal.pone.0045015

editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 24 de fevereiro de 2012; Aceito: 14 de agosto de 2012; Publicação: 13 de setembro de 2012

Direitos de autor: © Hebar et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esses autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. ES é sócio e consultor da Novelix Pharmaceuticals, Inc. Novelix Pharmaceuticals, Inc. é titular da patente de NXV-412 e desde NVX-412 para este estudo. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas de dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O cancro é uma das principais causas de morte em todo o mundo. De acordo com as contas de cancro da Organização Mundial de Saúde para aproximadamente 13% de todas as mortes em todo o mundo [1]. Apesar dos grandes investimentos, investigação e pesquisa ao longo de décadas, as drogas anti-câncer disponíveis atualmente estava por trás as expectativas e agentes, portanto, novos, altamente ativos, bem tolerados e, idealmente, oralmente bio-disponível anti-câncer são fortemente necessário. ácido pirazina-2-carboxílico N’- (7-fluoro-pirrolo [1,2-α] quinoxalin-4-il) de co-cristais de ácido oxálico-hidrazida, referido como NVX-412 (Figura 1), é um candidato a droga promissora para o tratamento de um número de tipos de cancro. Esta nova droga candidatos entidade molecular preenche os critérios de Lipinskís regra de cinco, o que dá uma primeira indicação sobre propriedades medicamentosas e sobre se um candidato a fármaco putativo pode ser adequado como um medicamento [2]. NVX-412 é um co-cristal de ácido oxálico e NVX-144, o seu composto de chumbo dos pais. estrutura de descoberta e química do NVX-144 foi descrito por Grande e colaboradores [3]. Pertence à classe química das quinoxalinhydrazides e foi desenvolvido através de concepção racional de fármacos [3]. O facto de NVX-144 forma um co-cristal com ácido oxálico é de interesse especial, uma vez que Aakeroy et ai. demonstraram que as co-cristais de heterociclos contendo azoto com ácidos carboxílicos mostram vantagens sobre os sais correspondentes diz respeito a certas propriedades físicas favoráveis ​​para as formulações farmacêuticas [4]. NVX-412 confirma esta noção, mostrando o aumento da actividade citotóxica em comparação com o composto parental NVX-144 em linhas de células HT-29 e de carcinoma do cólon HCT116 com um IC

50 que é 3 a 4 vezes inferior [3].

A: ácido pirazina-2-carboxílico N ‘- (7-f luoro-pirrolo [1,2-α] quinoxalin-4-il) -hidrazida-ácido oxálico co-cristal; Fórmula molecular: C

18H

13FN

6O

5, Molecular Peso: 412 g /mol B: Solvente modelo de malha acessível. Branco: carbono; amarelo: flúor; azul: nitrogênio; vermelho: oxigénio. Ambas as estruturas foram gerados com Chembio 3D Ultra 12,0 (CambridgeSoft, MA, EUA).

Até agora, o mecanismo de acção de NVX-412 não é conhecido. Aqui, demonstramos que NVX-412 é um agente anti-cancro promissor romance que exerce os seus efeitos anti-neoplásicas em uma ampla gama de linhas de células de tumor de várias histologia. Nós ainda sugerem que NVX-412 tem um mecanismo bi-modal de ação a ser essencialmente citostático em baixa e predominantemente citotóxico em concentrações mais elevadas. Mostramos que NVX-412 induz a paragem da fase S, bem como danos no ADN e uma diminuição na replicação do ADN. O modo de ação da NVX-412 é independente de p53.

Materiais e Métodos

Drugs

NVX-412 (Figura 1) foi obtida a partir Novelix Pharmaceuticals, Inc. (La Jolla, CA, EUA). Para

In vitro

estudos, o composto foi dissolvido em DMSO (estoque 25 mM armazenado a -80 ° C) e diluiu-se com as concentrações indicadas. Nutlin-3 e (S) – (+) – camptotecina (CPT) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Viena, AUT) e dissolveu-se em DMSO (existências: 3,5 mM e 5 mg /ml, respectivamente). Todas as soluções foram preparadas imediatamente antes da utilização.

NCI-60 DTP (Programa Therapeutics Desenvolvimento) Tumor Humano Linha celular de tela

NVX-412 foi incluído em uma tela de actividade anti-cancerígena pelo National Cancer Institute (NCI) [5]. O composto foi testado contra 59 linhas celulares tumorais humanas diferentes, representando leucemia, melanoma e cancros do pulmão, cólon, cérebro, ovário, mama, próstata e do rim (Para uma lista completa de linhas celulares consulte Shoemaker et al., 2006 [5]). A metodologia deste

in vitro tela câncer

é descrito em detalhes no site do NCI (https://dtp.nci.nih.gov/branches/btb/ivclsp.html). Resumidamente, as linhas celulares de tumores humanos do painel de rastreio do cancro foram cultivadas em meio RPMI 1640 contendo 5% de FCS e 2 mM de L-glutamina em placas de 96 poços a densidades que variam de 5.000 a 40.000 células /poço. Após 24 horas, a droga experimental foi adicionado a 5 concentrações mais controlo e as células foram incubadas durante 48 horas adicionais. Para a determinação do efeito inibidor do crescimento do composto num ensaio de sulfo-rodamina B que foi realizado emprega um passo de fixação química no final do tratamento com fármaco e uma coloração subsequente durante 10 minutos. Após um passo de lavagem, foi determinada a absorvância a 515 nm. Três parâmetros de resposta à dose diferentes são então calculados: inibição do crescimento de 50% (GI

50), que é a concentração de droga que resultou numa redução de 50% no aumento de proteína líquida, a concentração de fármaco, resultando em inibição total do crescimento (TGI) ea LC

50, indicando uma perda líquida de células após o tratamento [5].

as curvas de dose-resposta de HT-29, HepG2, células HeLa e células cancerosas HCT116. As células foram incubadas com as concentrações indicadas de NVX-412 durante 72 horas e contadas com um Beckman Coulter ViCell XR. B: sobrevivência clonogênica de HepG2 e células HT-29. As células HepG2 e HT-29 foram incubadas com as concentrações indicadas de NVX-412 durante 12 ou 14 dias, respectivamente. sobrevivência clonogénica foi reduzida significativamente de uma maneira dependente da dose. cinética de proliferação mais de três dias de tratamento com diferentes concentrações de NVX-412 em células HT-29 que mostra uma redução significativa da proliferação a 300 nm e a um declínio no número de células a um tratamento uM NVX-412: C. Os dados representam os valores médios (± DP) de pelo menos 2 experiências independentes. A análise estatística foi realizada com o GraphPad Prism 5.0. * Indica p valor 0,05, **** indica p valor. 0,0001 (Two-way ANOVA)

Linhas Celulares

As seguintes linhas celulares foram usados ​​neste estudo (linhas celulares de NCI-60 ecrã linha celular DTP de tumor humano não incluído): O isogénica colo-rectal humano de células de carcinoma linhas HCT116 p53 + /+ e p53 – /- e RKO p53 + /+ e p53 – /- foram adquiridos a partir de Horizon Descoberta Ltd. (Cambridge, Reino Unido) e foram cultivadas em meio de McCoy 5A suplementado com 10% de FCS, 1% Pen Strep e 2 mM de L-glutamina (sempre que o estado de p53 das células HCT-116 não é especificada foram usadas p53 células + /+) . CLBL-1 (linfoma de células B de caninos) [6], OSW [7] e um CL-(canino de células T-linfoma) [8] e GL-1 (leucemia de células B canino) [9] As linhas celulares foram gentilmente fornecida pela BC Rütgen (Universidade de Medicina Veterinária Vienna, Vienna, AUT), e foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% FCS e 1% de Pen Strep. As células-B Não-Hodgkin linhas celulares de linfoma de SU-DHL-6 e SU-DHL-8, comprado de DSMZ (Colecção Alemã de Microorganismos e Culturas Celulares, Braunschweig, GER), foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com FCS a 10% e 1% Pen Strep. Foram usadas as mesmas condições de cultura para todas as outras linhas de linfoma e de células de leucemia Raji [10], [11], Ramos [10], [11], KG-1 [10], [12], [13], [14 ], KG-1a [14], HL-60 [10], [12], [13], BV173 [10], [11], NALM-1 [12], [13] e K562 [10], [ ,,,0],12], [13], que foram gentilmente cedidas por P. Valent (Universidade médica de Viena, Viena, AUT) e estão todos publicado anteriormente linhas celulares disponíveis a partir ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, EUA) ou DSMZ . HS27, uma linha celular de fibroblastos normais, foi fornecida por D. Barlow (Research Center for Molecular Medicine, Viena, AUT) e foi cultivada em DMEM com 10% de FCS e 1% de Pen Strep [15], [16]. Hs578T foram cultivadas em Meio Mínimo-α Essencial (MEM) suplementado com 10% FCS, 1% Pen Strep e 1% de L-glutamina e foram um presente amável de T. Grunt (Universidade Médica de Viena, Viena, AUT) [17] . Ambas as linhas celulares, HS27 e Hs578T, estão disponíveis a partir de ATCC. células humanas normais HUVEC endoteliais da veia umbilical foram adquiridos a partir de Lonza (Walkersville, Maryland, EUA) e foram cultivadas em meios Clonetics® EGM® BulletKit. pré-adipócitos brancos humanos (HWP) foram adquiridos a PromoCell (Heidelberg, GER) e foram cultivadas em meio de crescimento de pré-adipócitos fornecida pela empresa. A linha celular de adenocarcinoma de mama MCF-7, a linha de células de carcinoma cervical HeLa, a linha celular de carcinoma hepatocelular HepG2 e a linha celular de adenocarcinoma colorrectal HT-29 foram obtidas da ATCC e foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% FCS e 1% de Pen Strep . Se não for indicado de outro modo todos os reagentes de cultura celular foram adquiridos de Gibco (Grand Island, NY, EUA).

HCT116, células HeLa e células HT-29 foram tratadas durante até 72 horas como indicado. Um controle de DMSO foi realizada, mas não apresentaram diferenças em relação ao UTC. Depois de 24, 48 e 72 horas fotos foram tiradas (A, C, E). Os painéis B, D e F mostram a quantificação do tamanho das células após 48 horas de tratamento com as concentrações indicadas de NVX-412. Os diagramas de caixa representam os dados de células contadas dentro de 5 campos de vista diferentes. A análise estatística foi realizada com o GraphPad Prism 5.0. **** Indica p valor 0,0001 (Mann-Whitney U Test). A, B: HCT116. C, D: HeLa. E, F: HT-29. UTC, Controlo não tratado; CPT, camptotecina.

Citotoxicidade

As células foram colocadas em placas de 24 poços. Depois as células foram deixadas a recuperar durante 24 horas, NVX-412 foi adicionado em meio de crescimento fresco. A concentração de DMSO máxima alcançada em todas as experiências era inferior a 0,01%. experimentos de controle respectivos na maior concentração DMSO foram realizados, a fim de afastar os efeitos induzidos pela DMSO. Após 72 horas de incubação a proporção de células viáveis ​​foi determinada por celular contando com um Z1 Coulter Contador de Partículas (Beckman Coulter, Vienna, AUT), um ViCell XR (Beckman Coulter, Vienna, AUT) ou um Contador CASY® celular (Schärfe, Reutlingen , Alemanha). A citotoxicidade foi expressa como CI

50 valores que foram derivadas a partir das curvas de dose-resposta correspondentes.

clonogénicos Assays

células

Para os ensaios clonogénicos, HT-29 e HepG2 foram plaqueadas em 60 milímetros pratos a uma densidade de 1000 células por prato. Após 24 horas NVX-412 foram adicionados às concentrações indicadas. Após cultura durante 12-14 dias (quando as colónias eram visíveis avaliáveis), as colónias foram fixadas em etanol a 70%, coradas com 0,5% de violeta de cristal e contadas manualmente.

análise de Western Blot para p-p53 (Ser15) na células HCT116 depois de 24 e 48 horas de incubação com 0, 0,15, 0,5 e 1 uM NVX-412 e CPT 1 uM como controlo positivo. B: coloração por imunofluorescência Correspondente por p-p53 (Ser15) (verde) de células HCT116 depois de 24 horas de incubação com 0, 0,15, 0,5 e 1 uM NVX-412 e 1 uM de CPT como controlo positivo. Os núcleos são corados com Hoechst 33342 (azul). C: A confirmação do status de p53 em HCT116 p53 + /+ e p53 – /- células por immunoblotting. As células foram cultivadas na presença e na ausência de 375 uM de 5-FU durante 24 horas. D, E: Os números de células HCT116 de p53 + /+ ou p53 – /- (D), p53 RKO + /+ ou p53 – /- (E) células após 72 horas de incubação com NVX-412 ou nutlin-3. As células foram cultivadas durante 72 horas com diferentes concentrações de NVX-412 ou nutlin-3, respectivamente. os números de células viáveis ​​foram determinados utilizando um Beckman Coulter ViCell XR. Os dados representam valores médios (± DP) de dois experimentos independentes.

Proliferação Cinética

células HT-29 foram semeadas (2 × 10

4 células /poço) em 24 placas -Bem. Após um período de recuperação de 24 horas, NVX-412 foi adicionado em meio de crescimento fresco a uma concentração final de 0, 300 e 1000 nM, respectivamente. Depois de 24, 48 e 72 horas número de células foram determinadas com um Z1 Coulter contador de partículas.

Morfologia Ensaios

Para investigar alterações morfológicas potenciais no tratamento com NVX-412, HCT116, HeLa e HT- 29 as células foram plaqueadas em placas de 6 poços e incubadas durante até 72 horas, com as concentrações indicadas de NVX-412, DMSO como controlo do veículo e 1 uM a camptotecina (CPT) como um controlo positivo para a morfologia apoptótica. As experiências de controlo foram realizadas para assegurar que as alterações morfológicas não são devidas a diferenças na confluência. Depois de 24, 48 e 72 horas fotos foram tiradas com uma invertida sistema de microscópio e câmera Olympus IX71 (Olympus Cor View III) a 20 × ampliação.

A quantificação do tamanho das células

tamanhos de células foram quantificadas utilizando o software de imagem especializado (ImageJ 1.45d, EUA NIH, Bethesda, MD, EUA). áreas médias de todas as células presentes dentro de 5 campos de vista diferentes por amostra foram determinados após 48 horas de tratamento com 0, 0,15 e 1 PM NVX-412. O teste não paramétrico de Mann-Whitney foi utilizado para avaliar a significância estatística das diferenças entre os tamanhos de células, porque o teste de Kolmogorov-Smirnov mostrou que os dados não foram distribuídos normalmente (GraphPad Prism 5.0, La Jolla, CA, EUA).

a: ciclo celular análises por citometria de fluxo para HT-29, células HeLa e HCT116 tratados durante 24 horas, como indicado com NVX-412 ou CPT. As percentagens de células em G1, S e G2 /M fase do ciclo celular estão apresentados. As células foram analisadas usando um FACScan BD. B: NVX-412 reduz a replicação do ADN de uma forma reversível em células HeLa e células HCT-116. células HeLa e HCT116 foram tratadas durante 24 horas como indicado. Além disso, após 24 horas de tratamento as células foram deixadas a recuperar durante 24 horas em meio de crescimento normal, sem NVX-412 ou CPT. taxa de replicação do ADN foi analisada por incorporação de BrdU. C: Western Blot para pChk1 (Ser296) em células HCT116 após 0-48 horas de incubação com 150 nM NVX-412. D: NVX-412 induz γH2AX em células HeLa de uma maneira reversível. As células foram tratadas durante 3 horas e 24 horas como indicado. Além disso, após 24 horas de tratamento as células foram deixadas a recuperar durante 24 horas em meio de crescimento normal, sem NVX-412 ou CPT. Os dados representam a mudança vezes na intensidade média de fluorescência γH2AX por núcleo (± DP), como quantificada a partir de colorações de imunof luorescência. UTC, Controlo não tratado; CPT, camptotecina. Os valores médios de pelo menos 2 experiências independentes são apresentados. A análise estatística foi realizada com o GraphPad Prism 5.0. **** Indica p valor. 0,0001 (Two-way ANOVA)

Western Blot

As células tratadas foram diretamente lisadas em tampão de lise celular NP40 (Invitrogen, Grand Island, Nova Iorque, EUA) contendo inibidores de protease e fosfatase. As concentrações de proteína foram medidas por colorimetria (D

C Protein Assay, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA). As proteínas foram separadas por SDS – electroforese em gel de poliacrilamida e transferidos para membranas de nitrocelulose (Whatman ™, Viena, AUT). Carga igual foi verificada pela coloração de Ponceau S (SERVA, Heidelberg, GER). O antigénio ligado foi visualizado com o sistema de detecção de quimioluminescência aumentada (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, EUA). Estes procedimentos foram realizados de acordo com os protocolos do fabricante. Os anticorpos específicos para as seguintes proteínas de interesse foram utilizados: pChk1 (Ser296), p-p53 (Ser15), β-tubulina e GAPDH foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA) em 1:1000 diluição. Os anticorpos secundários foram marcadas com peroxidase de cabra anti-coelho ou IgG (Cell Signaling Technology)-rato anti (1:2000).

imunofluorescência de p-p53 (Ser15) e γH2AX (Ser139)

HCT116 e células HeLa foram semeadas em lamelas de vidro em placas de 6 poços. 24 horas após o plaqueamento, as células HCT116 foram incubadas com 0,15, 0,5 e 1 uM NVX-412 e CPT 1 uM durante 24 horas para a coloração de P-p53. Para investigar γH2AX, células HeLa foram incubadas com 0,21, 0,5 e 1 uM NVX-412 e CPT 1 uM durante 3 ou 24 horas. Além disso, as células foram deixadas a recuperar durante 24 horas em meio normal de crescimento após 24 horas de incubação com NVX-412 ou CPT (experimento wash-out). Após os respectivos tratamentos, as células foram lavadas e fixadas com 4% de formaldeído livre de metanol (Polysciences Inc., Warrington, PA, EUA) durante 15 minutos à temperatura ambiente e depois permeabilizadas com 0,2% de Triton X-100 /PBS durante 2 minutos à sala temperatura. Após bloqueio com soro de cabra (5%) em 1% de BSA /0,3% de Triton X-100 /PBS, adicionou-se o anticorpo primário correspondente e as células foram incubadas a 4 ° C durante a noite. Os anticorpos utilizados foram: rato p-p53 (Ser15) (Cell tecnologia de sinalização, Danvers, MA, EUA) em 1:100 diluição e rato P-H2AX (Ser139) (Millipore, Billerica, MA, EUA) na diluição em 1:1000 1% de BSA /PBS, respectivamente. As células foram então lavadas 3 vezes durante 10 minutos com 0,25% de BSA /0,1% de Triton X-100 /PBS e incubadas com o anticorpo conjugado anti-rato Alexa Fluor 488 derivado (1:1000 em 0,25% de BSA /0,1% de Triton X-100 /PBS) durante 1 hora à temperatura ambiente no escuro. As células foram lavadas 3 vezes durante 10 minutos com 0,05% de Tween-20 /PBS contendo Hoechst 33342 (Sigma Aldrich, Viena, AUT) e montadas com meio de montagem (Fluoprep, bioMérieux, Marcy l’Etoile, FRA). A fluorescência foi registada de imediato em um Zeiss LSM700 microscópio de varredura a laser.

Quantificação de γH2AX

O procedimento comum para avaliar a indução γH2AX é contar γH2AX focos. Uma vez que com NVX-412 e o controlo positivo de ativação CPT γH2AX foi que, há focos distintos e contáveis ​​fortes foram vistos. Por isso, foi determinada a intensidade média de fluorescência γH2AX por núcleo. Para este fim, as intensidades γH2AX dentro de um certo campo foram medidos utilizando Quantity One -4.6.9 (versão básica gratuito, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA) e foram divididos pelo número de núcleos neste campo.

Determinação da p53 status de dependência

As células de carcinoma do cólon HCT116 linhas isogénicas p53 + /+ ou p53 – /- e RKO p53 + /+ ou p53 – /- foram cultivadas em placas de 12 poços. Após um período de recuperação de 24 horas, NVX-412 ou nutlin-3 foi adicionada em meio de crescimento fresco, nas concentrações indicadas. Nutlin-3, um antagonista de MDM2 e p53, por conseguinte, activador via foi usado para provar os efeitos biológicos diferenciais do estado de p53. Após 24 ou 72 horas, os números de células foram determinados com um Beckman Coulter ViCell XR.

ADN de replicação Taxa

células HeLa e HCT116 foram plaqueadas em placas de 96 poços pretas. Depois as células foram deixadas a recuperar durante 24 horas NVX-412 ou CPT foi adicionado em meio de crescimento fresco. Após 24 horas de incubação de uma quimioluminescente incorporação de BrdU ELISA (Roche Applied Science, Penzberg, Alemanha) foi realizada com a metade das placas de acordo com o protocolo do fabricante. As células restantes nas placas foram deixadas a recuperar durante 24 horas em meio normal de crescimento antes da replicação de ADN foi medida (experimento wash-out). Para verificar se uma possível diminuição na taxa de replicação do ADN não é simplesmente devido ao número de células mais baixas por causa da indução da morte celular, a proporção de células viáveis ​​foi determinada em paralelo por um ensaio de citotoxicidade baseado em MTT de acordo com o protocolo do fabricante (EZ4U, Biomedica, Viena, Áustria). Colorimétrico (a 492 e 620 nm) e medidas quimioluminescentes foram realizadas utilizando um Fluostar OPTIMA (BMG Labtech, Ortenberg, Alemanha).

citometria de fluxo Análises do Ciclo celular

HT-29, HeLa e HCT116 As células foram plaqueadas em placas de 6 poços. Depois as células foram deixadas a recuperar durante 24 horas, NVX-412 foi adicionado em meio de crescimento fresco no respectivo IC

50 concentração e 0,5 e 1 uM. CPT foi utilizado a 50 nM e 1 uM. Para analisar a distribuição do ciclo celular, as células foram recolhidas após 24 horas de incubação e lavou-se com PBS. As células foram fixadas em etanol a 70% durante pelo menos 2 horas. Para a análise, as células foram transferidas para PBS, incubadas com ARNase A (concentração final de 0,04 ug /ml) durante 30 minutos a 37 ° C, tratou-se com 40 ug /mL de iodeto de propídio durante 30 min a 4 ° C e depois analisadas por citometria de fluxo BD utilizando FACScan (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, EUA). Os histogramas de ADN resultantes foram quantificadas utilizando ModFit LT (Verity Software House, Topsham, ME, EUA)

Análises Estatísticas

Se não for indicado o contrário, two-way ANOVA (análise de variância;. GraphPad Prism 5.0) foi utilizado para avaliar a significância estatística das diferenças entre os dados.

resultados

NVX-412 Exerce forte actividade anti-neoplásica

para obter uma visão geral independente do a gama de actividade de NVX-412 (Figura 1) contra um painel de linhas celulares de cancro bem descritos, o candidato a fármaco foi incluído em uma tela de actividade anti-cancro conduzida pelo NCI contra 59 linhas celulares tumorais humanas diferentes originários de vários cancro tipos. Esta tela revelou uma actividade anti-cancro muito forte e ampla de NVX-412 em linhas celulares tumorais de todos os tipos de cancro na gama nanomolar baixa com uma IC significativo

50 de cerca de 200 nM (Tabela 1). linhagens de células leucêmicas foram mais sensíveis com uma média IC

50 de 62 nM. Além do NCI-60 Humana DTP Tela linha tumoral celular (ver Tabela 2), as linhas celulares adicionais derivadas de diversas entidades tumorais e de duas espécies diferentes, incluindo células caninas células normais não cancerosas humanas e também foram testados. De acordo com os dados obtidos no ecrã de NCI, estes dados demonstram a actividade anti-cancro em todas as linhas celulares testadas em toda uma variedade de tipos de tumor. A Figura 2A mostra as curvas de dose-resposta para HT-29, adenocarcinoma do cólon, carcinoma hepatocelular HepG2, HeLa de carcinoma cervical e células de carcinoma do cólon HCT116, que são linhas de células utilizadas para todas as outras experiências no presente estudo. As células normais humanas endoteliais (HUVEC) e pré-adipócitos brancos humanos (HWP) exibido uma sensibilidade reduzida em comparação com as linhas celulares de cancro. Para as células HUVEC o IC

50 foi determinada a 2,0 mM e de pré-adipócitos brancos humanos HWP a 1,0 mM, respectivamente.

NVX-412 mostra a atividade Bi-modal e induz alterações morfológicas

para entender melhor os efeitos induzidos NVX-412, foram realizados experimentos de crescimento celular, sobrevivência celular e morte celular. ensaios de sobrevivência clonogénicas [18] foram realizadas com HepG2 e células HT-29. As células foram incubadas com diferentes concentrações de NVX-412 durante 12 ou 14 dias, respectivamente. Como pode ser visto na Figura 2B, NVX-412 reduziu a capacidade de HepG2 e células HT-29, para formar colónias de uma maneira dependente da dose. É de notar, a concentração de NVX-412 para conseguir efeitos metade do máximo determinado pelo ensaio clonogénico é semelhante à concentração tal como determinado pelo ensaio de proliferação de 3 dias. cinética de proliferação foi determinada ao longo de 3 dias de tratamento com células HT-29 do carcinoma do cólon (Figura 2C). No IC

50 (300 nM), a proliferação de células foi significativamente diminuída ao fim de 2 dias, em comparação com as células de controlo não tratadas. A concentrações acima do IC

50 (a 1 uM), os números de células começaram a diminuir abaixo dos números de células semeadas no início da experiência, o que sugere uma indução directa da morte celular, bem como a paragem do ciclo celular. Além disso, a morfologia das células expostas a NVX-412 quer no

50 ou mais elevadas concentrações de IC (1? M) foi investigada em HCT116, células HeLa e células HT-29 (Figuras 3A, C, E). O tratamento com NVX-412 no IC

50 levou a mudanças na aparência morfológica de todos os três tipos de células investigadas dentro de 24 horas; as células apareceram maior do que células não tratadas. DMSO sozinho como controlo de veículo não alterou o aspecto morfológico (controlo de DMSO não mostrado). Para investigar este fenómeno interessante em mais detalhe, os tamanhos de células foram quantificadas após 48 horas de tratamento com NVX-412. Um aumento altamente significativo no tamanho das células foi observada para todas as três linhas celulares testadas (Figura 3B, D, F). Durante as 48 horas seguintes uma diminuição de densidades celulares poderia ser observado para HCT116, células HeLa e células HT-29. No entanto, este quadro mudou drasticamente quando as concentrações mais elevadas de NVX-412 foram aplicadas. Mais uma vez, as células exibido uma aparência morfológica alterada e tamanho ampliado em comparação com células não tratadas (Figura 3), mas já após 48 horas, o número de destacada e células mortas aumentada (dados não mostrados), semelhantes ao tratamento com o indutor CPT morte celular.

Atos NVX-412 p53 Independência

Para investigar uma possível dependência status de p53 de NVX-412, foi determinado o estado de fosforilação da p53 em Ser15 [19], [20]. colorações de imunofluorescência para a p53 fosforilada no Ser15 foram realizados em células HCT116 depois de 24 horas de incubação com diferentes concentrações de NVX-412 (Figura 4B). Como esperado, as células tratadas com 1 uM de CPT foram positivas para a coloração nuclear de P-p53 (Ser15), enquanto que as células não tratadas foram claramente negativa. A incubação com o CI

50 concentração de NVX-412 não conduziu à p-p53 (Ser15) de coloração, enquanto que as células tratadas com concentrações mais elevadas (0,5 e 1 uM) apresentaram uma coloração positiva. Isto correlaciona-se com a análise de Western Blot que foi efectuada sob as mesmas condições e com os mesmos pontos de tempo após 24 e 48 horas (Figura 4A). Mais uma vez, as células não tratadas e células tratadas inferior ou igual ao IC

50 foram negativos para p53 fosforilado, ao passo que a experiência de controlo com CPT 1 uM e as células tratadas com NVX-412 em concentrações acima da CI

50 mostraram uma indução forte .

Para investigar ainda mais um potencial de dependência estado de p53 da actividade de nvx-412 dois modelos diferentes de linha celular isogénica diferindo apenas no seu estado de p53 foram investigados; células HCT116 com um p53 + /+ ou p53 – /-, fenótipo e células RKO com um p53 + /+ ou p53 – /- fenótipo. O estado de p53 das células foi confirmada por imunotransferência (Figura 4C). Na Figura 4D e 4E as curvas de dose-resposta para NVX-412 e o controlo nutlin-3 em p53 + /+ e p53 – /- células são mostrados. Pode ser demonstrado que em ambas as linhas celulares, HCT116 e RKO, o estado de p53 não influencia a sensibilidade à NVX-412; os valores de CI50 para as linhas celulares foram comparáveis ​​isogénicas. Em contraste com o que a resposta ao nutlin-3 mostraram uma dependência estado de p53 claro, com células p53 + /+ sendo muito mais sensível do que a p53 – /-. As células de detenção

NVX-412 induz a fase S, aumenta os níveis de marcadores de danos no DNA e reduz a replicação de DNA

com base nos resultados descritos acima, procuramos ganhar mais conhecimento sobre os efeitos do ciclo celular de NVX-412. Por isso, realizamos análises de ciclo celular por citometria de fluxo em, HeLa e HCT116 células HT-29. Em todas as três linhas de células investigadas um aumento dependente da dose na fracção de células em fase S, foi observada após 24 horas de incubação com NVX-412 (Figura 5A). Já depois de 24 horas de tratamento com NVX-412 no IC

50 concentrações observou-se um aumento no número relativo de células em fase S que se tornou ainda mais pronunciada com concentrações mais elevadas. Além disso, um aumento na população de células sub-G0 /G1, que é característica para células apoptóticas, foi observada com concentrações mais elevadas de NVX-412 e também da CPT (dados não mostrados). CPT serviu como controlo positivo para G2 /M ou prisão S-fase. Em células HeLa, HT-29 e CPT induzida G2 /M de captura a 50 nM e de detenção da fase-S a 1 uM. Em células HCT116 50 nM CPT induzida também prisão /M-fase G2, ao passo que numa concentração de 1 uM a maioria das células já foram mortos (não mostrado na figura). O atraso do ciclo celular observada por análise FACS é compatível com os resultados de ELISA de incorporação de BrdU que mostraram uma redução da replicação do ADN por tratamento NVX-412 em células HeLa e células HCT-116 (Figura 5B). Mais uma vez, a CPT foi usada como um controlo positivo para a redução da taxa de replicação do ADN. Curiosamente, quando as células foram deixadas a recuperar durante 24 horas em meio normal de crescimento após o tratamento de 24 horas, a replicação do ADN recuperado e a taxa aumentou para níveis normais, tanto em células HeLa e em células HCT116. Após o tratamento de CPT a recuperação apenas foi observada na concentração mais baixa testada. Para estudar um possível dano ao DNA efeito da NVX-412 induzindo, as mudanças no estado de fosforilação Ser296 de Chk1 foram investigados. A fosforilação foi encontrado para ser um aumento, após 4 horas de tratamento NVX-412, o que é indicativo de um efeito de dano do DNA (Figura 5C). Para acompanhar esta observação, a indução de γH2AX focos foi determinado por imunofluorescência em células HeLa (Figura 5D). níveis γH2AX foram encontrados como sendo elevados, após um tratamento de 24 horas de um modo dependente da dose. De acordo com a capacidade das células para re-estabelecer a sua taxa de replicação do ADN normal depois de um período de 24 horas de recuperação (Figura 5B), os níveis de γH2AX diminuiu para níveis quase basais dentro de 24 horas após a retirada do NVX-412 (Figura 5D, barras pretas ). O efeito de 1 uM CPT que foi utilizado como controlo positivo para a indução γH2AX não foi reversível.

Discussão

Foi investigada a actividade anti-neoplásica de NVX-412, um novo candidato a fármaco. Em uma tela abrangente realizada pelo NCI, NVX-412 foi encontrada a exercer uma forte actividade anti-cancro na gama submicromolar com uma média de IC

50 de 200 nM para todas as linhas celulares combinados. dados adicionais recolhidos a partir de 21 linhas celulares de cancro sublinhou a atividade anti-câncer potente de NVX-412. Nossas descobertas iniciais fornecer primeira evidência de que NVX-412 é uma pesquisa interessante -. Droga candidatos fase que pode ser promissora como uma nova terapêutica, particularmente contra doenças malignas hematológicas

ensaios de sobrevivência clonogénicos demonstrou que NVX-412 significativamente reduzida ou completamente bloqueou a capacidade das células HepG2 e células HT-29 de modo a formar colónias. Estes resultados bem confirmou os resultados de experiências de proliferação a curto prazo.