Abstract
Os microRNAs (miRNAs) importantes para a expressão do gene pós-transcricional estão envolvidos na iniciação e progressão do cancro humano. Neste estudo, nós relatamos que
miR-26a
foi sobre-expresso em espécimes EOC humanos e o nível de extracelular
miR-26a
no plasma pode distinguir pacientes de controles saudáveis na EOC expressão. A expressão ectópica de
miR-26a
no cancro do ovário (OC) células aumento da proliferação celular ea formação clonal. Este crescimento efeito de promoção do crescimento celular OC foi mediado pelo
miR-26a
inibição da posttranscription de ER-α. Além disso, a inibição da
miR-26a
suprimiu a formação de tumores gerados pela injeção de células OC em ratinhos nus. Nossos resultados sugerem que expressão aberrante
miR-26a
podem contribuir para o desenvolvimento OC
Citation:. Shen W, Song M, Liu J, Qiu G, Li T, Hu Y, et al. (2014)
miR-26a
Promove Ovarian Cancer Proliferação e Tumorigênese. PLoS ONE 9 (1): e86871. doi: 10.1371 /journal.pone.0086871
editor: Jin Q. Cheng, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América
Recebido: 17 de junho de 2013; Aceito: 16 de dezembro de 2013; Publicação: 22 de janeiro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Shen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi patrocinado por doações do Projeto No. 30571836 do NNSF (National Natural Science Foundation) da China. Além disso, o trabalho apresentado é parte de projetos com o Project No.L2010681 financeiramente apoiados pela Science Foundation, do Departamento de Liaoning Província da China, e do Projeto No.201202259 Educação apoiado financeiramente pela Science Foundation da Ciência e Tecnologia Bureau da província de Liaoning da China . Autor Min Canção contribuiu para conceber experimental e design, orientação e discussão do projeto, de modo que ela é o autor co-correspondência deste papel. Todos os outros financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
OC é o quinto câncer mais comum em mulheres ea principal causa de mortes por câncer de malignidade ginecológica nos países ocidentais [1]. Em 2012, há 22,280 novos casos e 15.500 mortes por OC nos Estados Unidos, de acordo com as estatísticas nacionais de cancro. EOC é responsável por 85% -90% de câncer de ovário. Infelizmente, o prognóstico é pobre e os eventos moleculares que levam ao desenvolvimento da doença ainda é pouco conhecido.
MiRNAs representam uma grande família de RNAs não codificantes endógenos e posttranscriptionally regular a expressão do gene [2]. Estudos recentes revelaram funções críticas de miARNs em processos essenciais, incluindo a proliferação, diferenciação e morte celular [3]. expressão alterada ou mutação de miRNAs tem sido relatada em câncer, como câncer de pulmão, câncer de mama, leucemia e outros carcinomas [4]. Em células de câncer de pulmão, a sobre-expressão de
let-7
inibiu seu crescimento, visando Ras [5], [6]. Além disso,
miR-21
visa diretamente o supressor de tumor PTEN no cancro hepatocelular [7]. Além disso, vários estudos mostraram que miARN pode funcionar como supressores de tumor (como é o caso para o
miR-15a-miR-16-1
cluster de [8]) ou oncogenes (como é o caso para
miR-21
[
9
]).
ampla Genome-expressão miRNA perfil mostrou
miR-26a
desregulação em cancros diferentes [10]. Neste estudo, verificou-se que
miR-26a
é sobre-expresso em EOC humano. Nós demonstramos que a inibição da
miR-26a
diminuição da proliferação de células EOC humanos, e suprimiu o crescimento de células EOC em ratinhos nus. Além disso, ERa foi regulada pelo
miR-26a
em células EOC. Além disso, descobrimos que extracelulares
os níveis de miR-26a
no plasma pode distinguir pacientes de controles saudáveis na EOC. Nosso estudo sugere que a expressão aberrante de
miR-26a
é fundamental para o desenvolvimento da EOC humana e medição de circular
miR-26a
pode ser uma boa abordagem para o diagnóstico EOC.
Materiais e Métodos
Os pacientes
espécimes clínicos (incluindo amostras de tecidos e plasma) foram coletadas de pacientes cadastrados no primeiro Hospital Afiliado da China Medical University (Shenyang, China). A informação do paciente é resumida na Tabela 1, Tabela S1 e S2 tabela.
Materiais
anticorpo contra ERa foi a partir de Santa Cruz (Santa Cruz, CA, EUA), anticorpo contra α -tubulina a partir de Sigma (St. Louis, MO, EUA). Todos os outros reagentes foram da Sigma. Anti-miR-26a e sem sentido anti-miR eram de GenePharma (Xangai, China). Cel-miR-39 imita eram de IBS (Xangai, China).
quantitativo RT-PCR
(qRT-PCR, Quantitative polimerase-transcriptase reversa Chain Reaction)
o RNA total isolado a partir de amostras clínicas ou células usando Trizol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) foram sujeitos a transcrição reversa em cDNA de acordo com o relatório anterior [11]. Isolamento de ARN a partir de plasma e quantificação de miARN foram efectuadas tal como descrito em [12]. Em resumo, 25 fmol de Cel-miR-39 imita foi adicionado a 400 ul de plasma. PCR em tempo real foi realizado utilizando SYBR Green PCR mestre mistura (Takara, Otus, Shiga, Japão). A amplificação e a detecção foram realizadas utilizando o sistema ABI Prism 7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) de acordo com as instruções do fabricante. Cel-miR-39 foi feita como gene de referência em amostras de plasma. Os iniciadores utilizados foram listadas na Tabela S3.
Cultura celular
As linhas celulares OC humanos, SKOV-3, ES2 (Cellbank, Shanghai, República Popular da China) foram mantidas em 5a de McCoy suplementado com 10% (v /v) de soro fetal de vitelo (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Estas células foram incubadas a 37 ° C com 5% de CO
2.
Construção do vetor
de comprimento completo humana
miR-26a
foi amplificado a partir de ADN genómico humano e clonado no pcDNA3.1 em locais KpnI e XhoI de acordo com o relatório anterior [13] e [14]. A de tipo selvagem humano ERa foi gerado por PCR a partir de cDNA e os produtos de PCR foram inseridos em pcDNA3.1 como descrito em [15].
Ensaio de Crescimento de Células
O crescimento celular foi estimada por determinação do número de células e a formação de colónias. As células foram transfectadas com
miR-26a
ou anti-miR-
26a
usando FuGene HD (Roche, Indianapolis, IN) de acordo com o protocolo do fabricante. Após cultura durante 24 horas as células foram semeadas numa densidade inicial de 1 x 10
5 por 35 milímetros-prato. As células foram então recolhidas nos tempos indicados e os números foram contadas utilizando o COULTERTM (Beckman, Fullerton, CA, EUA).
Células transfectadas com
miR-26a
foram semeadas em 96 cavidades placas a uma concentração de 2,5 × 10
3 células, e medidos após 48 h utilizando um ensaio de WST-1 (Boster, Wuhan, China), realizada de acordo com o protocolo do fabricante.
um total de 500 células transfectadas com
miR-26a
ou vazio vector (Ctrl) foram semeadas em 35 pratos mm separadamente em triplicado. Três semanas mais tarde, as colónias foram fixadas com paraformaldeído a 4%, permeadas com metanol a 20% e coradas com violeta de cristal. As células coradas foram eluídas por 10% de ácido acético glacial e os valores de OD595 foram medidos por espectrofotometria como o indicador do número de células.
Luciferase Reporter Assay
1,5 × 10
5 SKOV3 estável células em pratos de 35 mm, foram co-transfectadas com pGL3-ERa-WT (1 ug) ou pGL3-ERa-Mut (1 ug) e pRL-TK (1 ug) a utilizar.
FuGENE® HD Transfection Reagent (Roche, Diagnostics Corp., Indianapolis, IN) seguindo o protocolo do fabricante. Quarenta e oito horas após a transfecção, a actividade de luciferase foi medida utilizando um sistema de ensaio de repórter de luciferase duplo (Promega) e normalizada para a actividade da luciferase de Renilla.
Western Blotting
As proteínas foram separadas em SDS-8% PAGE, transferidos para membranas de PVDF (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido) e sondadas com anticorpos primários e anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano. As bandas de proteínas foram visualizados pelo sistema Amersham ECL e digitalizada. Suas densidades foram determinadas por ImageQuant 5,2 software (Amersham).
In vivo Tumorigênese
células SKOV3 transfectadas com
miR-26a
ou anti-miR-
26a
separadamente. Cada ratinho nu foi injectada subcutaneamente com 2 x 10
6 células SKOV3 transfectadas. Trinta ou trinta e cinco dias após a injecção os ratinhos foram mortos e os tumores foram retirados. O diâmetro maior e menor do tumor foi observado como D1 e D2. O volume do tumor foi calculado utilizando a equação: V = d1 d2 × × D2 /2. O peso do tumor foi então medida.
Estatísticas
As comparações múltiplas foram avaliadas pelo software estatístico SPSS para análise estatística. Teste de Wilcoxon e Krusikal Wallis H teste foram utilizados na análise estatística das amostras dos pacientes. Outras comparações entre grupos de significância estatística foram realizadas com o teste t de Student e análise de variância (ANOVA). Os resultados foram considerados significativos a diferença * P 0,05; ** P . 0,01
Ética Declaração
A pesquisa atende a todos os requisitos para a ética do experimento. As amostras clínicas foram coletadas com o consentimento dos pacientes e voluntários saudáveis e aprovação do Comitê de Ética de Pesquisa Médica do Primeiro Hospital Afiliado da China Medical University. Todos os participantes forneceram seu consentimento informado por escrito para participar neste estudo. Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional animal da China Medical University.
Resultados
aumento da expressão de miR-26a de Espécimes e Plasma em EOC Humano
tem sido observado que o nível de expressão
miR-26a
foi diminuído ou aumentado em malignidades humanas, tais como carcinoma da mama [16], carcinoma da nasofaringe [17], [18], glioblastoma e [19] , indicando um papel complicado de
miR-26a
na progressão dos tumores malignos. Para investigar o possível papel da
miR-26a
no desenvolvimento EOC, primeiro analisou a expressão de
miR-26a
em amostras de plasma e em EOC por SYBR-Green haste-laço qRT-PCR [20]. Foi examinada a expressão de
miR-26a
em 26 amostras de tumores e 19 ovários normais. Como mostrado na Figura 1A, os níveis de
miR-26a
em amostras de tumores de expressão foram muito mais elevados do que aqueles em amostras normais de ovário. Do mesmo modo, as concentrações de
miR-26a
eram mais elevados no plasma de doentes EOC (n = 17) do que no que a partir de controlos saudáveis (n = 13) (Figura 1B). Juntos, estes resultados fornecem-nos uma evidência inicial de que
miR-26a
pode desempenhar um papel no desenvolvimento da EOC humano.
(A) Análise quantitativa dos níveis de expressão
miR- 26a
EOC em amostras normalizadas para as de rRNA 18S por qRT-PCR. Os dados para cada ponto foram valor médio de uma amostra repetida em três experiências independentes (normal, n = 19; tumoral, n = 26). ** P 0,01 vs normal. (B) A análise quantitativa dos níveis de expressão de plasma
miR-26a
por qRT-PCR. Os dados para cada ponto foram valor médio de uma amostra repetida em três experiências independentes (normal, n = 13; tumoral, n = 17).
que sobre-expressam o miR-promovido 26a celular Crescimento EOC e inibindo miR-26a suprimida EOC Proliferação celular
a seguir, analisou se
miR-26a
afeta o crescimento celular EOC usando células SKOV3 e ES2 como modelos. Como mostrado na Figura 2A, a capacidade de crescimento de células SKOV3 e ES2 foi aumentada por sobre-expressão de
miR-26a
. Pelo contrário, a proliferação das células transfectadas com anti-miR-26a foi marcadamente diminuída em comparação com a das células transfectadas com contra-senso (Figura 2B). WST-1 ensaio mostrou resultados semelhantes em proliferação das células (Figura 2C). Estes resultados sugerem que
miR-26a
fato afetou o crescimento celular EOC.
As curvas de crescimento de SKOV3 (A) ou ES2 (B) células transfectadas com
miR-26a
( painel da esquerda) ou anti-miR-26a (painel direito). Os números de células foram normalizados para aqueles em 0 horas. Os dados foram média ± d.p. de três experiências independentes em triplicado. * P 0,05, ** p 0,01 vs vector vazio (Ctrl) ou um controlo negativo (CN). proliferação (C) celular transfectada com
miR-26a
foi medida por um ensaio de WST-1. Os dados foram média ± d.p. de três experiências independentes em triplicado. ** P 0,01 vs vector vazio (Ctrl) (D) Quantificação das colônias formadas por Ctrl ou
miR-26a
células transfectadas. Os dados foram média ± d.p. de três experiências independentes. ** P . 0,01 vs Ctrl
A noção foi ainda testado no ensaio de formação clonal. O número e tamanho das colónias formadas foram significativamente aumentada em
miR-26a
células transfectadas (Figura 2D). Juntos, estes resultados sugerem que
miR-26a
estava realmente envolvido na regulação do crescimento celular EOC.
ERa era um gene alvo de miR-26a em Células EOC
em seguida, investigou os mecanismos pelos quais
miR-26a
promover a proliferação de células EOC. Em pacientes com carcinoma hepatocelular, a expressão de
miR-26a
foi maior nas mulheres do que nos homens [21]. Além disso,
miR-26a
regulada crescimento de células tumorais do fígado, visando ERa [22]. Como mostrado na Figura 3A, a actividade de luciferase pGL3-de ERa-WT nas células SKOV3-stable1 (S1) foi muito menor do que nas células de controlo. A actividade luciferase de pGL3-ERa-Mut foi resgatado em células Stable1. A seguir, analisou se
miR-26a
poderia regular a expressão ERa endógena em células EOC. Comparado com o controle, os níveis endógenos de mRNA ERa (Figura 3B) e níveis de proteína (Figura 3C) foram regulados negativamente quando as células foram transfectadas com
miR-26a
.
(A) células estáveis 1 (S1) foram transfectadas com pGL3-ERa-WT (WT) ou vector repórter pGL3-ERa-Mut (MUT). Os dados foram média ± d.p. de três experiências independentes. ** P 0,01 vs células de controlo (Ctrl). (B) A análise quantitativa dos níveis de expressão de ERa em Stable1 (S1), Stable2 (S2) e células de controlo (Ctrl) foram determinadas e normalizadas para os níveis de ARNm de GAPDH. * P 0,05, ** P 0,01 vs Ctrl. (C) análise de Western-blot de lisados de células totais extraídas a partir de células estáveis indicados utilizando os anticorpos indicados. Dados era representativa de três experiências independentes e quantificação normalizada com o Ctrl. Tubulina serviu como um controlo de carga. (D) As curvas de crescimento de células de S1, S2 e CTRL. Os dados foram média ± d.p. de três experiências independentes em triplicado. * P 0,05, ** P 0,01 vs Ctrl. (E) Sobre-expressão de ERa diminuiu o crescimento das células após a transfecção S1. Os números de células foram normalizados para células Ctrl. Os dados foram média ± d.p. de três experiências independentes em triplicado.
miR-26a controlada a proliferação de células EOC através ERa
Dado o fato de que
miR-26a
estava envolvido na proliferação de células EOC e eRa foi alvo de
miR-26a
, nós próxima testaram se sobre-expressão de eRa poderia resgatar a promoção da proliferação de
miR-26a
em células EOC. Além disso, a expressão estável de
miR-26a
em dois clones de células SKOV3 (S1 ou S2) aumentou o crescimento das células de cerca de 1,58 ou 1,37 vezes, respectivamente (Figura 3D). QRT-PCR análise mostrou que
miR-26a
nível de expressão foi aumentado bastante em S1 e S2 células (Figura S1). Como se mostra na Figura 3E, enquanto que o crescimento de células transfectadas com ERa S1, não eram diferentes das células de controlo. Estes resultados indicam que
miR-26a
proliferação controlada de células EOC através da regulação da expressão ERa.
miR-26a promoveu o desenvolvimento de tumor em ratinhos nus
Para fornecer direta evidência de que
miR-26a
foi responsável pelo desenvolvimento de EOC, as células SKOV3 transfectadas com
miR-26a
ou anti-miR-26a foram injectados no flanco de ratinhos nus, como descrito. Uma semana após a implantação, os tumores de xenoenxerto pode ser visto. Depois de trinta ou trinta e cinco dias, todos os ratinhos nus foram mortos e os tumores foram retirados e pesados. Na observação macroscópica, as diferenças no tamanho do tumor e o volume entre os dois grupos foram indicados. O volume tumoral gerado a partir do vector vazio foi de 0,435 ± 0,042 (cm
3, P 0,01), que em
miR-26a
grupo foi de 0,829 ± 0,172 (cm
3, P 0,01) (Figura 4A), que no grupo de controlo negativo foi de 0,941 ± 0,163 (cm
3, P 0,01), e que, em anti-miR-26a foi 0,248 ± 0,05 (cm
3, P 0,01) ( A Figura 4B). O peso médio do tumor gerado a partir do vector vazio foi de 0,433 ± 0,07, enquanto que o peso médio do tumor gerados a partir de
miR-26a
era 0,821 ± 0,02 (g, P 0,01). O peso médio do tumor foi gerado a partir de absurdo 1,062 ± 0,169, ao passo que o peso médio do tumor gerados a partir de anti-miR-26a foi 0,473 ± 0,05 (g, P 0,01), respectivamente. Os resultados mencionados acima sugerem que o
miR-26a
foi fundamental para o desenvolvimento da EOC
in vivo
.
formação de tumores gerados pelas células SKOV3. (A) transfectadas com
miR-26a
ou anti-miR-26a (B) Ratinhos nus foram injectados por via subcutânea com 2 × 10
6 células transfectadas. Imagens representativas, medição do volume final e o peso dos tumores formados. Os tamanhos de tumor foram medidos e calculados em Materiais e Métodos. Os dados foram: a média ± D.P.. de 4-6 ratos. ** P . 0,01 vs vector vazio ou absurdo
Discussão
Neste estudo, nós mostramos que o nível de expressão
miR-26a
foi muito maior em amostras de EOC humanos e sangue baseado no
miR-26a nível
pode distinguir pacientes de controles saudáveis na EOC. Nossos resultados também mostraram que o nível de
miR-26a
afetado o crescimento celular EOC na cultura expressão. Além disso, ERa foi alvo de
miR-26a
em células EOC. Além disso, o nível de
miR-26a
afetados formação de tumores em ratinhos nus expressão. Por conseguinte, os nossos resultados são consistentes com a ideia de que um
miR-26a
é crítico para o desenvolvimento de EOC humano.
MicroRNAs são conhecidos para regular a expressão de genes envolvidas em diversos processos biológicos, tais como desenvolvimento, proliferação, apoptose e resposta ao stress [23]. Estudos recentes mostraram uma relação directa entre miRNAs e cancros humanos [4], [24], [25], [26]. MiRNAs pode ser miRNA oncogênicos (oncomirs) ou supressor de tumor relevante para o câncer. Como mostrado anteriormente, a perda de oncogénica
miR-21
, agindo para reprimir a expressão RHOB, está associada com uma elevação de RHOB em células de cancro de carcinoma hepatocelular e da mama [13]. A importância de outros miRNAs, tais como
let-7
,
miR-16
,
miR-126 Comprar e
miR-125b
também tem sido demonstrado [27]. mostras recentes perfil microarray de dados
miR-26a
desregulação no câncer diversa [4]. No cancro do fígado,
miR-26a
protege o tecido hepático normal de uma inflamação que promovem a carcinoma hepatocelular [21], e parece antagonizar o cancro humano da mama [16] e rabdomiossarcoma [28]. Pelo contrário,
miR-26a
facilita a formação de glioblastoma como um oncogene [19]. Os resultados obtidos a partir de ganho de função e perda de função abordagens indicou que
miR-26a
promoveu a proliferação e inibição da
miR-26a
suprimiu a proliferação celular EOC.
Em câncer de ovário, expressão ERa foi estudado para correlacionar chlinico-patológicos parâmetros e prognóstico [29], [30]. estudo anterior mostrou que não revelou quaisquer correlações com o tipo histológico do tumor e classificação do cancro do ovário [30]. análise de sobrevida univariada revelou que os pacientes com sorologia positiva-ERa tinha uma melhor sobrevida livre de progressão significativa em comparação com os pacientes sem expressão [31]. Em nossos resultados, a expressão de
miR-26a
em amostras de plasma e em EOC eram muito mais elevados do que aqueles em amostras de ovário normal, e
miR-26a
promover a proliferação de células EOC, visando ERa. Isso significa que
miR-26a
pode ser um fator importante na sobrevivência de câncer de ovário.
biomarcadores circulantes são utilizados para diagnóstico doença, monitorar efeito terapêutico e prever recorrência em aplicações clínicas. A descoberta de miARNs circulante em pacientes com cancro indica a sua potencial aplicação como biomarcadores poderosas em diagnósticos de cancro [32]. Estudos recentes revelaram que miARNs relacionadas com cancro poderia estavelmente detectável no plasma e no soro, que se originam a partir de tecidos de cancro [4], [33]. Nossos resultados investigar a possibilidade de
miR-26a
aplicado como um biomarcador em ambiente clínico através da análise da expressão de
no plasma de pacientes EOC miR-26a.
Em conclusão , a inibição da
miR-26a
diminuiu o crescimento de células EOC em cultura e em ratinhos nus.
miR-26a
afetados proliferação de células EOC alvejando ERa. Uma implicação importante do estudo é que
miR-26a
pode ser um alvo potencial para intervenção terapêutica para EOC humano.
Informações de Apoio
Figura S1.
miR-26a
nível de expressão foi aumentado bastante em células S1 e S2. QRT-PCR determinou os níveis de
miR-26a
em células S1 e S2 de expressão. Os dados foram média ± d.p. de três experiências independentes em triplicado. . ** P 0,01 vs Ctrl
doi: 10.1371 /journal.pone.0086871.s001
(DOC)
Tabela S1.
dados clínico-patológicas e
miR-26a
nível de controle de expressão
doi:. 10.1371 /journal.pone.0086871.s002
(DOC)
Tabela S2.
dados clínico-patológicas e
miR-26a
nível de expressão de pacientes com câncer ovariano
doi:. 10.1371 /journal.pone.0086871.s003
(DOC)
Tabela S3.
Primers utilizados na quantitativo RT-PCR
doi: 10.1371. /journal.pone.0086871.s004
(DOC)