Abstract

O cluster miR-17-92 de microRNAs é elevada em cancro colorectal, e tem um papel causal no câncer desenvolvimento. Dos seis miR-17-92 membros do cluster, miR-19a e b, em particular, são promotores importantes do desenvolvimento do câncer e proliferação celular, enquanto evidências preliminares sugerem que o miR-18a podem agir em oposição a outros membros do cluster para diminuir a proliferação celular. foi colocada a hipótese que o miR-18a pode ter uma função homeostática para ajudar a conter o efeito oncogénico de todo o agrupamento de miR-17-92, e que a actividade elevada de cluster miR-17-92, sem um aumento correspondente em miR-18a pode promover colorrectal a progressão do tumor. Em amostras de cancro colo-rectal e mucosa colorretal normal correspondente, miR-18a exibido expressão geral menor do que outros membros do cluster miR-17-92. miR-18a mostrou ter um papel oposto a outros membros do cluster miR-17-92, em particular os miARNs oncogénicos chave, o miR-19a e b. A transfecção de HCT116 e linhas celulares de cancro colorrectal com LIM1215 imita o miR-18a diminuição da proliferação, enquanto um inibidor de miR-18a aumento da proliferação. miR-18a foi também responsável pela diminuição da migração das células, alterando a morfologia celular, indução de prisão /S do ciclo celular fase G1, aumentando a apoptose, e aumentar a acção de um agente pró-apoptótico.

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, um mediador da via PI3K, foi identificado como um novo alvo miR-18a. Superexpressão de miR-18a reduzida

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expressão, e um ensaio de luciferase confirmou que miR-18a atinge diretamente o 3’UTR de

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. imita o miR-18a teve um efeito semelhante na proliferação como um inibidor de molécula pequena de CDC42. A inibição da

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expressão é provável que seja um mecanismo fundamental pelo qual miR-18a prejudica o crescimento de células de câncer, com um experimento protector alvo revelando miR-18a influências proliferação através da inibição direta da

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. A inibição da

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por miR-18a também pode ajudar neste efeito de crescimento de supressão. A função homeostática de miR-18a dentro do cluster miR-17-92 em células de câncer colorretal pode ser conseguido através da supressão de

CDC42 Comprar e da via PI3K

Citation:. Humphreys KJ, McKinnon RA , Michael MZ (2014) inibe a miR-18a

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e desempenha um papel supressor de tumor em células de cancro colo-rectal. PLoS ONE 9 (11): e112288. doi: 10.1371 /journal.pone.0112288

editor: Junming Yue, The University of Tennessee Health Science Center, Estados Unidos da América

Recebido: 29 de junho de 2014; Aceito: 09 de outubro de 2014; Publicação: 07 de novembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Humphreys et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. O estudo foi financiado pelo Centro de Flinders para a Inovação na Cancer Research Grant. Este estudo foi produzido com o apoio financeiro e outros do Projeto cancro da batida do Cancer Council SA em nome de seus doadores eo Governo do Estado da Austrália do Sul através do Departamento de Saúde. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O rompimento dos níveis de expressão miRNA normais ocorre frequentemente no cancro colorectal (CRC) para o desenvolvimento [1]. miARNs, que são sequências de ARN não codificantes pequenas, pode adicionar-transcricionalmente regular a expressão de genes alvo através da ligação ao ARNm alvo complementar. Eles podem clivar os ARNm complementares, ou onde há complementaridade imperfeita, pode actuar através da inibição de translação e transcrição desestabilização [2] – [4]. Enquanto os tumores humanos são muitas vezes caracterizados por um defeito em geral na produção global de miARN miARN e sub-regulação [5], [6], vários estudos têm também mostrado miARNs específicos a ser elevada em CRC [1], [7]. Níveis reduzidos de miARNs supressores de tumor, ou a sobre-expressão de miARN oncogénicos, contribuem para a progressão do tumor, alterando a expressão de genes e influenciar as vias de sinalização [8], [9]. Na verdade, alguns miARNs têm sido mostrados para ser condutores do processo oncogénica, e essencial para a progressão tumoral [10] – [13].

Um exemplo de um miARN com um papel causal no desenvolvimento do cancro é o miR -17-92 aglomerado de miARN, que foi designado oncomir -1 devido ao seu potencial oncogénico [14]. O cluster de miR-17-92, que compreende o miR-17, o miR-18a, 19a-miR, miR-20a, 19b-miR, e miR-92a, é geralmente elevada em linfomas e tumores sólidos, incluindo tumores colorrectais [1 ], [14] – [17]. As funções de fragmentação durante tanto o desenvolvimento normal e a transformação oncogénica para promover a proliferação e da angiogénese, e inibir a diferenciação e a apoptose [11], [12]. miARNs no cluster de miR-17-92 também têm sido associadas com a invasão e metástases de células de CRC [18], e com a sobrevivência mais pobre [19]. O aglomerado foi mostrado para coordenar vários percursos oncogênicos, e inibição destas vias tem potencial terapêutico para o tratamento de cancros causados ​​por miR-desregulação 17-92 [13].

Dos seis miR-17-92 membros do cluster , miR-19a e b, em particular, são promotores importantes do desenvolvimento do câncer e proliferação de células de câncer [11], [12], [20]. Em células CRC, temos mostrado anteriormente que a dos membros de cluster, miR-19a e b são responsáveis ​​pelo aumento da proliferação [20]. Vários estudos também mostraram que miR-19a e b são necessárias e amplamente suficientes para promover as propriedades oncogênicas do cluster em modelos de linfoma [11], [12].

In vivo

, miR-19 foi necessário para promover lymphomagenesis num modelo de linfoma de célula B do rato Eμ-myc [11], [12]. miR-19 sobre-expressão levou a linfomas B de início precoce altamente malignas, enquanto a desativação miR-19 biogênese resultou em aparecimento tardio de tumores, penetrância incompleta, e vida útil prolongada [12]. Seguindo o miR-17-92 deleção em células de linfoma, a reintrodução de miR-19 sozinho crescimento restaurado e suprimiu a apoptose [11].

Em contraste com a acção pro-proliferativo de miR-19, evidências preliminares sugerem que o miR -18 pode agir contra os outros membros do cluster para diminuir a proliferação de células [20]. miR-18a pode ser menos elevada do que outros membros do conjunto de miR-17-92 em tumores colorrectais [17], e este aumento relativo em outros membros do conjunto de miR-17-92 pode favorecer o aumento da proliferação. Sabe-se que vários mecanismos de regulação pós-transcricional pode levar a diferentes níveis de membros do cluster individuais, com miR-18a o único membro do cluster para exigir hnRNPA1 para processamento [21]. A estrutura terciária da dobrado pri-miR-17-92 transcrição pode também contribuir para o processamento menos eficiente do miR-18a [22], [23]. Testar a hipótese de que o miR-18a pode ter uma função homeostática para ajudar a conter o efeito oncogénico de todo o agrupamento de miR-17-92, e que a actividade de cluster miR-17-92 elevado sem um aumento correspondente em miR-18a pode promover tumor colorrectal progressão. Este estudo teve como objetivo determinar as propriedades supressores de tumor de miR-18a em linhas celulares de CRC.

Materiais e Métodos

cultura celular

células de carcinoma colorectal HCT116 (ATCC, Manassas, VA, EUA) foram mantidas em meio de McCoy 5A (modificado) (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) contendo soro fetal bovino a 10% (Bovogen Biologicals, Essendon, VIC, Austrália). LIM1215 células de carcinoma colo-rectal (ECACC, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido) foram mantidas em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco contendo soro bovino fetal a 10%. As células foram cultivadas a 37 ° C e 5% de CO

2, mantida a 80% de confluência, e estavam livres de micoplasma

amostras de tecido colorrectal humano

amostras de CRC e correspondente normal. mucosa colorrectal foram obtidos a partir do Banco de Tecidos Flinders (n = 30). Essas amostras foram coletadas por dissecção romba de ressecções cirúrgicas frescas, após a aprovação ética do Comité do Sul Adelaide Clinical Ética em Pesquisa e consentimento informado por escrito dos pacientes. aprovação estudo específico para examinar as mudanças miRNA neste tecido colorectal foi obtido a partir Comité de Southern Adelaide Clinical Research Humano Ética (número de aprovação 204,13).

Transfec�es

As linhas celulares foram transfectadas reverso com imita miRNA, inibidores de miARN, siRNAs, contructs plasmídeo e protectores alvo, utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante, em 24 e 96 formatos de placa de 100 (000 e 20 000 células por poço, respectivamente). Para os experimentos imitam, miR-18a, miR-19a e b, e controle negativo (NC) miRNA duplexes de oligonucleotídeos (GenePharma, Xangai, China) foram utilizados em 20 nM cada. miR-18a e NC bloqueado inibidores de Ácido Nucleico (LNA) (Exiqon, Vedbaek, Dinamarca) (IDSs: 18a: 410101-00, NC: 199004-00) foram utilizados a 50 nM. Pré-concebidas Missão siRNAs para

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(ciclo de divisão celular 42) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) (IDs: SASI_Hs01_00222990, SASI_Hs02_00332553) ou um NC siRNA (ID: SIC001) foram transfectadas reversa a uma concentração total de 20 nM. experiências de co-transfecção foram realizadas com 200 ng de DNA de plasmídeo (detalhes de construções abaixo) com 50 nM de miR-18A ou NC miARN imita. experiências de co-transfecção adicionais foram realizados com 20 nm miR-18a ou NC miRNA imita e com protetores alvo miScript (Qiagen, Valencia, CA) projetado para o miR-18a previu gene alvo

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, ou um controlo negativo miScript protector de destino (ID: MTP0000002). protetores alvo foram projetados para os dois sítios de ligação de miR-18a potenciais no

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3’UTR usando um algoritmo Qiagen, e foram transfectadas inversa na concentração recomendada de 500 nM para cada protetor alvo. A sequência alvo contexto protector (a região da 3’UTR que flanqueia o local de ligação) para o primeiro local alvo do

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3’UTR foi 5’AATGAAGAAAAGTATTGCACCTTTGAAATGCACCAAATGA3 ‘, e para o segundo local alvo do

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3’UTR foi 5’GTTGAGGTAATCTTTCCCACCTTCCCAAACCTAATTCTTG3 ‘. protetores alvo adicionais foram projetados para o potencial local de ligação de miR-18a única no

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3’UTR (sequência de contexto: 5’TAGATGTGTAACCTCTTCACCTTATTCATGGCTGAAGTCA3 ‘), e os experimentos foram conduzidos como para

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acima . As células foram cultivadas durante 24-48 h pós-transfecção.

quantificação relativa em tempo real de RT-PCR

TRIzol Reagent (Invitrogen) foi utilizado para a lise de células de cultura e as amostras de tecido humano. O ARN total foi extraído de acordo com as instruções do fabricante. O ARN foi quantificado utilizando um espectrofotómetro Nanodrop-8000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). A análise da expressão foi realizada miARN por quantificação em tempo real em relação RT-PCR utilizando os ensaios de miARN TaqMan (Applied Biosystems, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). O ADNc foi sintetizado a partir de 20 ng de ARN total, utilizando iniciadores específicos de miARN-de acordo com o protocolo do ensaio TaqMan miARN, usando 3,5 ul de mistura principal e 1,5 ul iniciador de RT num volume final de 7,5 mL. PCR em tempo real foi levado a cabo de acordo com o protocolo TaqMan, usando triplicado 10 reacções ul para cada réplica biológica incluindo 1 ul de produtos de transcrição reversa, 0,5 ul específicos de miARN iniciador e sonda de mistura de ensaio (IDs de Ensaio: miR-17: 002,308, miR-18a: 002.422, miR-19a: 000.395, miR-20a: 000.580, miR-19b: 000.396, miR-92a: 000.431) e 1 × TaqMan Universal PCR master Mix Sem AmpErase UNG (Applied Biosystems). ciclagem térmica foi realizada utilizando um rotor-Gene Q (Qiagen, Valencia, CA, EUA). Os resultados foram normalizados relativamente ao ARN nuclear pequeno endógena, RNU6B (ensaio ID: 001093). Os níveis de expressão relativos foram calculados a partir de valores de Ct usando Qgene [24].

Para análise de expressão de ARNm, o ARN foi tratado com ADNase I, e o ADNc foi sintetizado a partir de 1 ug de ARN total, utilizando M-MLV Transcriptase Reversa, ARNase H menos (Promega, Madison, WI, EUA) e os iniciadores de hexâmero aleatório numa reacção de 25 ul. PCR em tempo real foi levado a cabo de acordo com o protocolo de energia verde SYBR (Applied Biosystems) com os seguintes iniciadores para

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: 5’ACGACCGCTGAGTTATCCAC3 ‘(para a frente) e 5’GGCACCCACTTTTCTTTCACG3’ (inverso) e para

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: 5’GATCAAGTGTGACCCGGACTG3 ‘(avançar) e 5’CCTTGGGGTCCATGTTCTGC3’ (reverso), usando triplicado 20 reações ul incluindo 2 l de produto de transcrição reversa, 300 nm para a frente e reverter primers e 1 × Poder SYBR Green Master mix (Applied Biosystems). Os resultados foram normalizados em relação ao controle endógeno

ACTB

níveis (P-actina), utilizando os seguintes iniciadores:. 5’TTGCCGACAGGATGCAGAAG3 ‘(para a frente) e 5’GCCGATCCACACGGAGTACT3’ (reverso), e os níveis de expressão calculados usando Qgene

análise de mancha

tampão RIPA Ocidental foi usado para obter extratos de proteínas de células inteiras, que foram quantificados usando um kit de quantificação de proteínas EZQ (Invitrogen). extratos de proteínas foram resolvidas por SDS-PAGE usando pré-moldados Mini-Protean TGX Stain-free Gel (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA), e para membranas de fluoreto de polivinilideno usando o sistema de transferência de Trans-Blot Turbo e Mini apagou-electro transferência de PVDF Packs (Bio-Rad). As membranas foram bloqueadas com 5% de albumina de soro bovino ou leite em pó desnatado em TBS-T antes da incubação durante a noite com anticorpo monoclonal de coelho anti-CDC42 (11A11) (1:1000) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA). Coelho monoclonal anti-GAPDH (gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase) (D16H11) (1:1000) (Cell Signaling Technology) foi utilizada como um controlo de carga. Secundária a peroxidase de rábano conjugada com IgG de cabra anti-coelho (Immunopure, Thermo Scientific, Rockford, IL) foi usada em conjunção com o sistema de quimioluminescência aumentada (ECL) (SuperSignal West Pico, Rockford, IL, EUA) para visualizar as bandas utilizando o ChemiDoc MP sistema de imagem (Bio-Rad). resultados de densitometria foram normalizados para os níveis de GAPDH.

análise de crescimento celular em tempo real

A proliferação celular foi medida utilizando o instrumento xCELLigence RTCA DP (ACEA Biosciences, San Diego, CA, EUA). As células foram semeadas a 20 000 células por poço de uma placa de E-e cultivadas com tratamentos adequados. Além transfecções, tratamentos também incluída a utilização de um inibidor de molécula pequena de actividade CDC42, ML141 (Sigma-Aldrich), a uma dose de 20 | iM, ou um controlo de veículo de DMSO [25], [26]. O crescimento foi medido a cada 30 min durante 48-72 h. O sistema xCELLigence também foi utilizado para medir a migração ao longo de 24 h, usando a CIM-placa 16 com células cultivadas em meio isento de soro na câmara superior a 30 000 por poço, e soro de bovino fetal a 10% usado como um atraente na câmara inferior. A Kinetic Sistema Incucyte Imagem (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, EUA) foi usado como uma medida de proliferação adicional. As células foram semeadas a 100 000 células por poço de uma placa de 24 poços, e fotografada a cada hora ao longo de 48 h, com 9 imagens por poço. As imagens de contraste de fase ao vivo de células foram utilizados para calcular confluência utilizando o software Incucyte, e para fornecer informações morfologia. Além do processamento de imagem de células vivas, células também foram fixadas com formaldeído a 48 h, e o citoesqueleto foi fluorescentemente coradas com Alexa Fluor 488 faloidina (Cell Signaling Technology) através da ligação de faloidina a F-actina, com células fotografada usando um Olympus BX63 microscópio de fluorescência com 20 × objetiva (Olympus, Center Valley, PA, EUA).

ensaios de apoptose caspase

a apoptose foi medida às 24 h usando um Caspase-glo 3/7 ensaio ( Promega) de acordo com as instruções do fabricante, com o sinal luminescente proporcional à actividade da caspase-3/7. O Incucyte também forneceu uma medida de tempo real adicional; o CellPlayer Caspase 3/7 reagente (Essen BioScience) foi adicionado às células a uma concentração final de 5 uM, e as imagens fluorescentes em tempo real foram tomadas a cada hora ao longo de 24 h. Estas imagens foram usadas para calcular o número de células fluorescentes, usando o software de análise de contagem v2.0 IncuCyte objeto. A apoptose foi monitorizada após transfecção com imita miARN, com ou sem tratamento adicional com o agente de butirato de sódio pró-apoptótica (Sigma-Aldrich), a 2,5 mM durante 24 h.

citometria de fluxo

Células foram recolhidas com tripsina 48 h após a transfecção, lavou-se com PBS e fixadas com 4% de formaldeído com 20 min de incubação em gelo. As células foram lavadas com PBS, em seguida ressuspensas em 0,2% de Triton X em BSA a 1% em solução de PBS, e incubou-se à temperatura ambiente durante 15 min. As células foram lavadas em solução de lavagem de saponina 1% com PBS, em seguida ressuspensas em PBS /iodeto de propídio /ARNase A e incubou-se durante 30 minutos, seguido por análise FACS utilizando um BD FACSCanto II Citómetro de fluxo (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) com filtro 680/40 PI.

miRNA previsão alvo

Previsto genes alvo miR-18a foram obtidos utilizando miRwalk, que reúne dados de vários programas de previsão (DIANAmT, Miranda, miRDB, miRWalk, PICTAR5 , PITA, RNA22 e TargetScan) [27]. Os genes comuns a três ou mais programas de previsão foram analisados ​​utilizando Engenho Pathway Analysis (Engenho Systems, Redwood City, CA) para identificar genes envolvidos na proliferação e controlo do ciclo celular, e expressos em células colorrectais.

O plasmídeo constrói

O

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3’UTR (NM_001791.3) foi amplificado utilizando os seguintes iniciadores: 5’CTCTCCAGAGCCCTTTCTGC3 ‘(avançar) e 5’CAAAGAATTGAGACATGAGAAAGC3’ (reverso), utilizando

UFP

ADN polimerase (Promega) e oligo dT de ADNc iniciada. A 3? UTR foi clonado no vector pGEM-T Easy (Promega), em seguida subclonado no vector psiCHECK-2 (Promega), utilizando

NotI

locais de restrição, e sequenciados. psiCHECK-2 contém Renilla luciferase como um gene repórter primária, e a luciferase do pirilampo como um repórter transfecção normalização intra-plasmídeo. O

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3’UTR foi clonado na região de clonagem múltipla situado a jusante do codão de paragem translacional de Renilla, com a ligação de miARN à 3’UTR previsto para resultar em clivagem e degradação posterior do transcrito de ARNm de fusão. A diminuição da actividade da luciferase de Renilla foi utilizada como um indicador da actividade de miARN.

A mutagénese

mutagénese dirigida foi efectuada utilizando o QuikChange relâmpago Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA ), de acordo com as instruções do fabricante, para excluir os sítios de ligação da sequência de semente de miR-18a no

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3’UTR. Primers para o primeiro site de destino do

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3’UTR (posição 822-844 de NM_001791.3) foram: 5’CACTGATAAATGAAGAAAAGTATTGTGAAATGCACCAAATGAATTGAGTT3 ‘(avançar) e 5’AACTCAATTCATTTGGTGCATTTCACAATACTTTTCTTCATTTATCAGTG3’ (reverso). Primers para o segundo local de destino do

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3’UTR (posição 1295-1317 de NM_001791.3) foram: 5’AAAAATGTTGAGGTAATCTTTCCCCCAAACCTAATTCTTGTAGATG3 ‘(avançar) e 5’CATCTACAAGAATTAGGTTTGGGGGAAAGATTACCTCAACATTTTT3’ (reverso). Os plasmídeos foram preparados com apenas o primeiro site mutado, apenas o segundo local de mutação, ou ambos os sites mutado.

luciferase ensaio

Na sequência de co-transfecção com construções psiCHECK-2 plasmídeo e imita miRNA, luciferase a actividade foi medida após 24 h, utilizando o kit de ensaio de luciferase dual (Promega), de acordo com as instruções do fabricante. actividade da luciferase de Renilla foi normalizada para a actividade da luciferase do pirilampo para o mesmo plasmídeo.

A análise estatística

Os dados foram apresentados como média ± erro padrão da média (SEM) de pelo menos três réplicas biológicas, com gráficos preparados utilizando o GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc, La Jolla, CA). As análises estatísticas foram realizadas utilizando o teste t de Student, com um valor de P . 0,05 considerado significativo

Resultados

miR-18a tem menor expressão global em comparação com os outros membros do cluster miR-17-92 em células colorretal

amostras dos bancos de tecidos humanos foram utilizados para investigar os níveis de miR-18a em CRC e mucosa colorectal normais, em relação aos níveis de outros miR-17-92 miRNAs cluster. níveis de miRNAs de cluster miR-17-92 foram quantificados em amostras (Dukes C) CRC cedo (Dukes A) e avançado, e mucosa colorretal normal correspondente. miR-17-92 miRNAs foram elevados em amostras de CRC (Dukes A: miR-17 P = 0,01, miR-18a P = 0,01, miR-19a P = 0,005, miR-20a P = 0,002, miR-19b P = 0,009, miR-92a P = 0,07; Dukes C: miR-17 P = 0,0003, miR-18a P = 0,0005, miR-19a P = 0,0009, miR-20a P 0,0001, miR-19b P = 0,001, miR-92a P = 0,0007) em comparação com o tecido normal correspondente, e que teve maior expressão nas amostras Dukes C (Figura 1A e 1B). miR-18a tiveram menor expressão global em comparação com os outros membros do cluster miR-17-92, em ambas as amostras de Dukes A e C, e no tecido normal combinado (Figura 1A e 1B).

(A) miR níveis -17-92 de cluster de miRNA em Dukes A e amostras de tecidos normais adjacentes (B) níveis de cluster miR-17-92 miRNA em Dukes C e amostras de tecidos normais adjacentes. A média ± SEM de 30 pacientes está apresentada e expressão é normalizado para RNU6B. * P . 0,05

miR-18a modula o crescimento de células de câncer colorretal e de morte

A transfecção de células HCT116 CRC com imita miR-18a levou à proliferação reduzida durante um período de tempo de 48 h , em comparação com as células transfectadas imitam NC (p 0,0001) (Figura 2A). Observou-se um efeito anti-proliferativo semelhante para miR-18a em uma linha de células de CRC adicional, LIM1215 (P = 0,0009) (Figura 2B). A transfecção de células HCT116 com um inibidor de miARN LNA miR-18a teve o efeito oposto, com o aumento da proliferação ao longo de um período de tempo de 48 horas em comparação com o NC inibidor células transfectadas (P = 0,03) (Figura 2C). As células HCT-116 transfectadas com imita o miR-18a apresentada uma diminuição da capacidade para migrar ao longo de um período de 24 h, comparado com as células transfectadas imitam NC (P = 0,004) (Figura 2D).

medições do índice de célula usando o xCELLigence RTCA DP instrumento. (A) Proliferação de NC e mímica miR-18a transfectadas células HCT116 mais de 48 h. (B) Proliferação de NC e mímica miR-18a transfectadas LIM1215 células mais de 48 h. (C) Proliferação de NC e inibidor de miR-18a transfectadas células HCT116 mais de 48 h. (D) migração de NC e miR-18a imitar transfectadas células HCT116 mais de 24 h. A média ± SEM de 6 repetições de cultura de células é mostrada para cada. * P . 0,05

A transfecção com imita miR-18a também apareceu para alterar a morfologia das células. imagens em tempo real tomadas ao longo de 48 h revelou que as células transfectadas com HCT116 imita o miR-18a eram mais arredondados e menos aderente, com um nível reduzido de confluência (P 0,001) (Figura 3A e 3B). A adição de miR-19a e imita b revertida em grande parte este efeito. As células transfectadas com o miR-19a e b, para além de miR-18a eram mais parecidos com as células transfectadas imitam NC, com uma morfologia mais prolongado, para além de níveis semelhantes de confluência ao longo de 48 h (p = 0,20); níveis de confluência aumentou significativamente nestas células em comparação com as células transfectadas com o miR-18a imitam sozinho (P 0,001) (Figura 3A e 3B). A análise de imunof luorescência do componente de actina do citoesqueleto com Alexa Fluor 488 faloidina também enfatizado a morfologia celular alterada, em que as células HCT116 miR-18a mímico transfectadas, incluindo uma aparência mais arredondada com reduzida adesão intercelular (Figura 3C).

imagens de células em tempo real usando o instrumento Incucyte. (A) Imagens representativas de NC, mímica miR-18a e miR-18a, 19a e células transfectadas imitar b às 48 h pós-transfecção. (B) Confluence quantificados a partir de imagens em tempo real da NC, mímica miR-18a e miR-18a, 19a e células transfectadas imitar B em 48 h. A média ± SEM de 6 repetições de cultura de células é mostrada. * P 0,05. (C) Imagens representativas (20 ×) de Alexa Fluor 488 faloidina fluorescente coloração do citoesqueleto de actina de células imitam transfectadas NC e miR-18a às 48 h pós-transfecção.

Para medir a apoptose, um caspase ensaio 3/7 extremidade foi realizada 24 horas após a transfecção de células HCT116. Transfecção com imita miR-18a aumento da apoptose em comparação com NC células transfectadas imitar (P = 0,04), enquanto co-transfecção com miR-19a e imita b reduziu a apoptose em comparação apenas com miR-18a imita, a um nível semelhante ao NC imitam transfectadas células (P = 0,16) (Figura 4A). A transfecção com o miR-19a e imita B sozinha não teve nenhum efeito sobre a apoptose. A adição de imita o miR-18a também melhorada a acção de um agente pró-apoptótico conhecido. inibidores de HDAC, tais como butirato, ter sido previamente demonstrado para induzir apoptose em células de CRC [28] – [30]. As células transfectadas com imita o miR-18a em conjunto com o tratamento com butirato 2,5 mM tinham níveis mais elevados de apoptose às 24 h comparado com as células transfectadas imitam NC também tratadas com butirato de (P = 0,001) (Figura 4A). Mais uma vez, a transfecção de miR-19a e imita B com o imita o miR-18a reduzido este efeito, em comparação com os miR-18a imita isoladamente (p = 0,03), embora a apoptose foi ainda mais elevada do que com os imitadores NC (P = 0,03) ( Figura 4A). O efeito de miR-18a sobre a apoptose foi ainda estudado em tempo real, utilizando o sistema de Incucyte e um ensaio de caspase 3/7 fluorescente para obter imagens de células em apoptose. Quando as imagens das células HCT116 medidos 24 h após o tratamento butirato foram quantificados, existiam células significativamente mais fluorescentes, com a transfecção mímico miR-18a comparado com NC transfecção mímico, em células sem tratamento com fármaco (p 0,001), e em células tratadas com 2,5 butirato mM (P 0,001) (Figuras 4B e 4D). Foi observado um efeito semelhante nas células LIM 1215, com diferenças na contagem de células fluorescentes entre o mímico miR-18a e NC transfecção mímica atingindo significância de 48 h após o tratamento butirato (P = 0,03 em células sem tratamento medicamentoso; P = 0,02 em células tratadas com 2,5 mM de butirato) (Figura 4C).

(a) Caspase 3/7 ensaio luminescente na NC, miR-18a mímica, miR-19a e b mímica, e miR-18a, 19a e b mímica transfectadas células HCT116 às 24 h pós butirato disso. A média ± SEM de três repetições de cultura de células é mostrada. * P 0,05. Quantificação (B e D) e de células representativas imagens em tempo real utilizando o instrumento fluorescentes Incucyte que mostra a apoptose em células HCT116 transfectada imitam NC e miR-18a às 24 h pós butirato de adição. A média ± SEM de três repetições de cultura de células é apresentada em B. (C) Quantificação de imagens fluorescentes das células em tempo real usando o instrumento Incucyte que mostra a apoptose em NC e miR-18a imitar células LIM1215 transfectadas às 48 h pós butirato de adição. A média ± SEM de três repetições de cultura de células é mostrada. (E) A citometria de fluxo análise da NC, mímica miR-18a e miR-18a, 19a e células transfectadas imitar b HCT116 às 48 h pós-transfecção; cada representante gráfico de 3 cultura de células replica.

A citometria de fluxo foi realizada 48 horas após a transfecção de células HCT116, e também mostrou uma acumulação de células que sofrem morte celular ou apoptose nas células miR-18a mímico transfectadas (Figura 4E). Os imita miR-18a foram mostrados para induzir /S parada do ciclo celular fase G1. A adição de miR-19a e b imita resultou na diminuição da morte celular e interrupção do ciclo celular do que com miR-18a mímica sozinho (Figura 4E).

A expressão do gene CDC42 controle do ciclo celular é reduzida por miR-18a e um aumento de miR-19a e b

Tendo em conta as conclusões que o miR-18a reduz a proliferação e migração, altera a morfologia celular, aumenta a apoptose, e induz a paragem do ciclo celular, previu foram identificados alvos de miR-18a que estão envolvidos nestes processos celulares. Entre miR-18a metas previstas foi ciclo de divisão celular 42 (

CDC42

), que foi predito por vários programas de previsão de destino. CDC42 é um membro da família Rho de GTPases, uma subfamília da superfamília Ras de GTPases pequenas [31]. Após a activação, CDC42 é capaz de se ligar uma variedade de proteínas efectoras e iniciar numerosas vias de sinalização a jusante, incluindo aqueles que estão envolvidos na remodelação do citoesqueleto, a progressão do ciclo celular, proliferação celular, sobrevivência e migração [32] – [37]. Existem diversas variantes de transcritos de

CDC42

, que codificam uma isoforma canónica presente na maioria dos tecidos (isoforma 1), e uma isoforma específica do cérebro (isoforma 2). A 3’UTR dos transcritos para a isoforma canónica contém dois previu miR-18a locais de ligação, enquanto que o 3 ‘UTR alternativo do transcrito para a isoforma cérebro contém dois locais de ligação previsto miR-18a diferentes. Para o propósito deste estudo em células colorretal,

CDC42

isoforma 1 foi investigada.

A transfecção de células HCT116 CRC com imita miR-18a reduzidos níveis de transcrição de

CDC42

comparação com as células transfectadas NC imitam às 48 h, quando detectados por em tempo real de RT-PCR (P 0,0001) (Figura 5A). Surpreendentemente, a co-transfecção de miR-19a e imita B, juntamente com os imitadores de miR-18A produziu o efeito oposto, com o aumento da

níveis de ARNm que foram significativamente mais elevada do que tanto as células imitam NC (P = 0,0006) e as células transfectadas imitam o miR-18a (p 0,0001) (Figura 5A). A transfecção com um inibidor de miR-18a aumento dos níveis de transcritos de

CDC42

em comparação com os NC células transfectadas imitam às 48 h, quando detectados por em tempo real de RT-PCR (P 0,005). (Figura 5B)

(A)

CDC42

níveis de mRNA em NC, miR-18a mímica, e miR-18a, 19a e células transfectadas imitar b às 48 h pós-transfecção (B)

CDC42

níveis de mRNA em células inibidores transfectadas NC e miR-18a em 48 h pós-transfecção. A média ± SEM de 6 repetições de cultura de células é mostrada para cada expressão e é normalizado para ACTB. * P 0,05. (C e D) mancha de Western dos níveis de proteína Cdc42 em NC, mímica miR-18a, e miR-18a, 19a e as células transfectadas imitam B às 48 h pós-transfecção. gráfico densitometria mostra a média ± SEM de 3 de cultura de células replica para cada e expressão é normalizado para GAPDH * P . 0,05

análise de Western blot mostrou níveis de proteína Cdc42 também foram reduzidos significativamente no miR-18a imitar células transfectadas em comparação com as células transfectadas imitam NC, às 48 h (p = 0,02) (Figura 5C e 5D). A co-transfecção de miR-19a e imita B com o imita o miR-18A aumentado os níveis de proteína em comparação com o miR-18a imita isoladamente (p = 0,008), com níveis mais próxima da de NC células transfectadas imitam (P 0,05) (Figura 5C e 5D).

miR-18a atinge diretamente o 3’UTR de CDC42

Um sistema de ensaio de luciferase foi utilizado para determinar que o miR-18a atinge diretamente o

CDC42 Sims 3 ‘UTR. plasmídeos repórter luciferase dupla foram construídos com uma intacta

CDC42

3’UTR, ou com

CDC42

3’UTRs mutado no primeiro, segundo, ou ambos os locais de ligação previstos miR-18a (Figura 6A). As células HCT116 foram transfectadas com cada um dos plasmídeos, em conjunto com o miR-18a ou imita NC, e a actividade de luciferase de pirilampo e Renilla foram medidos às 24 h. Uma diminuição da actividade da luciferase de Renilla foi normalizada utilizada como um indicador da ligação de miR-18a e repressão.