Abstract

Fundo

onc�ise mediada por vírus é uma nova abordagem terapêutica do cancro com o potencial de ser mais eficaz e menos tóxicos do que as terapias actuais devido aos agentes de crescimento selectivo e amplificação em células de tumor. Até à data, estes agentes têm sido altamente segura em pacientes, mas, em geral ficado aquém do seu valor terapêutico esperado como monoterapias. Consequentemente, são necessárias novas abordagens para a geração de oncolytic vírus altamente potentes. Para atender a essa necessidade, desenvolvemos um novo método que nós termo “Directed Evolution” para a criação de oncolytic vírus altamente potentes.

Metodologia /Principais Achados

Tomando a abordagem “Directed Evolution”, a diversidade viral foi aumentado, reunindo um conjunto de sorotipos, em seguida, passagem das piscinas em condições que convidam a recombinação entre os serotipos. Estes altamente diversas piscinas virais foram então colocadas sob selecção dirigida rigorosas para gerar e identificar agentes altamente potentes. ColoAd1, um vírus quimérico Ad3 /Ad11p complexo, foi o vírus oncolítico inicial, determinada por este nova metodologia. ColoAd1, o primeiro descrito Ad oncolytic não baseada em Ad5, é de 2-3 registros mais potente e selectivo do que os sorotipos mãe ou o Ad oncolytic clinicamente mais avançado, ONYX-015,

in vitro

. eficácia do ColoAd1 foi ainda testado

in vivo

num modelo de xenoenxerto metástase hepática câncer de cólon após a injecção intravenosa e sua

ex vivo

seletividade foi demonstrado em tecidos de tumor colorectal humanos cirurgicamente derivados. Por fim, demonstramos a capacidade de armar ColoAd1 com um gene exógeno que cria o potencial para impactar o tratamento de câncer em vários níveis a partir de um único agente.

Conclusões /Significado

Usando a “Evolução dirigida “metodologia, têm gerado ColoAd1, um novo vírus oncolytic quimérico.

In vitro,

este vírus demonstraram a aumento de 2 log em ambas potência e selectividade quando comparado com ONYX-015 em células de câncer de cólon. Estes resultados foram confirmados por

in vivo

e

ex vivo

estudos. Além disso, estes resultados validaram esta metodologia como uma nova abordagem geral para derivar, altamente potentes virotherapies anti-câncer clinicamente relevantes

Citation:. Kuhn I, Harden P, Bauzon M, Chartier C, Nye J, Thorne S, et al. (2008) Evolução dirigida Gera um vírus Novel Oncolíticos para o tratamento de cancro do cólon. PLoS ONE 3 (6): e2409. doi: 10.1371 /journal.pone.0002409

editor: Dong-Jin Yan, da Universidade de Hong Kong, China

Recebido: 15 de fevereiro de 2008; Aceite: 30 de abril de 2008; Publicado: 18 Junho 2008 |

Direitos de autor: © 2008 Kuhn et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Estes estudos foram apoiados na sua totalidade pela Bayer Healthcare Farmacêutica

CONFLITO dE iNTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O desenvolvimento de tratamentos eficazes para a sólida humana tumores continua a ser um desafio significativo para os pesquisadores de câncer e oncologista iguais. Isto é devido à complexidade de tumores sólidos humanos, com múltiplos, caminhos, por vezes redundantes interagindo sinalização [1], as diferenças população de pacientes [2], e a capacidade de adquirir resistência aos tratamentos, incluindo as terapias moleculares recentemente desenvolvido direcionados, tais como erlotinib, gefitinib, imatinib e [3]. Consequentemente, os novos agentes, com mecanismos de acção único capaz de enfrentar essa complexidade, são necessários.

oncolytic vírus são agentes anti-câncer únicas capazes de amplificar a dose de entrada através da replicação de uma forma dependente do tumor. adenovírus humano (DA) é uma de uma série de vírus a ser desenvolvidos como agentes oncolíticos para tratar doenças malignas humanas [4]. Os primeiros estudos clínicos e estudos pré-clínicos têm demonstrado sinergia deste tipo de terapia do cancro romance com o padrão da quimioterapia cuidados [5] e radiação [6], [7], [8]. No entanto, enquanto os anúncios oncolíticos testadas em ensaios clínicos demonstraram segurança marcada, eles mostraram eficácia clínica limitada como monoterapias [9], [10], [11], [12]. Consequentemente, várias abordagens têm sido exploradas para aumentar a sua potência (definida como a capacidade vírus se replicar, as células lisam, e propagação), incluindo o aumento da eficiência da lise celular [13], [14], [15], [16], [17], [18], infecciosidade [19], e “armar”-los com transgenes terapêuticos [20].

Há 51 serotipos Ad humana definidos, agrupados a-F e estes sorotipos diferem em uma variedade de níveis (por exemplo, a patologia nos seres humanos e roedores, propriedades hemagglutinatin, receptores celulares). No entanto, com excepção das alterações de fibras [19], os serótipos alternativos Ad humanos para o serotipo Ad5 bem estudados foram ignorados. Assim serótipos alternativos podem representar uma avenida inexplorado para o desenvolvimento de virotherapies mais potentes.

Para explorar plenamente o seu potencial, utilizamos uma metodologia que chamamos “Directed Evolution”, em que grupos de sorotipos de anúncios, representando os diferentes subgrupos de anúncios, são passadas em linhas celulares de tumores humanos representativos dos principais indicações de tumor sólido (mama, cólon, pâncreas, próstata) para convidar a recombinação e a selecção de variantes ou serotipos virais potentes. Esta abordagem simples, não prejudicada utiliza a complexidade da célula tumoral humana para dirigir a evolução de seleccione, anúncios altamente potentes da piscina e é muito atraente, uma vez que pode ser dirigida para um resultado (por exemplo, o desenvolvimento de um vírus mais lítico) sem prejuízo para o mecanismo (s) que podem ser responsáveis ​​para que o resultado (por exemplo, eficiência da lise celular, a infecciosidade, a replicação do ADN virai). ColoAd1, um vírus isolado a partir do conjunto viral células do cólon linha-passadas, exibida potência superiores a Ad5 a uma série de linhas de células de tumor do cólon, e uma maior janela terapêutica de uma colecção de linhas de tumor de cólon e células normais primários do que o recentemente aprovado e virotherapy comercializado, ONYX-015 /H101 [21]. A potência superior foi ainda demonstrada

in vivo

em um modelo de semeadura tumor do fígado ea seletividade foi validado em tecido de cancro do cólon clinicamente excisadas. Além disso, demonstrámos que podemos “armar” este novo agente através da incorporação de transgenes no genoma viral sem comprometer a potência do agente, aumentando assim o potencial deste agente para lidar com a complexidade de tumores sólidos humanos. Esta é a primeira descrição de um anúncio oncolítico base não-Ad5, e a exploração dos serotipos Ad alternativos marca uma nova abordagem para o desenvolvimento de vírus oncolí ticos mais potentes e selectivos para o tratamento de cancros humanos.

resultados

Evolução dirigida de serótipos de adenovirus agrupados em diferentes linhas celulares de tumor deriva distintamente diferentes piscinas virais que são superiores a Ad5 em potência

a estratégia Evolução dirigida descrito nos Materiais e Métodos (Figura 1

um

) é uma abordagem imparcial para determinar se os serótipos alternativos, ou seus recombinantes, são superiores a Ad5 em potência (o serotipo de todos os anúncios oncolíticos correntes) em linhas celulares de cancro humano. Como um método de baixa resolução para controlar alterações durante a passagem da piscina viral e caracterizar a natureza homogênea /heterogéneo da piscina viral final, as piscinas foram examinados numa coluna de troca aniônica TMAE tirar partido das diferenças de carga do capsídeo viral associados a cada sorotipo (Figura 1

B

). Cada piscina viral recolhida das diferentes linhas de células, após a passagem 20 eluiu como um único pico com tempo de retenção diferente (Figura 1

C

). Cada pico de eluição de uma piscina viral passadas apareceu para rastrear com um dos serotipos original (Figura 1

B

). Isto sugere que todos os vírus não são iguais na sua potência numa dada linha de células de tumor e que as diferenças de linhas de células tumorais pode seleccionar a presença de vírus específicos de um conjunto de vírus misto. Desde pelo menos duas dessas piscinas virais selecionados não pista com o tempo de retenção Ad5, Ad5 não está (com base na potência) o melhor vírus para derivar todos os anúncios oncolytic.

A,

Representação do processo Directed Evolution (ver Materiais e Métodos para a Descrição detalhada).

B,

cromatogramas de cada serotipo Ad pura incluído no pool começando sorotipo mista da qual ColoAd1 foi selecionado.

C,

Cromatogramas da passagem 20 piscinas virais derivados de HT-29, Panc-1, linhas de células de tumor MDA-231, e PC-3, respectivamente. Os tempos de retenção diferentes destas piscinas são consistentes com o serótipo predominante da piscina sendo Ad5 ou Ad40 para o pool de Panc-1, Ad11p para o pool de HT-29, Ad3 ou Ad4 para o PC-3 da piscina, e de Ad5 ou Ad40 para a piscina MDA-231.

o ensaio MTS foi utilizado para comparar a potência dos diferentes reservatórios virais seleccionados para o conjunto inicial serotipo misturados e a Ad5. Todas as piscinas virais seleccionados aumento na potência relativa a Ad5 ou a piscina de partida, com a magnitude do aumento varia significativamente entre os grupos. O maior aumento na potência relativa a Ad5 foi observada na piscina passados ​​na linha de células de tumor de cólon HT-29 (cerca de 2 aumento de log) com o menor aumento (1,2 vezes) observado na piscina derivado de passagem sobre o celular MDA-231mt1 line (Tabela 1).

ColoAd1 é altamente potente e selectivo oncolytic vírus

uma vez que a piscina viral passados ​​em células HT-29 exibido o maior aumento de potência em seu celular cognato linha, vírus dentro desta piscina foram perseguidos para posterior caracterização. vírus individuais purificados por placa foram isolados e rastreados por ensaio de MTS para o seu potencial lítico sobre a linha celular de tumor HT-29. A potência das placas individuais foi comparada com a do conjunto de HT-29, a partir do qual foram isolados. Os vírus purificados por placa foram encontrados para ser igual ou maior em potência do que a piscina HT-29. O mais potente destes vírus purificados em placa, denominado ColoAd1, foi escolhido para posterior caracterização.

Enquanto ColoAd1 foi seleccionado por crescimento na linha celular de tumor do cólon HT-29, não era claro se este vírus tinha aumentado potência em todas as linhas de células de tumor, era selectiva para linhas celulares de tumor do cancro do cólon, ou era mais potente em todos os tipos de células, incluindo células normais primárias. Para lidar com as duas primeiras questões, ColoAd1 foi testada pelo ensaio de MTS em todas as linhas celulares tumorais originais utilizadas neste estudo (Panc1-sct, MDA-231mt1, HT-29 e PC-3), duas linhagens de células tumorais adicionais (OVCAR-3, DU-145), e sobre um painel de linhas celulares de tumor de cólon (DLD-1, LS1034, HCT116, LS174T, SW48, SW403, Colo320DM), comparando-a com Ad5. ColoAd1 foi mais de 2 logs mais potente do que Ad5 na linha celular cognato, HT-29. Além disso, ColoAd1 demonstrado potência igual a ou maior do que Ad5 em algumas linhas celulares de tumores humanos (por exemplo, PC-3, MDA-231, OVCAR-3 e DU-145), mas foi atenuada (cerca de dois logs menos potente do que Ad5) sobre a linha celular Panc1 (Tabela 2). ColoAd1 exibida aumentou significativamente a potência (9 a 100 vezes) em relação ao Ad5 em todas as linhas de células de tumor de cancro do cólon blindados, com a excepção de Colo320DM (Tabela 3). Isto sugere que as linhas de células de tumor do cólon têm propriedades que os tornam significativamente susceptíveis à infecção e lise pela ColoAd1.

Para testar se ColoAd1 era selectiva para células de tumor em relação às células normais e, assim, por definição , um vírus oncolítico, ColoAd1 foi examinada em duas linhas celulares de tumor de cólon diferentes (HT-29, DLD-1), e em endotelial primário e células epiteliais (HUVEC, HMEC) comparando a sua potência em cada ensaio de MTS para Ad5 e ONYX-015 /H101. Os resultados mostram que ONYX-015 e Ad5 são significativamente menos potente do que ColoAd1 sobre as linhas de células HT-29 e DLD-1 (Tabela 4). Em contraste, a potência de ColoAd1 em células HUVEC era a mesma que Ad5 e ligeiramente mais potentes do que ONYX-015 (Tabela 4). Em células HMEC, ColoAd1 era menos potente do que Ad5 e ONYX-015 (Tabela 4). Para quantificar estas diferenças entre ColoAd1, ONYX-015, e Ad5, um

In vitro

janela terapêutica foi calculada, definida como a razão do IC

50 de um determinado vírus em células normais, as HUVEC ou HMEC , dividida pela CI

50 sobre as linhas de células de tumor de cólon HT-29 ou DLD-1 (Tabela 2). Estes cálculos estabelecer que ColoAd1 tem uma janela terapêutica que é de 3 a 4 logs de maior do que a de Ad5 ou ONYX-015 /H101 nestes

In vitro

ensaios.

é um ColoAd1 vírus quimérico que exibe reforçada potência ao longo do seu vírus pai, Ad11p

análise

cromatográficas indicaram que as principais proteínas de revestimento de ColoAd1 foram derivados de Ad11p, um vírus do grupo B. Para determinar a relação entre ColoAd1 e Ad11p, o vírus foi sequenciado, revelando que ColoAd1 é Ad11p, com uma eliminação quase completa E3 região, uma deleção menor na região E4 e uma região quimérica Ad3 /Ad11p E2B (Figura 2).

as diferenças genômicas entre ColoAd1 e Ad11p são notadas no esquema. Na região de E2B existem substituições frequentes de sequências Ad3 para sequências Ad11p entre pares de bases 6081 e 9322. Além disso, ColoAd1 tem uma (2444 pb) E3 eliminação quase completa região, e um menor (25 pb), segundo exclusão que mapeia para uma região E4orf4 putativa do vírus.

é possível que Ad11p ou Ad3 são sorotipos que são inerentemente mais potentes e têm uma janela terapêutica mais ampla, do que Ad5, e que esta propriedade é independente do adquiridos alterações genéticas encontradas no genoma ColoAd1. Para testar isto, nós examinamos ColoAd1, Ad11p Ad3 e nas linhas de células de tumor do cólon dois, HT-29 e DLD-1, e em endoteliais primárias humanas e células epiteliais humanos primários, as HUVEC e HMEC, respectivamente, por ensaio de MTS. Como apresentado na Tabela 4, ColoAd1 exibiram potência superior em relação tanto Ad11p Ad3 e nas linhas de células de tumor do cólon, demonstrando que este vírus recombinante foi superior em potência para ambos os seus vírus parentais. Curiosamente, Ad11p, e não Ad3, exibida uma janela terapêutica inerente, tal como definido aqui através de análise MTS. Assim, ColoAd1 é um derivado de Ad11p cujas diferenças com Ad11p aumentar a potência do vírus, sem alterar a capacidade natural do serotipo de se replicar selectivamente em células tumorais em comparação com células normais primárias.

É importante notar que a seroprevalência relatado de Ad11p é baixa [22], [23] a maior necessidade para este tipo de terapêutica é em populações de pacientes onde o tumor progrediu a um cancro sistémico, metastático. Assim, o tratamento de pacientes com um agente que não tem a imunidade pré-existente deve aumentar a oportunidade para que o agente circular e eliminar as células tumorais metastáticas. Para confirmar os relatórios anteriores de baixo seroprevalência de Ad11p, o soro de seis indivíduos diferentes foi recolhido e testado para a capacidade de neutralizar a infecciosidade e o potencial lítico destes vírus numa linha de células relatora, Ovcar-3. De acordo com a literatura, o soro demonstraram pouco efeito sobre ColoAd1 (dados não mostrados), sugerindo que ColoAd1 pode ser uma abordagem viável para o tratamento sistémico de cancro do cólon.

ColoAd1 tem actividade anti-tumoral superior ao ONYX -015 e Ad11p em um tumor no fígado câncer de cólon semeadura mouse modelo de xenotransplante seguinte iv administração

maioria dos tumores sólidos são metastática no momento do diagnóstico. Desde que o site inicial de metástase de câncer de cólon é o fígado, um modelo de semeadura tumor no fígado câncer de cólon [24] foi usado para examinar o

in vivo

eficácia de ColoAd1. Para determinar em primeiro lugar se a actividade anti-tumoral viral é dependente da capacidade do vírus para se replicar e propagação, neste modelo, um estudo de resposta dose foi conduzido comparando ColoAd1 a uma forma deficiente na replicação de ColoAd1 (onde a região essencial E1 do vírus foi excluído). Como pode ser visto na Figura 3

Um

, entregue sistemicamente ColoAd1 diminui significativamente a carga do tumor em uma dose, e a replicação, forma dependente. Uma vez que as células HT-29 de antigénio embrionário carcinogénico (CEA), este pode ser utilizado como um substituto facilmente medida para a carga tumoral. É importante ressaltar que as medidas de CEA no sangue (Figura 3

B

) correlacionaram bem com os resultados das medições tumor-peso (Figura 3

A

).

HT-29 células cancerosas do cólon foram semeadas para o fígado de ratinhos nus bege (n = 10 ratos por grupo de tratamento). nível de Plasma CEA foi utilizado para monitorizar o estabelecimento do tumor.

A

e

B

, os ratos foram tratados por (iv) injecção de-cauda veia com 1 × 10

10, 5 × 10

10, ou 1 × 10

11 partículas virais totais de ColoAd1 por ratinho. Um quarto conjunto de fígado de ratinho portador de tumor-se i.v. injetados com 1 × 10

11 partículas virais totais de um [E1

(-)] replicação defeituosa versão do ColoAd1, ColoAd1CJ132. Um quinto grupo de ratos de controlo foram injectados com veículo (tampão). medições de peso de tumor demonstram que ColoAd1 tem actividade anti-tumoral, que é dependente da dose (

Um

). níveis de CEA no sangue no final do estudo (dia 12 após a administração virai) corroboram os dados do peso do tumor (

B

).

C e D,

Comparação da actividade anti-tumoral de ColoAd1, Ad11p e ONYX-015 na metástase do fígado o modelo HT-29 de rato de xenoenxerto. Em um segundo estudo realizado no mesmo modelo como nos painéis A e B, ColoAd1 foi comparado com o seu vírus afim, Ad11p, e para o vírus oncolítico clinicamente aprovado ONYX-015; cada vírus doseada i.v. para um total de 1 × 10

11 partículas virais por mouse.

Para testar se o superior

in vitro

potência de ColoAd1 em relação ao Ad11p e ONYX-015 /H101 foi recapitulou

in vivo

, esses vírus foram comparados no modelo de semeadura tumor no fígado. Como pode ser visto na Figura 3

C

(peso do tumor) e a Figura 3

D

(medições do nível de CEA), a actividade anti-tumoral de ColoAd1 era superior a ambos Ad11p e ONYX-015 neste modelo, corroborando a

in vitro

conclusões.

Seletividade de ColoAd1 em tecidos tumorais humanas isoladas de pacientes com câncer de cólon

In vitro

e

in vivo

modelos que prevêem com precisão a eficácia clínica têm sido difíceis de identificar, e a falta de tais modelos de prognóstico continua a resultar em grande atrito dos medicamentos contra o câncer. Consequentemente, recém isolado, retirado cirurgicamente material de cancro do cólon humano foi examinada como um sistema modelo adicional para testar ColoAd1. Desde que o material cirúrgico inclui ambos o tecido do tumor e margens das células normais, este sistema oferece uma excelente oportunidade para testar a selectividade para o tumor do vírus no contexto de tecido humano intacto. A viabilidade de uma série de amostras de tumores foi analisado em cultura de tecidos; viabilidade variou de 2 a 6 dias. Por conseguinte, para assegurar que a morte celular foi induzida viralmente devido a lise e a libertação de vírus descendentes e não foi devida à lise espontânea do material cirúrgico, um ponto final de 24 horas foi seleccionada. Seis amostras de tumor foram recolhidas e culturas soco de tumor e normais secções (tal como determinado por um patologista clínico) foram gerados e expostas quer a Ad5 ou ColoAd1. Para determinar a capacidade uns dos vírus para se replicar, lisam e libertam o vírus infeccioso, o sobrenadante foi recolhido 24 horas após a infecção e ensaiaram-se quanto à presença de vírus da progenitura. Como pode ser visto na Figura 4

Um

, ColoAd1 gerado descendência cerca de dois logs mais viral em material tumoral do que no tecido normal correspondente, confirmando a sua replicação selectiva do tumor no tecido tumoral humano isolado de fresco. Esses estudos também demonstraram que ColoAd1 apresentaram pelo menos um log maior seletividade do tumor do que o vírus controle, Ad5.

A,

amostras Soco de tumores de cólon humanos recém-cortado (n = 6) e áreas de margem normais correspondentes, foram infectadas com Ad5 ou qualquer ColoAd1 e mantidas em cultura de tecidos. O rebentamento virai de cada amostra foi medida por ensaio de placas em 24 horas após a infecção.

B,

coloração imuno-histoquímica para CD46 presente em tumor do cólon clínica, cólon normais, e amostras de fígado normais.

CD46 foi identificado como um receptor para a adesão celular Ad11p, o vírus parental ColoAd1 de [25], [26]. Para melhor definir a expressão de CD46 no câncer de cólon primário e metastático, examinamos material de câncer de cólon, fígado tecido normal e tecido do cólon normal para expressão CD46 por imuno-histoquímica (IHQ) (Figura 4

B

). Forte coloração CD46 IHC foi consistentemente visto no tecido do cancro do cólon, mas estava ausente ou geralmente fraco em cólon normal e tecido hepático. Isto sugere que a expressão CD46 pode ser um fator que contribui para a seletividade do tumor observada de ColoAd1 e, portanto, pode ser uma ferramenta potencial para a pré-triagem de pacientes para tratamento com este agente terapêutico.

ColoAd1 pode ser armado sem comprometer a potência

vírus oncolíticos Armadas procurar complementar a potência do vírus oncolítico pela adição de transgenes terapêuticos [20]. Nesta abordagem, é importante que um local de inserção do transgene terapêutico dentro do genoma viral ser identificado que não comprometa o ciclo de vida e, por conseguinte, a potência do vírus. Ao contrário de Ad5, onde a biologia e descrição dos locais de inserção compatíveis com o ciclo de vida viral são bem descritos, ColoAd1 representa um novo agente que é derivado principalmente do genoma Ad11p pouco estudado. Consequentemente, um sistema à base de transposão que pode digitalizar o genoma para os locais de inserção de uma forma não-prejudicada foi utilizado para a identificação de locais de inserção do transgene compatíveis [27] Tendo em conta que o genoma viral capacidade de Ad humano codificação é constrangida [28] um local aceitador de splicing consenso foi colocada a montante do transgene, eliminando a necessidade de um promotor exógeno e que liga a expressão de um promotor endógeno ColoAd1 [29]. Para melhorar a capacidade de identificar de transgenes que expressam variantes de ColoAd1, GFP foi escolhido como o transgene. Um número de isolados virais foram gerados e depois testados para potência e um vírus denominado ColoAd1-GFP foi seleccionado com base na potência equivalente ao progenitor ColoAd1 (Fig. 5A e 5B).

MTS ensaios foram realizados em ColoAd1 e ColoAd1-GFP em a), a linha de células de tumor do cólon, HT-29 e B) as células endoteliais primárias, as HUVEC. O gene repórter, GFP, é expressa com uma cinética final (isto é., Está dependente da iniciação da replicação do ADN viral para expressão), como definido pela expressão C) apenas na ausência de AraC e D) a falta de expressão na presença de AraC .

estudos anteriores utilizando uma cassete de expressão com base no aceitador de splice demonstraram que a expressão ocorreu no final do ciclo de vida viral e foi dependente de replicação do ADN virai [29]. Ligando a expressão do transgene terapêutico para a selectividade do vírus tem uma vantagem significativa em relação aos sistemas tradicionais de expressão constitutiva de segurança uma vez que a expressão do gene seria limitada e depende da selectividade para o tumor do sistema viral [30]. Para determinar a cinética de expressão de GFP de ColoAd1-GFP, células HT-29 foram infectadas na presença ou na ausência de AraC, um composto que inibe a replicação virai. Como pode ser visto nas Figuras 5C e 5D, a expressão da GFP foi bloqueada pela adição de AraC indicando que a expressão ocorre mais tarde no ciclo de vida viral e está ligada à replicação viral.

Discussão

No presente estudo nós estabelecemos condições que selecionam agentes virais potentes, sem viés em relação a qualquer mecanismo, de um pool de sorotipos de anúncios que representam Ad subgrupos B-F. Este método, que é uma versão altamente acelerada da selecção natural do vírus, pode ser aplicado a qualquer virus e qualquer tipo de cancro da escolha.

Usando este processo, foram gerados e caracterizados ColoAd1, um romance Ad3 /Ad11p vírus oncolítico quimérico para o tratamento de cancro do cólon humano e, potencialmente, outros indícios. Este vírus foi demonstrado ser mais potente e tem uma maior janela terapêutica do que Ad5 e o vírus clinicamente mais avançado oncolítico Onyx-015 (Tabelas 2-4). Como complemento, revelou um aumento da ColoAd1 potentcy em um modelo de tumor por via intravenosa e em explantes de tumores (Figuras 3 e 4) .Este vírus tem várias modificações em relação ao vírus progenitor Ad11p, incluindo uma região quimérica E2B e deleções nas regiões E3 e E4. Qual a mudança ou mudanças desempenhar um papel na potência aumentada deste vírus não é clara. A perda de genes na região E3 de Ad5 o tem sido demonstrado em anúncios de grupo B para melhorar a lise viral e espalhar [31] por um mecanismo indeterminado. A região E2B codifica a proteína pré-terminal (PTP) e a polimerase de ADN viral (pol do ADN), duas das três proteínas codificadas por E2 necessárias para replicação de DNA viral. O terminal de 18 pb do genoma viral, considerada como a origem de replicação mínima, interage directamente com o ADN e pTP POL heterodímero. É importante notar que quando sequenciado nas extremidades genómicas de ColoAd1 e do tipo selvagem Ad11p eram idênticas às de Ad3 e entrava em conflito com a sequência de ADN descrita Termini descrito para Ad11p [32], [33]. Assim, as alterações E2B em ColoAd1 pode gerar um pol heterodímero PTP-ADN que é mais compatível com o terminal de 18BP de ColoAd1 do que o pol Ad11p PTP-DNA original. Juntamente com genoma menor do ColoAd1 (resultado de deleções genômicas) esse vírus pode replicar mais rapidamente e também atingir um tamanho explosão viral crítica mais rapidamente, consequentemente, melhorar a lise viral e se espalhar.

No que diz respeito à seletividade, os estudos com o pTP de Ad5 têm mostrado que ele interage com CAD, uma proteína do hospedeiro responsável pela associação matriz TP-nuclear. O nível de CAD é correlacionada com a taxa de divisão das células; 2-5 vezes mais elevados níveis em células tumorais do que em células normais e quase não-existente em células quiescentes [34], [35]. Por conseguinte, as alterações da TP e as suas possíveis interacções com DAC (ou proteínas semelhantes) também podem ser mecanismos de replicação e /ou selectividade melhorada do vírus.

A terceira alteração no genoma viral ColoAd1 é uma pequena deleção (24 pb) que mapeia para a região de E4orf4 do vírus. A proteína E4orf4 do Ad5 interage com serina /treonina proteína fosfatase 2A da célula hospedeira (PP2A), [36]. Esta interacção tem sido demonstrado que induz a apoptose independente de p53, inactivar factores de splicing, e reduzir a activação de E1A de AP-1, JunB, e a expressão das unidades de transcrição do Ad E2 e E4 [37]. No entanto, uma vez que a região E4 é altamente splicing, a deleção do gene E4orf4 podem também alterar a expressão de um outro gene E4 nesta unidade de transcrição complexa, contribuindo indirectamente para a potência aumentada de ColoAd1. Além disso, não é claro que proteínas Ad11p Ad3 e manter qualquer ou todas as funções atribuídas às proteínas homólogas de Ad5. Assim extrapolações das funções das proteínas Ad5 para proteínas em ColoAd1 deve ser cuidadosamente testado. Consequentemente, embora seja claro que CololAd1 foi submetido a uma série de alterações genéticas que resultará num vírus mais potente, não é claro qual alteração (s) são responsáveis ​​pela maior potência.

É importante notar que ColoAd1 é um membro do grupo B e, assim, os anúncios distintamente diferente dos vírus baseados em Ad5 oncolíticos tradicionais. Não se trata, por exemplo, usar o receptor de Ad5, (coxsackie B e adenovírus receptor, CAR), para ligação às células. Em vez disso, parece ColoAd1 empregar pelo menos dois receptores que são distintamente diferentes dos CARRO [22], [38], [39], um dos quais foi recentemente descrita como CD46 [25], [26]. O significado disto é enfatizada por estudos recentes sobre material clínico mostrando que CAR é mal expressa em uma variedade de diferentes tipos de tumores e que a expressão CAR diminui com o avanço no estágio e grau do tumor [40], [41], [42 ], [43], [44]. Os relatórios adicionais de propriedades supressores de tumor de CAR [45], [46] e detecção de CAR solúvel no microambiente do tumor [47] pôr em causa a utilização de adenovírus dependentes do automóvel para o tratamento de todos os cânceres humanos. Em contraste, o tumor expressão na superfície celular de CD46, o receptor putativo ColoAd1, parece aumentar com a fase e o grau de uma variedade de cancros [48]. Assim, ColoAd1 podem ter utilidade terapêutica para além do cancro do cólon, e estudos para investigar este estão em andamento. De importância adicional são dados que demonstrem que a soroprevalência de Ad11p é baixa [22], [23]. Uma vez que a maior necessidade para este tipo de terapêutica é em populações de pacientes onde o tumor progrediu de uma doença local confinado a um cancro sistémico, metastático, que tratam pacientes com um agente para que eles não têm imunidade pré-existente deve aumentar a oportunidade para o agente para circular e eliminar as células tumorais metastáticas. Isto está em contraste com Ad5 onde sero-prevalência, tal como medido por anticorpos neutralizantes, atinge níveis de aproximadamente 50% na população geral [23], [49].

É importante notar que a potência de ColoAd1 pode ser complementado por um e potencialmente transgenes mais terapêuticas. A capacidade de armar estes agentes representa uma oportunidade única para impactar o tratamento de cancro em vários níveis a partir de um único agente. Tal como demonstrado pela incorporação e a expressão eficiente de GFP a partir do genoma ColoAd1, armar pode ocorrer sem comprometer a potência ou selectividade da terapêutica virai. Em adição aos agentes que complementam o potencial oncolitico do vírus (as enzimas, por exemplo de pró-fármacos de conversão, factores anti-angiogénicos, imunoterapêuticos,) incorporando, armar cria a oportunidade para os clínicos para controlar a actividade do tratamento viroterapia de uma forma minimamente invasiva [50] . Isto é feito ainda mais significativo se o método para rastrear o virotherapy está diretamente ligada ao ciclo de vida viral. No caso de ColoAd-GFP, esta tem sido claramente demonstrado, onde a expressão de GFP foi demonstrado para ser directamente ligada a replicação de ADN (Figura 5B). Vários genes foram identificados que permitiria que os clínicos para controlar a atividade viral e incluem genes associados com cintilografia (por exemplo, HSV-1 TK, da tiróide humana iodeto de sódio simportador, [51], [52]) e os péptidos marcadores solúveis prontamente detectável na corrente sanguínea ou através de amostras de urina (por exemplo, antigénio carcinoembrionário humano, de cadeia β da gonadotropina coriónica humana [53], [54], [55]). Usando a expressão do gene ligado como um biomarcador da replicação virai e disseminação representa uma oportunidade para os clínicos para personalizar o tratamento, a administração de doses adicionais conforme necessário, portanto, afastando-se padrão, dosagens cronometrado comumente associados com tratamentos de quimioterapia corrente. Igualmente importante, à medida que consideramos equilibrar a necessidade de potência aumentada com a segurança da terapia virai, armar poderia também ser utilizado para incorporar uma “válvula de segurança” para a viroterapia, capaz de abortar a terapia de base viral, através da administração de um clinicamente aprovado droga (por ex. incorporação do gene de TK de HSV e administração de ganciclovir).