Sumário
A detecção e tratamento do câncer tem avançado significativamente nos últimos várias décadas, com melhorias importantes em nossa compreensão do base molecular e genética fundamental da doença. Apesar destes avanços, as metodologias de despistagem de drogas têm-se mantido praticamente inalterado desde a introdução do
in vitro
tela de linha de células humanas em 1990. Embora os métodos existentes fornecer informações sobre os efeitos globais dos compostos na viabilidade celular, eles são restrito por medições a granel, amostras de grande tamanho, e falta a capacidade para medir a cinética de proliferação ao nível da célula individual. Para compreender a natureza verdadeiramente da proliferação de células de cancro e para desenvolver terapias adjuvantes personalizado, existe uma necessidade de novas metodologias que fornecem informação quantitativa para monitorizar o efeito da droga sobre o crescimento celular, bem como as alterações morfológicas e fenotípicas ao nível da célula individual. Aqui nós mostramos que uma modalidade quantitativa de imagens fase conhecida como microscopia de interferência de luz espacial (SLIM) atende a essas necessidades e proporciona vantagens adicionais sobre os ensaios de proliferação existentes. Nós demonstramos estas capacidades através de medições sobre os efeitos da hormona de estradiol e o anti-estrogénio ICI182,780 (Faslodex) sobre o crescimento de células MCF-7 de cancro da mama. Além de fornecer informações sobre as alterações no crescimento global, SLIM fornece informações adicionais biologicamente relevante. Por exemplo, descobrimos que a exposição aos resultados de estradiol em células que crescem rapidamente com massa seca menor do que a população controle. Subsequentemente bloquear o receptor de estrogénio, com os resultados em ICI células de crescimento mais lento, com massas seco inferior do controlo. Esta capacidade de medir as mudanças na cinética de crescimento em resposta às condições ambientais proporciona uma nova visão sobre os mecanismos de regulação do crescimento. Nossos resultados estabelecem as capacidades do SLIM como uma tecnologia de triagem de drogas avançada que fornece informações sobre as alterações na cinética de proliferação a nível celular com maior sensibilidade do que qualquer método existente
Citation:. Mir M, Bergamaschi A, Katzenellenbogen BS, Popescu G (2014) imagens quantitativas altamente sensível para Monitoramento câncer Individual Cinética celular de crescimento e resposta à droga. PLoS ONE 9 (2): e89000. doi: 10.1371 /journal.pone.0089000
editor: Aamir Ahmad, Faculdade de Medicina da Wayne State University, Estados Unidos da América
Recebido: 09 de outubro de 2013; Aceito: 13 de janeiro de 2014; Publicação: 18 de fevereiro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Mir et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation (NSF) Grants: Centro de Ciência e Tecnologia em Emergent Comportamentos de Sistemas celulares Integrado CBET 0.939.511 (para GP), NSF CARREIRA 08-46660 (para GP), CBET-1.040.461 de ressonância magnética (para GP), mama Fundação do câncer Research (para BSK), Institutos nacionais de Saúde (NIH) AT006268 P50 (para BSK), e uma bolsa de pós-doutorado do Departamento de Defesa, W81XWH-09-1-0398 (a AB). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. Os autores leram a política da revista e tem as seguintes conflitos: G. Popescu tem interesses financeiros em Phi Optics, Inc., uma empresa de desenvolvimento de microscópios fase quantitativa, que, no entanto, não patrocinam esta pesquisa. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
O crescimento celular e na homeostase de massa têm sido descritos como fundamental para a biologia, mas eles não são suficientemente entendido [1]. Esta deficiência pode ser rastreada até a falta de métodos capazes de quantificar a massa de células individuais com a sensibilidade necessária. Como resultado, recentemente, um progresso significativo tem sido feito para desenvolver uma nova tecnologia para estudar o crescimento celular. Estes métodos podem ser divididos em
micromecânica
[2] – [4], traduzindo deslocamentos de frequência de ressonância de microestruturas em massa flutuabilidade célula, e
óptico
[5] – [8], a conversão quantitativa imagens de fase em mapas de densidade de massa seca. Os métodos ópticos são ideais para estudar o crescimento de células aderentes individuais, bem como agregados de células. Esse recurso abre novas oportunidades na biologia da célula cancerosa, onde as medições sensíveis de proliferação celular pode levar a uma melhor compreensão da doença, bem como a monitorização quantitativa da eficácia do medicamento. Aqui demonstramos que
imagiologia quantitativa fase (QPI)
fornece um método altamente sensível para estudar o crescimento de células de cancro e para as drogas de teste. Usamos linhas celulares de cancro da mama como um modelo para provar o princípio do nosso método.
O câncer de mama em 30% dos casos de câncer diagnosticados e por 14% de todas as mortes relacionadas ao câncer em mulheres [9]. Uma diminuição significativa (7%) na incidência tem sido observada desde 2002 que pode ser diretamente atribuído a uma melhor compreensão da relação entre estrogênio e o crescimento do câncer de mama [10] – [16]. Este conhecimento tem conduzido ao desenvolvimento de uma classe de agentes que modulam directamente a receptor de estrogénio (ER) e que estão agora a base do tratamento e prevenção em doentes positivos para ER (70% de todos os casos) [17]. Com a constatação de que é possível exercer controle sobre o crescimento do câncer através de anti-hormônios e agentes quimioterapêuticos, veio a necessidade de testes em larga escala de compostos possivelmente úteis. Em 1974, mais de 40.000 compostos estavam sendo testados anualmente utilizando modelos murinos [18], [19]. Em 1990, NCI estabeleceu a tela principal de 59 linhas de células humanas, que continua em uso hoje em dia [20], [21]. Esta nova tela primário necessário métodos para avaliar o crescimento
in vitro
. Vários ensaios metabólicos foram desenvolvidos para medir o crescimento celular e -que viabilidade, até à data, têm-se mantido praticamente inalterado [20], [22] – [26].
Uma abordagem amplamente utilizada baseia-se na redução de um sal de tetrazólio incolores para produzir uma proporcional formozan colorida para o número de células viáveis. Apesar de tais ensaios são úteis para medir a eficácia citotóxica global de um composto, o grande número de células (10
3-10
5) [27] tem de ser utilizado para evitar a conclusões incorrectas de efeitos, tais como tempos de duplicação variáveis [20]. Além disso, uma vez que muitas drogas têm efeitos sobre a paragem do ciclo celular que não resultam em alterações metabólicas, em alguns casos, uma falsa leitura pode ser feita [28]. ensaios baseados em não-tetrazólio também foram desenvolvidos. Estes ensaios utilizam corantes que se ligam electrostaticamente aos ácidos aminados básicos [25] e do sinal medido é então linear com a contagem de células. Apesar das dificuldades práticas envolvidas, um tal reagente conhecido como sulforhodamina B (SRB) foi finalmente adotada para exames de rotina. Ambos os tipos de ensaio fornecer medições indiretas de crescimento: os ensaios de tetrazólio baseado medir a atividade metabólica enquanto que o ensaio SRB essencialmente mede a concentração de proteína total. Ambos os métodos dependem usando um grande número de células, apenas fornecer medições em massa em todo o conjunto de células, e são incapazes de medir as respostas dependentes do tempo para as drogas a nível celular. Tipicamente, os dados de ensaio de crescimento são suplementados com activadas por fluorescência (FACS de células experiências) para fornecer informação estatística adicional, e estudar a expressão do gene e a progressão do ciclo celular. Embora muito informativo, FACS analisa exigem células a serem removidos de suas condições de cultura normais, grupos de células a serem separados, provocando alterações no fenótipo e morfologia.
Portanto, está se tornando cada vez mais claro que para realmente compreender a natureza da proliferação de células de cancro e para desenvolver terapias adjuvantes personalizado, existe uma necessidade de novas metodologias que fornecem informação quantitativa para monitorizar os efeitos da droga sobre o crescimento celular e as alterações morfológicas e fenotípicas, concebidos a nível da célula individual. A tela da droga ideal deve ser suficientemente sensível para avaliar rapidamente a resposta de um pequeno número de células para uma variedade de potenciais terapias, a fim de avaliar directamente a resposta de um paciente ou a eficácia de um fármaco particular. Aqui nós mostramos que QPI [29] aborda esta lacuna tecnológica. microscopia de interferência de luz espacial (SLIM) [30] é uma abordagem QPI que tem sensibilidade nível fentograma a mudanças na massa seca e pode, simultaneamente, fornecer esta informação, tanto a nível da população [31] única célula e. SLIM pode ser combinado com microscopia de fluorescência para medir o ciclo de crescimento celular dependente [31]. Neste trabalho, nós utilizamos o Receptor de Estrogénio (RE) -positivo linha celular de cancro da mama MCF-7 [32], [33] como um sistema modelo para demonstrar que SLIM pode ser utilizado como um ensaio de proliferação de droga altamente sensível.
a linha de células MCF-7 tem sido um modelo amplamente utilizado para estudar a influência hormonal sobre o crescimento do cancro da mama, em particular, em resposta aos estrogénios, que desempenha um papel-chave na promoção do crescimento e a progressão de células cancerígenas. Mediu-se o crescimento de células MCF-7 cachos de células em meios de cultura celular padrão (Veh) e sob a influência do estradiol (E2), a forma predominante de estrogénio durante os anos reprodutivos, e ICI, 182, 780 – também conhecida como Faslodex- [ ,,,0],34], um antagonista completo do ER usado para tratar o cancro da mama metastático em mulheres pós-menopáusicas. Os resultados aqui apresentados estabelecem que, além de ser um ensaio de proliferação valioso, imagiologia quantitativa de fase também fornece informação biologicamente relevante a nível da população de células e de cachos de células individuais que não são acessíveis através de outros métodos. Tais medidas, em combinação com os ensaios moleculares existentes têm o potencial de melhorar o design de drogas e caracterização e para colmatar a conexão entre a nossa compreensão molecular de efeitos do câncer e tratamento da toxicodependência em propriedades de crescimento celular e fenotípicas, tais como o tamanho das células /massa.
Resultados
células MCF-7 foram semeadas em uma câmara de slide dois bem e medições foram realizadas em três condições de cultura de células (ver
Materiais e Métodos
para mais detalhes sobre cultura de células e tratamento) . Em primeiro lugar, o meio de crescimento celular típico como o veículo de controle (Veh), segundo o meio de crescimento de células contendo 10 nM de estradiol (E2), e finalmente o meio de crescimento celular com o antiestrogénio 1 uM ICI182,780 10 nM de E2 (E2 + ICI). Para o tratamento de E2 + ICI, as células foram cultivadas sob condições de E2 durante 10 horas antes de ICI foi adicionada. O ponto de 10 horas foi escolhido para administrar a droga uma vez que este é o primeiro momento em que foi observada uma diferença significativa entre as taxas de crescimento de Veh e populações tratadas com E2 (Fig. S1). A 1,55 × 1,16 milímetros
2 Área de cada poço foi digitalizado a cada 30 minutos, utilizando um microscópio de contraste de fase comercial equipado com um SLIM add-on módulo. Para cada experiência, um poço continha uma população de controlo não tratada (Veh) e o segundo poço continha a E2 ou de E2 + ICI população tratada. Duas medidas foram realizadas de tal maneira para cada condição. Todos os dados serão disponibilizados gratuitamente, mediante pedido.
Um esquema do instrumento e imagens SLIM representativos de um poço são mostrados na Fig. 1 A e B, respectivamente. SLIM mantém subcelular resolução (Fig. 1B) ao longo de uma grande área, digitalizando cada câmara em um padrão de mosaico (para mais detalhes sobre a medição referem-se a
Materiais e Métodos
). A partir das imagens grandes mosaico, as arestas de conjuntos individuais (composto de 2-3 células em t = 0 horas) foram traçados em cada ponto de tempo e a área de superfície e de massa seca total foram medidos (ver Filme S1 durante um lapso de tempo da campo de visão para todos os grupos). Desta forma, podemos analisar tanto as tendências de crescimento global de cada grupo e a heterogeneidade no nível de cluster dentro de cada população. Deve notar-se que este tipo de medição é actualmente impossível de realizar com qualquer ensaio de proliferação existente.
(A) Representação esquemática da montagem experimental. Um microscópio de contraste de fase comercial totalmente automatizado equipado com controle de fase de incubação superior e x, y, z-capacidades de varrimento foi utilizada para digitalizar uma área de 1,5 milímetros x 1,2 milímetros em cada poço de uma 2-deslize bem a cada 30 minutos. Os componentes na linha pontilhada compreendem o add-on módulo SLIM: Fourier Lens 1 (FL1) Os projectos do plano pupila do microscópio de contraste de fase em um cristal líquido Fase modulador (LCPM), que fornece controle sobre o atraso de fase entre os dispersos e un-luz dispersa; Fourier Lens 2 projeta a imagem modulada de fase em um CCD. Todos os componentes do instrumento foram sincronizadas utilizando a CPU. (B) Imagens representativas de um campo de vista digitalizado em uma das câmaras a 0 horas e 94 horas, a área na linha amarela tracejada é alargada e mostrado em cada ponto de tempo (barra de escala é 50 micra amarelo). (C) Média área de superfície normalizada para clusters em cada grupo nos períodos de tempo marcados. (D) Massa média normalizada para clusters em cada grupo nos períodos de tempo marcados. (C-D) marcadores quadrados indicam a média, linha central é médio, superior da caixa é de 25
th linha percentual, inferior é 75
th linha de percentil, bigodes indicam 5
th e 95
th percentis , a significância foi testada usando um teste t pareado-un, o: p 0,05, *: p 0,05, **: p 0,01, ***: p 0,001. (E) medida ensaio WST-1 a proliferação em 72 horas.
temporais mudanças na massa e área
Em primeiro lugar, nós estabelecemos as capacidades do SLIM como um ensaio de proliferação medindo os efeitos do Estradiol sobre as mudanças relativas de crescimento, que é qualitativamente semelhante à informação fornecida pelos ensaios convencionais. As quantidades de interesse aqui são as quantidades relativas de crescimento em tamanho e massa, e não os valores absolutos. Para realizar esta análise, a área de superfície e de massa de cada conjunto é normalizado em relação ao seu tamanho inicial, F (t) /M (t = 0) e as áreas (t) /Área (t = 0), respectivamente. A área normalizada e massa para todos os grupos analisados (pelo menos 5 por grupo) foram separadas em caixas de 15 horas, como mostrado nas Figs. 1C e 1D. Não há nenhuma diferença significativa na área normalizada em cada ponto de tempo. Em contraste, as diferenças na massa normalizada são detectáveis ao longo do período de medição (Fig. 1 C-D). Isso destaca a importância de medir a massa em vez de simplesmente a área de um cluster. Além disso, o tratamento com ICI actua rapidamente como o grupo E2 apresenta uma maior crescimento relativo na massa no prazo de 30 horas. Uma diferença entre o E2 + ICI e grupo de controlo podem ser detectadas por 60 horas. Deve notar-se que, enquanto os ensaios de proliferação actuais dependem do uso de um grande número de células, foram realizadas medições SLIM no nível de cluster indivíduo.
A comparação com o Ensaio Colorimétrico
Para comparação, as medições a partir de um WST-1 ensaio de tomada depois de 72 horas de tratamento são mostrados na Fig. 1E. Pode ser visto que existe uma boa concordância entre os dados qualitativa WST-1, o que indica indirectamente taxa de proliferação, e as medições de área normalizada, após 75 horas. No entanto, a massa normalizada é maior no controlo do que no grupo de E2 + ICI após 60 horas. Estas diferenças são provavelmente porque o ensaio de WST-1 simplesmente mede a redução de um corante de tetrazólio fora da célula. Embora o nível desta redução está relacionada com a actividade metabólica das células e reflecte o número de células viáveis da população, que não é uma medida directa da massa ou o tamanho celular. Além disso, tais ensaios são restringidos ao fornecimento de um número por uma população a granel e não fornecem nenhuma forma prática para estudar a heterogeneidade da população. A fim de ilustrar melhor a variabilidade nos dados de medição da massa e a área normalizada de conjuntos individuais são apresentados na Fig. 2.
(A) de massa normalizada vs. Tempo para todos os clusters que foram analisados. (B) a área normalizada em função do tempo para todos os clusters. (A-B) As linhas pontilhadas mostram os dados de cluster individuais e as linhas sólidas mostram dados médios. As linhas tracejadas indicam onde a diferença entre os grupos torna-se significativo.
temporais alterações na massa Growth Rate
Além de fornecer um conhecimento quantitativo de como tratamentos diferentes afetam as mudanças relativas em tamanho e massa , SLIM também pode medir as variações na taxa de crescimento dos aglomerados de células pequenas como uma função do tempo ou tamanho. Medindo a taxa de crescimento com alta sensibilidade é mais informativo do que simplesmente medir mudanças relativas em massa, pois proporciona uma compreensão de quando os tratamentos começam a ter efeito e quanto tempo o efeito persiste. mapas de densidade de massa seca de grupos típicos de cada grupo ao longo do tempo são mostradas na Fig. 3A (veja S2 filme por). FIG. 3B mostra a taxa de crescimento de agregados em cada um dos grupos em função do tempo. Uma diferença significativa na taxa de crescimento entre os três grupos podem ser detectados tão cedo quanto 15 horas (5 horas após o tratamento foi administrado ICI), que é de 15 horas mais cedo do que a mudança detectável, tanto na área e de massa. Além disso, embora a massa normalizada é maior para o grupo de E2 + ICI do que o controlo até 60 horas, a taxa de crescimento de controlo excede o grupo E2 + ICI por 45 horas. Também pode ser visto que, embora aglomerados no grupo E2 atingir massas e áreas relativas muito maiores do que o controlo, não existe diferença significativa nas taxas de crescimento entre os dois grupos após 90 horas.
(A) seco mapas de densidade de massa dos aglomerados representativos de cada grupo de células MCF-7 de cancro da mama em cada 22 horas. As cores indicam a densidade de massa seca em cada pixel, conforme mostrado na barra de cores. A barra de escala amarela é de 50 microns. Note-se que no grupo de E2 + ICI, ICI foi adicionada a cada amostra em 10 horas. taxa de crescimento (B) de cluster em cada grupo, no período de tempo mostrado. taxa de crescimento (C) de cluster em cada grupo como uma função da massa normalizada. As linhas sólidas são apresentados como um guia para o olho para determinar como a taxa de crescimento está a mudar como uma função de crescimento da massa. (B-C) marcadores quadrados indicam a média, linha central é médio, superior da caixa é de 25
th linha percentual, inferior é 75
th linha de percentil, bigodes indicam 5
th e 95
th percentis , a significância foi testada usando um teste t pareado-un, o: p 0,05, *: p 0,05, **: p 0,01, ***:. p 0,001
por traçando a taxa de crescimento como uma função da massa normalizada (Fig. 3C) a tendência de crescimento (exponencial ou linear) dos grupos pode ser determinada. Pode ser visto que a taxa de crescimento médio de agregados em grupos E2 e Veh continua a aumentar até um aumento de 4 vezes em massa é conseguida, após o que a taxa de crescimento é estável ou diminui. Esta tendência implica que, para aproximadamente duas duplicações de massa ambos os grupos exibem crescimento exponencial, após o que o crescimento é linear. Em contraste, o grupo de E2 + ICI exibe crescimento exponencial (tendência linear na Fig. 3C) até um aumento de 2 vezes na massa é conseguida, após o que o crescimento é linear (curva constante na Fig. 3C). É importante notar aqui que uma duplicação em massa não corresponde necessariamente a um ciclo de célula completa como estrogénio e ICI são conhecidas por resultar em mudanças na forma como uma célula progride através do ciclo celular, ou seja, o tempo de duplicação e o tamanho e divisão de ambos podem ser afetados.
Efeitos do estradiol sobre tamanho da célula e tempo de duplicação
para determinar como as mudanças no nível da célula única contribuir para as mudanças mensuráveis em tamanho relativo, massa e taxas de crescimento , medimos o tempo de duplicação e a percentagem de alteração no tamanho médio de célula para células individuais que compõem os aglomerados (Fig. 4). O tempo de duplicação é calculado simplesmente como, onde
t
f
é o último ponto do tempo,
t
0
é o ponto de tempo inicial, e
N
celular (t)
é a contagem de células em tempo de
t
. Os tempos de duplicação para o grupo E2 foram encontrados para ser significativamente mais baixo do que ambos o Veh e grupos de E2 + ICI (Fig. 4A). Estes dados mostram que o estradiol induz as células a dividir em quase o dobro da taxa do grupo de controlo e que o tratamento com ICI inverte quase completamente este efeito. De acordo com estudos previamente relatados, descobrimos que os estrogénios acelerar células através do ciclo celular, o que resulta em um aumento na proliferação celular. Digno de nota é que o efeito da ICI no aumento do tempo de duplicação de células não implica que o ciclo celular é retornado para condições normais mas o mais provável é o resultado de as células que passam uma quantidade maior de tempo em uma fase específica do ciclo celular.
(a) tempo de duplicação em cada grupo, o tempo de duplicação médio é reduzido por 12 horas no grupo de E2 em comparação com os grupos Veh e E2 + ICI, indicando que a adição de ICI retorna o tempo de duplicação para controlar os níveis. (B) Variação percentual na massa celular significativo durante o período de medição para cada grupo. Uma diminuição significativa na massa celular é observado em ambos os grupos E2 e E2 + ICI em comparação com o controlo. (C), medida de tempo versus a mudança na massa celular média para cada cluster que foi medida dobrando, estes dois parâmetros podem ser usadas para separar os três grupos completamente e pode servir como uma assinatura de crescimento.
A a mudança na massa celular significativo ao longo do tempo foi calculado dividindo-se a massa total de cada grupo pelo número de células no cluster. Figura 4B mostra a variação percentual na massa celular média entre os pontos de tempo iniciais e finais para cada cluster. Os resultados indicam uma diminuição significativa na massa celular significativo ao longo do tempo nas células de E2 e E2 + ICI, em comparação com o controlo. Esta diminuição da massa celular e duplicando tempo mostrar que em relação ao controle, os resultados de estrogênio em células menores, mais rápidos em divisão, e que a adição de resultados ICI em tempos mais dobrando juntamente com células menores. As células menores nos grupos de E2 + ICI implica que, embora o tempo de duplicação foi devolvido para controlar os níveis, ICI está a afectar a actividade metabólica das células e a capacidade para crescer normalmente. Como mostrado na Fig 4C, o tempo de duplicação e a mudança na massa celular significativo proporcionar uma “assinatura de crescimento” de confiança para cada grupo e sugerem que os níveis de expressão do receptor de estrogénio ou a presença de um modulador de ER pode ser avaliada simplesmente por examinar estes dois parâmetros. Desde ensaios atuais não fornecem uma medida direta do crescimento celular, estas são as primeiras medições, realizadas continuamente em uma população, que elucidar como o estrogênio afeta MCF-7 cinética de crescimento no nível da célula individual.
Discussão
Os resultados aqui apresentados estabelecem que as medições SLIM de densidade de massa seca pode ser usado como ensaios de proliferação altamente sensíveis. As principais vantagens sobre os métodos existentes que são SLIM pode detectar alterações na cinética de crescimento no menor número de células, em menos tempo, e pode ser usado para estudar as diferenças dentro de uma população não se limitando a um número para o crescimento de grandes quantidades de uma cultura. A título de comparação, o ensaio de WST-1 funciona com o número de células em 10
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5 gama [27] enquanto que SLIM é sensível a alterações na proliferação de mesmo uma única célula. Além disso, SLIM fornece a capacidade de analisar a taxa de crescimento de células individuais e aglomerados em função da sua massa, proporcionando uma visão sobre o mecanismo de regulação do crescimento (por exemplo, se um tamanho de célula ou ponto de verificação idade está a ser utilizado) [35]. Esta informação é inacessível a qualquer ensaio de proliferação. Este sistema pode ser facilmente usado para medir a cinética de crescimento e efeitos fenotípicos para qualquer tipo de célula e tratamento.
Nossos resultados também demonstram que medir o crescimento no nível celular e cluster não só oferece vantagens em termos de sensibilidade melhorada e reduziu tamanhos de amostra, mas também produz informações adicionais que não é acessível por métodos existentes. Em particular, mostram a cinética e a modalidade de acção de E2 em células MCF-7. Com efeito MCF-7 sob a influência de E2, dividem mais rapidamente e atingir massas inferiores, resultando num aumento do número de células que são em média mais pequena. Devido ao tempo de duplicação reduzida, este ainda resulta em um aumento global da massa total de E2 quando comparado com o grupo de controlo. Para células crescidas em E2 e subsequentemente tratados com os tempos de duplicação ICI devolvido aos encontrados no controlo, no entanto, a redução no tamanho da célula era ainda maior do que no grupo de controlo.
Os efeitos de E2 e anti-estrogénios na progressão do ciclo celular foram anteriormente estudadas em detalhe [11], [15], [36], [37]. Ambos efeitos rápidos e transitórios foram observados devido à atividade funcional, tanto no núcleo (efeitos genômicos) eo compartimento extranuclear (efeitos não-genômicos) [38]. Os efeitos rápidos em crescimento são claramente observável nos nossos dados como as diferenças na taxa de crescimento entre o E2 e Veh expuseram as células são observáveis após 10 horas (Fig. S1) e pode ser atribuída à activação precoce de genes relacionados com o metabolismo [39 ]. Após a adição da ICI, um antagonista de ER pura, as diferenças na taxa de crescimento entre os grupos E2 e E2 + ICI começam a aparecer ao longo do tempo (Fig. 3B). Os efeitos transitórios de E2 + ICI também se manifestam na forma como as alterações na taxa de crescimento em função do aumento do tamanho da célula (Fig. 3C), uma clara ruptura da taxa de crescimento pode ser observado quando os aglomerados ICI aproximadamente o dobro em tamanho.
Os estrogénios são conhecidos por ativar cascatas de transdução que regulam muitos genes -tanto positiva e negativamente-que desempenham um papel-chave na proliferação celular e metabolismo [10] – [15], [39]. Também tem sido mostrado que os estrogénios causam células não-ciclismo (G
0 fase) para entrar no ciclo celular e a progredir rapidamente através da L
1 para a fase S [11], [15], [37 ]. Esta rápida progressão através do ciclo celular é responsável tanto o tempo de duplicação diminuída e redução da massa de célula médio observado no grupo de E2 (Fig. 4). Por outro lado, a ICI foi mostrado para bloquear as células MCF-7 na G0-L
1 fase [15], [28], [37]. Esta acção inibitória sobre a progressão através de G1 é manifestada no aumento do tempo de duplicação do grupo E2 + ICI quando comparado com o grupo E2. ICI também afecta a transcrição de vários genes responsáveis pela regulação do crescimento em todas as fases do ciclo celular. A regulação negativa dos genes que se sabe serem responsáveis pela proliferação em combinação com o aumento do tempo gasto nos grupos G1 são provavelmente responsáveis pela redução do tamanho de célula observada no grupo de E2 + ICI [15].
Tal como no caso do receptor de estrogénio, a proliferação celular é também controlada através da activação e modulação de cascatas de sinalização de regulação por factores de crescimento; medir o crescimento no nível celular tem o potencial para preencher a lacuna entre a compreensão molecular de crescimento do câncer e crescimento do tumor real. Assim, é de grande interesse para combinar estas medidas de crescimento com marcadores de fluorescência para identificar a fase do ciclo celular (tal como foi feito anteriormente para as células U2OS [31]) ou outras proteínas conhecidas para desempenham papéis fundamentais na regulação da proliferação. Medição de alterações na cinética de crescimento como uma função do ciclo da célula ou, mais especificamente, as activações do gene, permitirá uma melhor compreensão da acção particular de um composto /droga na progressão do ciclo celular.
Em suma, temos demonstraram um novo ensaio de proliferação altamente sensíveis para aplicações de rastreio de drogas. Embora tenhamos focado em um sistema de célula de modelo específico aqui, a configuração experimental aplica-se sem alteração a outros tipos de células e tratamentos. Além de medir a cinética de crescimento, o nosso método também proporciona ao mesmo tempo informações sobre a morfologia celular e a motilidade [40], e também pode ser facilmente combinada com outras modalidades de microscopia. Um objeto de estudo futuro será entender e caracterizar as diferenças morfológicas que possam surgir como resultado de modular a ER (ver filme S1 e S2). Os insights biológicos proporcionados por medições SLIM em combinação com outros ensaios moleculares, sem dúvida, melhorar a nossa compreensão do crescimento de células cancerígenas em geral, e têm o potencial de levar a melhorias na concepção de medicamentos, caracterização e eficácia terapêutica.
Materiais e Métodos
Cultura celular
comercialmente disponíveis células MCF-7 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA) e foram cultivadas em MEM (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) suplementado com 5% de soro de vitela (Hyclone, Logan, UT), 100 ug /ml de penicilina /estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA), e 25 ug /ml de gentamicina (Invitrogen). As células foram então semeadas em MEM livre de vermelho de fenol contendo 5% de carvão dextrano soro de vitelo tratado a incubar durante 4 dias. Duas lâminas de câmaras (Lab-Tek) com vidro lamelas inferiores foram usadas para permitir o side-by-side de imagem do controle e amostras tratadas. O meio foi mudado no dia 2 e 4 antes do tratamento com o veículo de controlo ou ligando tratamentos (estradiol (E2, 10 nM) e ICI 182780 (ICI fulvestrant, 1 uM)). Para as medições colorimétricas, um WST1-ensaio (Roche, Basileia, Suíça) e foi usada a absorvância foi medida a 450 nm utilizando um Leitor de Microplacas da BioRad 680.
Durante Imaging as células foram mantidas a 37 ° C e em numa atmosfera de CO2 5% com uma incubadora e inserção fase aquecida. Cada poço foi digitalizado a cada 30 minutos em um × padrão 4 4-telha com uma Zeiss CE Plan-Neofluar 10 × /0,3 PH 1 objetivo fornecer um campo de total de vista de 1,55 × 1,16 milímetros
2. A z-stack de 12 fatias (48 ^ m) foi gravado em cada posição. O tempo de exposição foi de 15 ms para cada imagem na potência da lâmpada cheia (3.200 K, ou 10,7 V). Para cada experiência, um poço foi deixada sem tratamento para servir como uma população de controlo e o outro poço foi tratado com a condição de E2 ou de E2 + ICI. Cada condição foi medida junto com seus controle duas vezes.
Imagem
A visualização foi realizada usando microscopia espacial interferência da luz (SLIM) [30], [41]. SLIM é uma modalidade de interferometria óptica de luz branca projetado como um módulo add-on a um microscópio de contraste de fase comercial. Em resumo, SLIM opera projetando o focal traseira de uma objectiva de contraste de fase para um modulador de fase de cristal líquido (LCPM). O LCPM é calibrado para deslocar precisamente a fase da luz dispersa pela amostra em relação à luz dispersa-un. mapas de intensidade são registrados pelo deslocamentos de fase de zero, π /2, π, e 3π /2.
A configuração SLIM utilizado neste estudo é baseado em uma Zeiss Axio Observer Z1 (catálogo de Zeiss # 431007901000) motorizado invertido microscópio imaging Research. A base do microscópio é equipado com uma unidade de foco motorizado (passo mínimo largura de 10 nm). Os objectivos utilizados para este estudo é um Zeiss CE Plan-Neofluar 10 × /0,3 PH 1 M27. A imagem intermediária após a lente objectiva e o tubo é dirigido para a esquerda da porta do microscópio onde o módulo SLIM está ligado.