Abstract

células cancerosas cervicais apresentam uma maior exigência para a degradação de proteínas dependente de ubiquitina associado a uma taxa de rotatividade metabólica elevada, e por vias de sinalização específicas, nomeadamente HPV degradação das proteínas p53 e PDZ E6-alvo. compostos naturais com propriedades antioxidantes, incluindo flavonóides e triterpenóides são promissores como agentes anticancerígenos, interferindo com a degradação de proteínas dependente de ubiquitina. Um corpo crescente de provas indica que o seu sistema carbonilo insaturado α-β é o determinante molecular para a inibição de degradação de proteínas mediado por ubiquitina a montante dos locais catalíticos do proteassoma 20S. Aqui relatamos a caracterização e identificação de uma nova classe de inibidores químicos à base de calcona, potentes e de células permeáveis ​​de degradação de proteínas dependente de ubiquitina, e um composto RAMB1 chumbo. RAMB1 inibe a degradação de proteínas dependente de ubiquitina sem comprometer as actividades catalíticas da proteassoma 20S, um mecanismo distinto do de bortezomib. O tratamento de células cancerosas do colo do útero com RAMB1 desencadeia respostas de proteínas desdobradas, incluindo formação aggresome e estabilização Hsp90, e aumenta p53 constante estadual. RAMB1 tratamento resulta na activação de vias de degradação dependente de lisossoma como um mecanismo de compensação para os níveis de poli-ubiquitina aumentando enriquecido agregados tóxicos. Importante, RAMB1 sinergicamente provoca a morte celular de células de cancro do colo do útero, quando combinado com o inibidor de lisossoma cloroquina

citação:. Anchoori RK, Khan SR, Sueblinvong t, Felthauser A, Y Iizuka, Gavioli R, et al. (2011) salientando a ubiquitina-proteassoma sistema sem 20S Cells proteolítica inibição seletiva Kills câncer cervical. PLoS ONE 6 (8): e23888. doi: 10.1371 /journal.pone.0023888

editor: Lin Zhang, da Universidade da Pennsylvania School of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 30 de Junho de 2011; Aceito: 29 de julho de 2011; Publicado: August 31, 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Anchoori et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde ATIP e SPORE no colo do útero CA098252 P50 Cancer a SRK, RKA e RBSR e HERA fundação (Saúde, Empoderamento, Pesquisa e consciência) eo Departamento de Defesa Programa Ovarian Cancer Research (OCRP) OC093424 a MB. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declaram que não há interesses concorrentes existem

Introdução

a degradação de proteínas dependente de ubiquitina através do sistema ubiquitina-proteassoma (UPS) é crucial para a regulação de diversos processos celulares, incluindo a progressão do ciclo celular, a diferenciação e a apoptose em ambas as células normais e cancerosas [1]. expressão aberrante de componentes do sistema de UPS, incluindo ubiquitina-ligases, enzimas-ubiquitinating de e proteasomas tem sido relatada em várias configurações de cancro, incluindo o cancro do colo do útero [1], [2], [3], o que sugere que, a fim de sustentar seus níveis mais elevados das células cancerosas atividade metabólica confiar mais pesadamente sobre o bom funcionamento do UPS, em comparação com o seu homólogo normais [4], [5], [6], [7]. Assim, as moléculas capazes de interferir com a degradação de proteínas dependente de ubiquitina, incluindo bortezomib, a atividade mostra anticancerígeno [5]. Papilomavírus Humano (HPV) é a principal causa de câncer cervical e responsável por 5% de todos os cânceres em todo o mundo [8]. Embora vacinas contra o HPV pode ser uma medida preventiva eficaz contra o câncer do colo do útero, não existem actualmente terapias específicas do vírus para ele, e a eficácia da cirurgia padrão e quimioterapia /radioterapias é limitado para a doença avançada [9]. Expressão de dois oncogenes virais E6 e E7,, é necessário para a indução e manutenção do fenótipo transformado [10]. A oncoproteína E6 exerce a sua actividade oncogénica por ligação ao E3 ubiquitina ligase E6-AP e redirecciona a sua actividade para proteínas p53 e outros supressores de tumores para a sua rápida degradação mediada por ubiquitina proteossoma [11], [12], [13]. Isto reduz o nível deste regulador chave do ciclo celular celular sem a sua mutação. Portanto, temos a hipótese de que a estabilização de p53 via impedindo a sua degradação mediada por ubiquitina terão potencial terapêutico para o cancro do colo do útero e possivelmente para outros tipos de câncer do tipo selvagem de p53.

compostos naturais do flavonóide e famílias triterpenóides incluindo a curcumina, Celastrol, polifenóis do chá verde e chalconas mostraram-se promissores como agentes antineoplásicos em uma variedade de configurações de câncer, incluindo cervical [14], cólon [15], [16], esofágico [17], pancreático [18] e de próstata [19], [ ,,,0],20], [21] do cancro, ligado a propriedades pró-apoptóticos associados com a inibição como proteossoma. Mostrámos recentemente que chalcone derivados contendo substituições de aminoácidos únicas na sua estrutura actuar como inibidores de proteassomas e que a natureza da porção aminoacídica determina a sua selectividade para os diferentes actividades catalíticas do proteassoma 20S [14]. No entanto, outros resultados sugerem que as moléculas de calcona pode conter no seu sistema carbonilo insaturado α- o determinante molecular para a inibição de degradação de proteínas mediado por ubiquitina a montante do proteassoma 20S [22], [23], [24], [25].

Relatamos pela primeira vez que uma série de derivados de calcona-falta aminoacídicos componentes, aqui denominado RAMBs, são sistema ubiquitina-proteassoma (UPS) -stressors através da inibição da degradação de proteínas mediado por ubiquitina a montante das actividades catalíticas 20S proteossómica . Especificamente, os compostos são capazes de RAMBs morte selectiva de células de cancro do colo do útero por meio de acumulação da proteína poli-ubiquitinada seguido pelo desencadeamento de respostas de proteínas desenroladas incluindo a formação e estabilização aggresome Hsp90. Além disso, esta acumulação de proteínas ubiquitinadas-poli é acompanhada por uma activação de compensação de degradação de proteínas dependente de lisossoma, de estabilização de p53, a desestabilização da ciclina D1 e o aparecimento de apoptose. Nossos resultados sugerem que o tratamento composto RAMB, possivelmente combinado com a cloroquina inibidor lisossoma, tem a promessa como nova avenida para o tratamento do cancro do colo do útero.

Materiais e Métodos

cultura celular

linhas celulares de cancro do colo do útero HeLa, SiHa, CaSki e ME180, foram obtidas da American Type Culture Collection (Manassas, VA) e cultivadas em DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal, 100 Ul /mL de penicilina, e 100 ug /mL de estreptomicina a 5% de CO

2. Os queratinócitos foram obtidos da Invitrogen (Carlsbad, CA) e cultivadas em definido de queratinócitos-SFM.

A viabilidade celular ensaio

A viabilidade celular foi determinada por 2,3-bis [2-metoxi-4- nitro-5-sulfofenil] -2H-tetrazólio-5-carboxanilida ensaio de sal interno (XTT) (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha). Células semeadas a uma concentração de 1000 por poço em 100 ul de meio de placa de 96 poços foram tratadas com os derivados à base de calcona, em concentrações especificadas. Após os períodos indicados, as células foram incubadas de acordo com o protocolo do fabricante, com a mistura de rotulagem XTT durante 4 horas. corante de formazano foi quantificada utilizando um leitor de placas espectrofotométrico para medir a absorvância a 450 nm (ELISA leitor 190; Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Todas as experiências foram realizadas em triplicado.

A determinação de células apoptóticas por citometria de fluxo

A indução de apoptose foi determinada por Anexina V /7-AAD coloração. Anexina V /7-AAD coloração foi feita utilizando Anexina V-PE Apoptosis Detection Kit I (BD Pharmingen, San Diego, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, 1 x 10

5 as células foram re-suspensas em tampão de ligação, 5 jil de anexina V-PE e 5 ul de 7-AAD foram então adicionados para as células que foram então incubadas à temperatura ambiente durante 15 minutos, e analisadas por citometria de fluxo num Becton Dickinson FACSCalibur. A análise dos dados foi feito com software CellQuest (Becton Dickinson Immunocytometry sistema, Mountain View, CA).

Os anticorpos e Ocidental Análise Blot

proteína celular total (10-20 mg) de cada amostra foi separada por SDS-PAGE, transferidos para membranas de PVDF e sujeitas a análise de Western blot. Os anticorpos para análise de Western Blot foram obtidos pelos seguintes fontes comerciais: anti-ubiquitina (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), o clone anti-p53 DO-1 (Calbiochem, Gibbstown, NJ) anti-PARP (BD Pharmingen, San Diego , Califórnia), anti-GAPDH (Sigma, St. Louis, MO), ligado a peroxidase anti-rato de Imunoglobulina G (Amersham, Piscataway, NJ) e utilizada na concentração recomendada pelo fabricante. Anti-ubiquitina e anticorpos anti-vimentina de análise de imunofluorescência foram obtidos de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Texas-red rotulado de cabra anti-imunoglobulina de murganho L e cavalo Fluoresceína-anticorpos marcados anti-coelho de Imunoglobulina G foram obtidos a partir de Molecular Probes (Carlsbad, CA), e Vector Laboratories (Burlingame, CA), respectivamente, e utilizada a uma concentração recomendada pelo fabricante.

morfologia celular e imuno-fluorescência analisa

Um microscópio invertido Nikon Eclipse TE 2000E foi usado para a imagem da morfologia celular com contraste de fase e de imunofluorescência. Para a análise de ubiquitina e vimentina localização sub-celular, culturas de células HeLa foram crescidas como descrito na Lab-Tek II lamela câmaras (Nalge Nunc International, Rochester, NY). Nos tempos indicados, as células foram fixadas e permeabilizadas com metanol e incubadas com os anticorpos primários indicados. anticorpos secundários fluorescentes foram usadas para visualizar a localização de proteínas e de DNA nuclear visualizadas por 4,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) coloração. As amostras montadas foram vistas sob um microscópio invertido Nikon Eclipse TE 2000E e imagens capturadas com o Spot 3.5.8 software de aquisição (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI).

Medição da actividade proteossómica em 20S purificada proteasomas

As células (5 × 10

8) foram lavadas em PBS frio e ressuspenderam-se em tampão contendo Tris-HCl 50 (pH 7,5), MgCl 5 mM de

2, 1 mM de DTT (Sigma), ATP 2 mM e 250 mM de sacarose. Contas de vidro equivalente ao volume da suspensão de células foram adicionados, e a mistura foi agitada em vórtice durante 1 min a 4 ° C. Grânulos e os detritos celulares foram removidos por 5 minutos de centrifugação a 1.000 g, seguido de 20 minutos de centrifugação a 10000

g

[27]. Os lisados ​​foram limpos por ultracentrifugação durante 1 h a 100000

g

, e os sobrenadantes foram ainda ultracentrifugado durante 5 h a 100000

g

. pastilhas contendo proteassoma foram ressuspensas em 0,5 ml de tampão de homogeneização [Tris-HCl 50 (pH 7,5), KCl 100 mM, glicerol a 15%]. A concentração de proteína foi determinada utilizando o protocolo de BCA (Pierce, Rockford, IL). substratos fluorogênicos Suc-LLVY-AMC, Boc-LRR-AMC e Ac-YVAD-AMC foram usadas para medir as atividades chymotryptic-like, tríptico-like e caspase-like, respectivamente. proteossomas Semipurificada (10 L), pré-tratados ou não com os inibidores durante 30 min a 37 ° C, foram analisadas a 37 ° C durante 45 min, utilizando as diferentes substratos peptídicos num tampão contendo Tris-HCl 50 (pH 7,5), 5 mM MgCl

2 e DTT 1 mM (volume final de 100 l). A reacção foi extinta com 1 ml de 1% SDS e a fluorescência determinada por fluorímetro (Perkin-Elmer, beaconsfield, Reino Unido) com excitação a 380 nm e emissão a 440 nm [18]. Os dados são expressos como a percentagem de inibição em relação a preparações não tratadas proteossomo.

Medição da actividade da proteossoma 26S em proteossomas em células vivas

células em crescimento exponencial (1 × 10

6) foram plaqueadas em placas de 60 mm e ou simulada tratados ou tratados com diferentes RAMB1 concentração durante um período de 4 horas. actividade proteossómica em lisados ​​celulares (NP-40 tampão de lise: 0,1% de NP-40, Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, 5% de glicerol e DTT 1 mM) foi determinada medindo a actividade de luminescência residual após a adição do Suc -Glo -LLVY substrato ™ (Promega, Madison, WI) específicos para a actividade semelhante a quimotripsina do proteassoma de acordo com as recomendações do fabricante.

Ensaio de luciferase 4XUbiquitin-degron

o 4Xubiquitin- construção de fusão de luciferase designado Ub-FL e o plasmídeo de controle projetado CMV-FL foram gentilmente cedidas pelo Dr. David Piwnica-worms (Universidade de Washington, St. Louis, MO) [26]. culturas sub-confluentes de células HeLa foram transfectadas com plasmídeos de ADN utilizando o reagente Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA). FL e UB-FL transfectadas células HeLa foram semeadas a 50000 células /poço em placas de 24 poços ou 200000 células /poço em 6-poços de placas de 24 horas após a transfecção e foram incubadas com os compostos ou veículo (DMSO) nas doses e tempos indicados. A actividade da luciferase no ligado celular foi determinada com um kit de ensaio de luciferase (Promega, Madison, WI) de acordo com as instruções do fabricante. As imagens foram adquiridas durante 1 min, com uma IVIS da Xenogen 200 (Caliper, Hopkinton, MA). Igualmente áreas médias foram analisados ​​utilizando software de imagem viva 2,20.

clonogénicas ensaio

em crescimento exponencial SiHa, CaSki HeLa e células de cancro cervical foram semeadas em cada 1.000 ou 100 células /poço em placas de 6 cavidades. Um dia após sementeira, as células foram tratadas com quer veículo sozinho (simulado) ou RAMB1 nas doses indicadas, e incubadas a 37 C em 5% de CO

2 durante 10 dias. No final do tratamento, o meio foi removido e as células foram lavadas com PBS antes da fixação e coloração das colónias, utilizando uma mistura de 6,0% de glutaraldeído e 0,5% de violeta de cristal como previamente descrito [27]. Colónias foram fotografadas e contadas usando um microscópio invertido Nikon Eclipse TE 2000E e imagens capturadas com o Spot 3.5.8 software de aquisição (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI). Todos os experimentos foram realizados em triplicado.

A análise estatística

Os resultados são apresentados como média ± desvio padrão (SD). significância estatística das diferenças foi avaliada por bicaudal de Student

t

utilizando Prism (Graphpad V.5, San Diego, CA) e Excel. O nível de significância foi estabelecido em p ≤ 0,05. O índice de combinação (IC) de RAMB1 e cloroquina foi calculada pela análise do efeito mediano de acordo com o método de Chou e Talaly [28]. CI 1 indica sinergismo, CI = 1 indica aditividade e CI 1 indica antagonismo. Outras análises de regressão foram realizadas para estabilizar estimativas.

Resultados

compostos Ramb seletivamente reduzir a viabilidade das células cancerosas do colo do útero, independentemente do genótipo HPV

via

bloqueio da proteossómica degradação

flavonóides e triterpenóides membros da família, incluindo Celastrol [19], o resveratrol [29], [30], a curcumina [17], epigalocatequina-3-galato [20], [31], [32], [33], [ ,,,0],34] e chalconas [35], [36] apresentam propriedades anti-cancro associados com a sua actividade como inibidores de proteassoma [14], [15], [16], [21]. Nós recentemente relatado que inibidores de proteassoma na-base de calcona a natureza da porção de aminoácidos da molécula confere especificidade para com actividades catalíticas do proteassoma 20S [14]. Com base em vários estudos anteriores [22], [23], [37], a hipótese de que o sistema de cetona α-β de calconas pode representar o determinante molecular mínimo para a inibição da degradação de proteínas mediada por ubiquitina a montante do proteassoma.

para testar esta hipótese, foi inicialmente rastreados uma biblioteca de derivados à base de chalcona que transportam vários substituintes nos anéis aromáticos adjacentes ao sistema de cetona α-β e que faltam porções aminoacídicos, para a sua capacidade de inibição do crescimento de células em crescimento exponencial do colo do útero HeLa HPV18-positiva a linha de células de cancro em um intervalo de concentração de 100 a 0,01 uM (não mostrado). Quatro derivados de calcona, RAMBs a seguir denominadas, capaz de reduzir a viabilidade das células de crescimento exponencial de células de cancro do colo do útero HeLa de uma forma dependente da dose com IC

50 valores 5 mm, foram escolhidos para posterior avaliação (Figura 1). Para determinar a viabilidade de utilização de compostos RAMBs para tratamento do cancro do colo do útero, testou-se o tratamento RAMB1-4 seria especificamente impedir a viabilidade celular das células de cancro do colo do útero mais de queratinócitos normais e se a redução na viabilidade das células em células do cancro do colo do útero é dependente do HPV -genótipo. Como mostrado na Figura 2, RAMB1 ou RAMB4 tratamento produziu uma redução dependente da dose na viabilidade das células SiHa e Caski HPV16-positiva e linhas celulares de cancro do colo do útero ME180 HPV-39-positivas, respectivamente, com efeitos mínimos sobre a viabilidade dos queratinócitos humanos primários e com IC

50 similar à obtida com HeLa. Resultados semelhantes com um pouco maior IC

50 foram obtidos utilizando RAMB2 e RAMB3 (não mostrado). Para testar se a redução na viabilidade celular observada em células de cancro do colo do útero após a exposição aos compostos RAMB1-4 era devido à sua capacidade de interferir com a degradação de proteínas mediado por ubiquitina, que monitorizados os níveis de acumulação de proteínas ubiquitinadas-poli após o tratamento. Especificamente, as células HeLa foram tratadas com 5 uM de RAMB1, RAMB2, RAMB3, ou RAMB4 ou 10 nM de bortezomib, este último sendo utilizado como controlo positivo UPS-estressor, ao longo de um período de 6 horas. Como mostrado na Figura 3 (

esquerdo do painel

), análise de imunotransf erência dos níveis de expressão de proteína em células HeLa ubiquitinadas revelou um claro padrão de acumulação de proteínas ubiquitinadas-poli em RAMBs tenha sido tratada com culturas HeLa. Uma análise semi-quantitativa dos níveis de proteína polyubiquitinated mostra que os níveis de GAPDH-normalizado de proteínas polyubiquitinated são consistentemente mais elevado (até três vezes maior) em relação células falsamente tratados tratadas com RAMB (Figura 3,

painel da direita

). Estas descobertas sugerem que a diminuição na viabilidade celular observada no painel de células de cancro do colo do útero, mas não em células normais após tratamento RAMBs está associada com a perturbação de degradação de proteínas mediado por ubiquitina e ocorre independentemente do tipo de HPV oncogénico.

IC

50 valores foram determinados pelo ensaio de XXT. O IC

50 valores reportados são média de três determinações independentes.

As culturas de células transformadas por HPV cervical câncer (SiHa, CaSki e ME180) ou queratinócitos humanos primários foram tratados com as concentrações indicadas de RAMB1 (

painel esquerdo

) ou RAMB4 (

painel direito

) durante um período de 48 horas. A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de XTT e representados graficamente como fracção de culturas de controlo não tratadas

Painel esquerdo:.

análise de imunotransf erência de proteínas ubiquitinadas em células HeLa após 6 horas de exposição, com ou sem 10 uM RAMBs. Bortezomib foi utilizado como controlo positivo. Carga igual de proteína em cada pista foi verificada usando um anticorpo contra a GAPDH.

Painel direito:.

Quantificação dos rácios /GAPDH ubiquitina

tratamento RAMB desencadeia uma ubiquitina-proteassoma-System (UPS) de resposta, tais como estresse, sem afetar proteassoma 20S atividades catalíticas

para testar se o aumento rápido (seis horas ou menos, dados não publicados) de proteínas ubiquitinadas-poli seguintes exposição RAMBs ocorre concomitantemente com a inibição directa das actividades catalíticas de os proteossomas, nós testamos a capacidade da RAMB1 e RAMB4 (que induziu uma maior acumulação de proteína do que os outros polyubiquitinated RAMBs, Figura 3) para inibir a sub-unidades catalíticas específicas dentro do proteassoma 20S. Especificamente os RAMBs foram testados quanto à sua capacidade para inibir a quimotripsina-like (CT-like), tripsina (T-like) e peptídeo peptidilglutamilo atividades (PGPH-like) a hidrólise-like em proteassoma 20S purificada pré-expostos a doses crescentes até 10 | iM de RAMBs por um período de 30 minutos após a adição de substratos fluorogénicos [38]. O inibidor de proteassoma FDA licenciado bortezomib foi utilizado como controlo positivo. Como mostrado na Figura 4 o perfil de inibição de proteassoma mostra que, ao contrário bortezomib, RAMB1 e tratamento RAMB4 não conseguiu inibir as funções proteossomo quando testado a concentrações até 10 uM (resultados semelhantes foram obtidos com os outros compostos da série, não mostrado).

purificadas 20S proteossomas foram tratadas durante 30 min com ou sem compostos RAMB ou bortezomib, aqui utilizado como controlo positivo, nas concentrações indicadas e os substratos f luorogénicos específicas para tipo quimotripsina, tripsina e péptido peptidilglutamilo hidrólise semelhante capacidades de proteassoma hidrolíticas foram subsequentemente adicionados. Um exemplo representativo de dois experimentos independentes é mostrado.

A fim de avaliar se a falha para inibir a função proteossómica

in vitro

pode ser reproduzido na proteassoma intacta encontrados em células vivas, utilizamos duas abordagens diferentes. Em primeiro lugar, utilizou-se o repórter bioluminescente 4XUb-FL ubiquitina-luciferase, que resiste à clivagem por hidrolases ubiquitina [26], para transfectar células HeLa. Usando Ub-FL e FL transfectadas células HeLa que foram monitorizados a actividade de luciferase após a exposição a RAMBs ao longo de um período de 6 horas. Como mostrado na Figura 5

(esquerda) ao contrário

bortezomib ou a RA1 inibidor de proteassoma recentemente identificado [14], aqui usados ​​como inibidores de proteassoma controlos positivos, RAMB1 ou RAMB4 tratamento induziu uma estabilização mais fracos do repórter Ub-FL quando testado a uma concentração de até 20 | iM do que o observado para ambos RA-1 ou bortezomib. Quantificação de Ub-FL rácio /FL na simulação contra RAMBs cultura exposta é fornecida na Figura 5 (

média

painel). Em seguida, a falta de inibição da actividade da proteossoma 20S nas células tratadas com RAMB foi confirmada através da medição da actividade residual em fluorogénico proteassoma 20S purificadas a partir de células CaSki cancro do colo do pré-expostos a RAMB1 ou RAMB4 durante 4 horas. Como mostrado na Figura 5 (

painel direito), ao contrário de bortezomib, tratamento RAMB1 não conseguiu inibir a actividade de proteassomas chymotryptic quando testado a concentrações até 20 uM. Tomados em conjunto, isto sugere que a perda de viabilidade celular em células de câncer do colo do útero após a exposição RAMBs ocorre concomitantemente com a acumulação de proteínas polyubiquitated sem a inibição direta da atividade proteossómica 20S

Painel esquerdo:.

a actividade de luciferase em lisados ​​de Ub-FL ou células-FL vector transfectadas quer com ou sem tratamento com compostos RAMB ou bortezomib foram quantificados em unidades de luminescência relativa (RLU) e expressos como% de controlo. As barras de erro são o desvio padrão (SD) para três experiências independentes.

Painel central:

Quantificação da relação Ub-FL /FL.

Painel direito: atividade luminescência

em lisados ​​de células derivadas de células de câncer cervical CaSki com ou sem RAMB ou tratamento bortezomibe quantificada em unidades de luminescência relativa (RLU). *, P 0,05, **, P . 0,02

tratamento RAMB1 induz a formação de aggresome e desencadeia respostas de choque térmico

Nós e outros mostraram que a inibição da ubiquitina-mediada degradação de proteínas através da inibição proteossómica provoca choque térmico e respostas proteínas desdobradas incluindo formação de estruturas citoprotetores chamados aggresomes como um mecanismo para compensar a inibição das funções do proteossomo e níveis crescentes de UPS estresse dentro de células cancerosas [4], [6], [39] . Para testar se a rápida acumulação de proteína ubiquitinadas-poli mediante tratamento RAMB1 ocorre concomitantemente com respostas de proteínas de choque térmico (UPR) que monitorada os níveis de expressão da proteína Hsp90 em células de cancro do colo do útero HeLa expostas a 10? M RAMB1-3 durante 8 horas. Como mostrado na Figura 6A (

esquerdo do painel

) análise de imunomarcação dos níveis de expressão de proteína Hsp90 revelou que um forte padrão de acumulação de Hsp90 em RAMB1-tratado versus culturas de células HeLa falsamente tratados (foram obtidos resultados semelhantes com a outra derivado da série, não mostrado). Uma análise semiquantitativa dos níveis de proteína Hsp90 mostram que os níveis de GAPDH-normalizado de proteínas polyubiquitinated são quase duas vezes mais elevada em tratado versus células não-tratado é mostrada na Figura 6A (

painel direito).

A.

Painel esquerdo: análise immunoblot

dos níveis de expressão de Hsp90 em células de câncer cervical HeLa após 8 horas de exposição com ou sem 10 mM tratamento RAMBs. Bortezomib foi utilizado como controlo positivo. Carga igual de proteína em cada pista foi verificada usando um anticorpo contra a GAPDH.

Painel direito:

Quantificação da relação Hsp90 /GAPDH. células B. HeLa foram incubadas com ou sem 5 RAMB1? M ou 10 nM bortezomib durante 18 horas antes da fixação e imuno-fluorescente coloração do DNA (azul), ubiquitina (verde) e vimentina (vermelho) antes de imagem (60 ×).

em seguida, temos a hipótese de que a acumulação de proteínas ubiquitinada-poli seguintes RAMB exposição composto levaria a ativação de vias compensatórias alternativas para a degradação de proteínas mediada por ubiquitina, especificamente a ativação da via lisossomal. Para testar esta hipótese, monitoramos a localização sub-celular da ubiquitina por análise de microscopia de imunofluorescência em células de câncer cervical HeLa expostas a 10? M de RAMB1. Como mostrado na Figura 6B análise de imunofluorescência de proteínas ubiquitinadas-poli em células HeLa tratadas com RAMB1 revela a presença de enjaulado-vimentina, ubiquitina-positiva, consistente com a estrutura aggresomes que anteriormente descrito, após tratamento com bortezomib [6]. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que nas células tratadas com RAMB1 a acumulação de resultados ubiquitinadas-poli em respostas citoprotectores semelhantes como a inibição de actividades catalíticas de proteassoma pelo bortezomib, mas ocorre através de um mecanismo independente a partir dele.

ligações tratamento RAMB1 para a estabilização p53, ciclina D1 desestabilização e início da apoptose

a oncoproteína E6 de HPV exerce a sua actividade oncogénica, visando p53 e outras proteínas supressoras do tumor para uma rápida degradação proteossómica mediada por ubiquitina. Isso reduz o nível deste regulador chave do ciclo celular celular sem mutação do p53. Para testar se a diminuição da degradação de proteínas mediado por ubiquitina após o tratamento RAMBs leva a estabilização de p53 como um mecanismo de morte celular de iniciar potencialmente contribuir, foram examinados os níveis de expressão de p53 seguintes 6 horas de exposição aos compostos de 10 uM de RAMBs. Como mostrado na Figura 7A, 8 horas RAMB1 exposição está associada com a acumulação dependente da dose de p53 em células de cancro cervical CaSki, em comparação com o controlo simulado. É importante ressaltar que a estabilização p53 faz com que a supressão do promotor de ciclina D1, resultando em repressão activa de ciclina D1 transcrição [40]. Para testar se esta resulta em redução dos níveis de expressão da ciclina D1, células de cancro cervical CaSki foram expostas a doses crescentes de RAMB1 durante um período de até 8 horas. Como mostrado na Figura 7B

(painel esquerdo)

tratamento RAMB1 causa (

topo

) dependente do tempo e dose-dependente (

parte inferior

) redução de ciclina D1 níveis que sugerem falha do cancro do colo do útero para entrar na fase S do ciclo celular, como uma causa da toxicidade celular [41]. Uma análise quantitativa semi dos níveis de ciclina D1-β-actina normalizada é dada na Figura 7B (

painel direito superior e inferior

).

A. A análise de imunotransferência de nível de expressão de p53 em células CaSki tratados com a concentração indicada de RAMB1 ao longo de um período de 8 horas. Igual carregamento é cada pista foi verificada por amido coloração preta. B.

Painel superior esquerdo:

análise Immunoblot de nível de expressão de ciclina D1 em células CaSki com ou sem 10 RAMB1 M para um período até 8 horas. carga de proteína foi examinada utilizando um anticorpo contra β-actina.

painel da direita superior:

Quantificação da D1 relação de ciclina /β-actina.

painel da esquerda inferior:

análise de imunotransferência da expressão da ciclina D1 nível em células CaSki, com ou sem RAMB1, na concentração indicada, durante um período de 8 horas. Carga igual de proteína em cada pista foi verificada usando um anticorpo contra β-actina.

painel direito inferior:

Quantificação da D1 relação de ciclina /β-actina. C.

Painel esquerdo

. As células HeLa foram tratadas com 10? M de RAMB1 durante 8 horas e analisadas por citometria de fluxo, após coloração de anexina V e de ligação 7-AAD incorporação.

painel meio

: Análise de imunotransferência de comprimento completo e de PARP clivada em células HeLa tratadas 10 uM de RAMBs ao longo de um período de 8 horas. carga de proteína foi avaliada utilizando um anticorpo contra β-actina.

Painel direito

:. Quantificação da relação clivada PARP /β-actina

Para testar se isso resulta em redução dos níveis de expressão de ciclina D1, as células cancerosas do colo do útero CaSki foram expostos a doses crescentes de RAMB1 durante um período até 8 horas. Uma análise quantitativa semi dos níveis de ciclina D1 normalizada beta-actina-é dado na Figura 7B (

painel direito superior e inferior

). Como mostrado na Figura 7B

(painel esquerdo)

tratamento RAMB1 provoca muito rápida (

topo

) e dose-dependente (

parte inferior

) redução de ciclina D1 níveis que sugerem falha do cancro do colo do útero para entrar na fase S do ciclo celular pode contribuir para a perda de viabilidade das células [41].

a estabilização de p53 níveis de estado estacionário e os níveis de desestabilização de ciclina D1 sugerem que a diminuição na viabilidade celular observado no painel de células de cancro do colo do útero após a exposição RAMBs pode desencadear o aparecimento de apoptose. Para testar esta hipótese, as células de cancro do colo do útero HeLa foram expostas a 5 ^ M de RAMB1 e analisadas por citometria de fluxo, após coloração de anexina V e de ligação 7-AAD incorporação. Anexina V e coloração 7-AAD permite discriminar viável (anexina V

neg /7-AAD

neg), apoptose (anexina V

pos /7-AAD

neg) e mortos (anexina V

pos /7-AAD

POS) células. Tal como mostrado na Figura 7C (

painel da esquerda

), 24 h de exposição para RAMB1 causou um aumento tanto no início (anexina V positiva da população) e tardias (anexina V e 7-AAD população duplo positivo) e população apoptótica em culturas tratadas em comparação com os controlos. Para avaliar se este é devido à ativação caspase, que mediram os níveis de clivagem PARP em células de câncer HeLa após a exposição a RAMB1. Tal como mostrado na Figura 7C (

painel do meio), níveis mais elevados de PARP clivada são aparentes no tratado versus culturas não tratadas, indicando a activação da caspase-3. Quantificação da PARP clivada /GAPDH é fornecido na Figura 7C (

painel direito

). Estes resultados suportam a hipótese de que RAMBs tratamento desencadeia a apoptose em células de cancro do colo do útero.

tratamento RAMB1 impede dependentes de ancoragem formação de tumores de colónias de células de câncer cervical e sinergia com o inibidor lisossoma cloroquina

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