Abstract
Fundo
câncer epitelial de ovário é a principal causa de mortes por câncer ginecológicos. A maioria dos pacientes respondem inicialmente à quimioterapia à base de platina após debulking cirúrgico, no entanto recaída é muito comum e, finalmente, de resistência de platina emerge. Compreender o mecanismo do crescimento tumoral, metástase e recidiva resistente a medicamentos vai impactar profundamente o manejo terapêutico de câncer de ovário.
Métodos /principais conclusões
Usando tissue microarray paciente (TMA),
em vitro Comprar e
in vivo
estudos que relatam um papel de cistationina-beta-sintase (CBS), uma enzima metabolismo do enxofre no carcinoma do ovário. Relatamos aqui que a expressão de cistationina-beta-sintase (CBS), uma enzima de metabolismo do enxofre, é comum no carcinoma do ovário seroso primária. O
in vitro
efeitos da CBS silenciamento pode ser revertida por suplementação exógena com a GSH e H
2S produzindo química Na
2S. Silenciando CBS em um modelo de cisplatina resistentes ortotópico
in vivo
pela entrega nanoliposomal da CBS siRNA inibe o crescimento do tumor, reduz a formação de nódulos e sensibiliza as células de cancro do ovário a cisplatina. Os efeitos foram ainda confirmada por imuno-histoquímica que demonstra uma redução de H E, Ki-67 e células CD31 positivas em SI-ARN tratado, em comparação com ARN-mexidos animais tratados. Além disso, a CBS também regula bioenergética de células de cancro do ovário, regulando a produção de ROS mitocondrial, consumo de oxigênio e geração de ATP. Este estudo relata um papel importante da CBS na promoção do crescimento do tumor de ovário e manutenção de fenótipo resistente a medicamentos, controlando o comportamento redox celular e regulação bioenergética mitocondrial.
Conclusão
A presente investigação destaca CBS como um potencial terapêutico -alvo no cancro do ovário resistentes platina recaída e
Citation:. Bhattacharyya S, Saha S, Giri K, Lanza IR, Nair KS, Jennings NB, et al. (2013) Cistationina Beta-sintase (CBS) Contribui para o avançado do cancro do ovário progressão e resistência aos medicamentos. PLoS ONE 8 (11): e79167. doi: 10.1371 /journal.pone.0079167
editor: Soumitro Pal, do Hospital Infantil de Boston Harvard Medical School, Estados Unidos da América
Recebido: 30 de agosto de 2013; Aceito: 18 de setembro de 2013; Publicação: 13 de novembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Bhattacharyya et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) CA135011 e CA136494 (PM), CA 157481 (RB), CA148747 (CC) e Programa do cancro das mulheres Clínica Mayo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Nos últimos anos o gasotransmitter H
2S ganhou imensa importância variando de prokaryote a vertebrados biologia e expandir [1] – [6]. Em um artigo seminal, Roth et ai. demonstraram que o pré-tratamento com H
2S prevenida lesão hipóxica em ratos, reduzindo drasticamente a temperatura corporal do animal e do metabolismo, semelhante ao que é observado em hibernação mamíferos [7]. Ainda um outro artigo demonstrou que as enzimas perda de H
2S sintetizando sensibilizados uma infinidade de bactérias causadoras de doenças aos antibióticos, principalmente através do aumento do estresse oxidativo [8]. No entanto, um papel para enzimas metabólicas que sintetizam H
2S não foi descrito na biologia do câncer permanece sob investigação.
Nos seres humanos, duas principais enzimas metabólicas sintetizar H
2S, cistationina beta-sintase (CBS ) localizada principalmente no liase gamma cérebro e tecidos do fígado e cistationina (CSE /CTH) encontrado principalmente no tecido muscular [9]. CBS é a primeira enzima limitante da taxa na via de transulfuração e através da utilização de homocisteína (Hcy) produz H
2S e do precursor de cisteína cistationina [10]. Além disso a absorção celular de cistina, cisteína síntese é o passo limitante da velocidade para a produção de glutationa (GSH), o antioxidante ubíqua. Estudos utilizando ratos knockdown CBS têm enfatizado a importância desta enzima em distúrbios cardiovasculares e neurovasculares, principalmente causando disfunção endotelial, que se pensa ser devido a níveis de homocisteína no plasma melhoradas [11] – [13]. No entanto, a suplementação com vitamina B
12 e ácido fólico (que facilitam remetilação da Hcy para metionina) reduziu os níveis circulantes de Hcy ainda não conseguiu reduzir os sintomas de doenças cardiovasculares. Por outro lado, a vitamina B
6, um cofactor para a CBS, não conseguiu reduzir os níveis circulantes de Hcy em ensaios clínicos recentes [14], [15]. Estes resultados indicam o envolvimento de outros componentes, além de Hcy, como sendo os principais intervenientes nos distúrbios mencionados acima.
Considerando a acção citoprotectora notável de H fisiológico
2S e glutationa que postulou que células cancerosas podem explorar essa única característica da CBS para produzir H
2S quando está sob estresse oxidativo ou por insulto citotóxica. Neste contexto, estamos focados em câncer epitelial de ovário, que é a principal causa de morte por câncer ginecológico em mulheres. A maioria dos pacientes respondem inicialmente à quimioterapia à base de platina após debulking cirúrgico, no entanto recaída é muito comum e, finalmente, de resistência de platina emerge. O mecanismo desta recorrência e evolução do fenótipo de resistência a drogas no entanto permanece mal compreendido [16], [17]. Para o melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro relatório que descreve um papel para a CBS na manutenção da saúde celular de células de cancro do ovário por meio do ajuste comportamento redox celular e produção de energia mitocondrial. Silenciando CBS inibe significativamente a proliferação de células de cancro do ovário, formação de nódulos metastáticos e sensibiliza-los a cisplatina ambos
in vitro Comprar e no mouse modelos ortotópicos pré-clínicos
in vivo
. Mecanicamente, silenciando CBS reduz severamente os níveis de GSH celulares, prejudica H
produção 2S, ativa supressores de tumor tais como p53 e inibe a activação de NF-kB. CBS co-localiza com marcadores mitocondriais em células cancerosas, e silenciando CBS diminui o consumo de oxigênio mitocondrial com um concomitante aumento na produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS). Estes resultados em conjunto indicam que a CBS desempenha um papel importante na regulação do equilíbrio redox e metabolismo das células de cancro do ovário a promoção do crescimento de tumores e metástases.
Materiais e Métodos
Declaração de Ética
As amostras dos pacientes.
Todos os 210 participantes inscritos até 2009, de quem foi obtida de tecido para TMA, desde consentimento informado por escrito para um protocolo IRB-aprovado (09-008365) e dados clínicos foram resumidos para todos os casos. Todos os estudos foram aprovados pela Mayo Clinic Institutional Review Board (Protocolo # 09-008365).
As experiências com animais.
ratinhos nus atímicos fêmea (NCr-nu) foram adquiridos a partir do National Cancer Institute -Frederick Cancer Research e Development Center (Frederick, MD). Todos os ratos foram alojados e mantidos sob condições específicas isentos de agentes patogénicos, em instalações aprovadas pela Associação Americana de Acreditação do Laboratório Animal Care (Acuf # 01-12-01531) e de acordo com os regulamentos e as normas do Departamento de Agricultura, EUA US atuais Departamento de Saúde e Serviços Humanos, e NIH. Todos os estudos foram aprovados pela Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center Institutional Animal Care e do Comitê Use.
Reagentes
Detalhes de todos os reagentes utilizados são fornecidos no
S1 Arquivo.
OV167 e OV202 (obtido a partir de V. Sridhar, Mayo Clinic) linhas de células foram cultivadas em MEM e DMEM suplementado com, respectivamente, 10% de FBS e 1% de antibióticos (penicilina /estreptomicina). OVCAR-5 foi a partir de ATCC e cultivadas em DMEM com soro de bovino fetal a 10% e 1% de antibióticos (penicilina /estreptomicina). células A2780 (Sigma-Aldrich) foram cultivadas em RPMI com 10% de FBS e 1% de antibióticos (penicilina /estreptomicina) de acordo com a recomendação do fornecedor. células OVCAR-5 foram cultivadas em DMEM de alto teor de glucose com 10% de FBS, L-glutamina e NEAA. células OSE (TST) foram cultivadas em meio MCDB105 com 15% de FBS e 1% de higromicina. Os /CP-70 linhas celulares A2780 foram cultivadas de acordo com nossos procedimentos publicados anteriormente [18]. linha de células SKOV3 da ATCC e SKOV3-ip do laboratório de V. Sridhar (Clínica Mayo) foram cultivadas em meio de McCoy 5A suplementado com 10% FBS e 1% de antibiótico.
Os participantes do estudo e Construção de arrays de tecido (TMAs)
TMA foram criados a partir, tumores embebidos em parafina fixadas em formalina de 210 casos da clínica Mayo inscritos até dezembro de 2009. Todos os participantes forneceram consentimento informado por escrito para um protocolo IRB-aprovado (09-008365) e dados clínicos foram resumidos para todos os casos. Todos os estudos foram aprovados pela Clínica Mayo Institutional Review Board (Protocolo # 09-008365).
Foi utilizado um sistema automatizado Beecher Instruments ATA-27 arrayer seguinte análise patologista indicando a localização do tumor. Três núcleos de 0,6 mm foram retiradas de cada bloco caso parafina e colocada num bloco de parafina receptor de acordo com um mapa de TMA electrónico randomizado. blocos receptores foram cortados em secções 5 mícrons e montadas em lâminas carregadas.
Antibody, imunohistoquímica e Scoring
TMA coloração foi realizada no auto Stainer Leica BOND, utilizando polímero de ligação kit de detecção de refinar (# DS9800 catálogo, Leica Microsystems). As lâminas foram expostas ao anticorpo primário que reconhece a CBS (1:1000, A01 policlonal, Abnova), depois de optimizar as condições de coloração de tecidos de controlo positivo (tumores de células da granulosa). Os controlos negativos incluíram um jogo isótipo inespecíficos e soros de rato negativo (1:500); As lâminas foram marcados de forma independente por 2 autores (RB e EB), e as discrepâncias foram resolvidas por um patologista ginecológica (
S1 Arquivo
).
transfecção e Knockdown
As células foram transfectadas com controle mexidos siRNA ou CBS siRNA (Hs_CBS_5 FlexiTube siRNA (SI02777159, QIAGEN) /SASI_Hs01_00214623 (Sigma)) pelo agente de transfecção HiPerFect® em suspensão com uma ligeira modificação do protocolo do fabricante (
S1 Arquivo
).
a lise celular e western blotting
a lise celular e transferência de western foi realizada como para o procedimento já publicada [19]. Os anticorpos primários foram utilizados a uma concentração do seguinte modo: CBS (1:1000 diluição), anticorpo CSE (1:1000), α-tubulina (1:2000), β-actina (diluição 1:1000), NF-kB p65 (1:1000 diluição) e o anticorpo p53 (1:200 diluição).
em tempo real de PCR
O ARN total foi isolado a partir de células transfectadas utilizando RNeasy Mini kit Além disso (QIAGEN). O ARN foi retrotranscrito primeiro utilizando o kit de síntese de ADNc iScript (Bio-Rad) e, em seguida, realtime PCR foi realizada utilizando TaqMan ® SYBR Verde Master Mix (Applied Biosystems). Os iniciadores para a CBS humana (PPH13484B-200) e beta actina (PPH00073G-200) foram ACTB da Qiagen. Para CSE, primers projetados foram usados (Forward: CAGCCTTCAATGTCAATCACC: CAGCAATTACACCAGAAACCAAG e Reverse). O método C
t comparativa foi utilizada para calcular a abundância relativa do ARNm e comparada com a de expressão da beta-actina [20]. Os experimentos foram realizados três vezes em triplicado.
Proliferação Celular Ensaio
células de cancro do ovário transfectadas foram colhidas por tripsinização, contadas semeadas em 24 wellplates (4 × 10
4 por poço) e cultivadas por 24 h e ensaio de timidina (3H) realizado [21] (
S1 Arquivo
).
a homocisteína (Hcy) Medição
níveis de homocisteína como anteriormente descritos na Os lisados celulares de Sc-siRNA e CBS siRNA células A2780 tratados foram determinados 48 h após a transfecção por espectrometria de massa em tandem com cromatograf ia líquida (LC /MS /MS) (
S1 ficheiro
).
A homocisteína sobredosagem Experiência
Aproximadamente, 10
4 A2780, OSE ou SKOV3-ip células por poço foram plaqueadas numa placa de 96 poços com os respectivos meios de cultura de crescimento. Após 24 h, várias concentrações de Hcy dissolvidos em meios de cultura de crescimento foram adicionados às células e incubado durante 24 h num
2 incubadora de CO. 24 h pós-tratamento, a viabilidade celular foi avaliada por ensaio de MTS como mencionado acima.
H
2S Medição
H
2S concentrações de não tratada ou tratada AOAA células de cancro do ovário foram medidos após uma literatura relatou protocolo com modificações menores [22]. O H
concentração 2S de cada amostra foi calculada contra uma curva de calibração de Na
2S.
H
2S Resgate Experiment
células A2780 foram transfectadas com siRNA controle mexidos ou siARN controlo CBS como mencionado acima. 48 h pós-transfecção, as células foram colhidas por tripsinização e 10
4 células /poço foram plaqueadas numa placa de 96 poços. Após 12 h, várias concentrações de Na
2S dissolvidos em RPMI-SBF a 10% foram adicionados às células e incubado durante 24 h num
2 incubadora de CO. Após 24 h, a viabilidade celular foi avaliada por ensaio de MTS como mencionado acima.
GSH Ensaio
O ensaio foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante (Cayman Chemicals). Resumidamente, as linhas celulares de cancro do ovário foram transfectadas com o controlo mexidos ou CBS siARN em placas de cultura de 60 mm, como mencionado acima. Após 48 h, as células foram raspadas e recolhidas em MES 50 mM, pH 6,0 e lisadas por sonicação a 4 ° C. O ligado foi então centrifugado a 14000 rpm durante 10 min a 4 ° C e o sobrenadante clarificado (isto é, ligado de células) foi recolhido. O lisado foi de-proteinado utilizando o reagente equipe e do GSH celular total determinado contra uma curva padrão gerada simultaneamente, medindo a absorvância a 405 nm durante 25 min após a adição do cocktail do ensaio. O experimento foi realizado em triplicado e significância determinada pelo teste t de duas faces de Student, P ≤ 0,05 foi considerado significativo.
GSH Experiment Resgate
células A2780 foram transfectadas com controle mexidos siRNA ou controlo CBS siRNA como mencionado acima. Pós 48 h de transfeco, as culas foram colhidas por tripsinização e 10
4 células /poço foram plaqueadas numa placa de 96 poços. Após 12 h, várias concentrações de glutationa reduzida dissolvido em RPMI-SBF a 10% foram adicionados às células e incubado durante 24 h num
2 incubadora de CO. Pós 24 h de tratamento, a viabilidade celular foi avaliada por ensaio de MTS com Cell Titer 96® (Promega) de acordo com o protocolo do fabricante. A viabilidade celular foi expressa como uma relação percentual da absorvância de células tratadas com os controlos não tratados.
ROS Ensaio
O ensaio foi realizado de ROS nas células A2780 48 h pós-transfecção com mexidos controlo ou CBS siRNA após uma modificação de um procedimento publicado anteriormente utilizando citometria de fluxo [23] (
S1 Arquivo
).
luciferase Reporter Assay
Aproximadamente, 2 × 10
4 número de células A2780 foram semeadas por poço de placa de 96 poços, um dia antes da transfecção. No dia seguinte, as células foram transfectadas com uma mistura de NF-kB conduzido a luciferase do pirilampo de plasmídeo (100 ng), o plasmídeo luciferase de Renilla (50 ng) e ARNsi (200 nM) por poço usando Lipofectamina e Plus reagente (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante . Pós 48 h de transfeco, os meios de cultura foram descartados e foram ensaiadas quanto à actividade de luciferase de pirilampo e a actividade de luciferase Renilla usando dupla Glo Luciferase Assay System (Promega) de acordo com o método do fabricante. A proporção de actividade de luciferase do pirilampo para Renilla actividade da luciferase medida por luminescência foi, em seguida, calculada e os dados foram normalizados. O experimento foi realizado em triplicado e significância determinada pelo teste t de Student de duas faces, P ≤ 0,05 foi considerado significativo.
microscopia confocal
Localização da CBS foi determinada por imunocoloração seguido por microscopia confocal. Aproximadamente, 1,5 × 10
3 células foram colocadas por câmara de um lâminas de 4 câmaras. Após 12 h, as células foram tratadas com 200 nM Mitotracker verde (Invitrogen) durante 30 min a 37 ° C em meios completos fixados com PFA a 4%, permeabilizadas com 0,1% TritonX-100 em PBS, bloqueadas com BSA a 4% em PBS, coradas com anticorpo CBS primário (diluição 1:100) em 1% de BSA-PBS, bloqueadas com soro de cabra a 5% em 1% BSA-PBS e coradas com anticorpo secundário anti-coelho de cabra marcado com Cy3. As células foram lavadas 3 × com PBS três minutos depois de cada passo durante a imunocoloração. As imagens foram adquiridas usando Zeiss LSM510 microscópio e processados usando ImageJ (NIH).
Experimentos consumo de oxigênio
De alta resolução de respirometria (Oxygraph, Oroboros Instruments, Innsbruk, AT) foi utilizado para medir o oxigênio taxas de consumo em células intactas [24]. DatLab software (Oroboros Instruments, Innsbruk NA) foi utilizado para determinar ó
2 fluxo sob tratamento AOAA aguda e em células tratadas com siRNA A2780. taxas de fluxo de oxigênio foram expressos por milhão de células
(S1 Arquivo).
mitocondrial ROS Produção
níveis mitocondrial ROS foram determinadas no controle mexidos siRNA e CBS siRNA células tratadas 48 h pós-transfecção por MitoSOX (Invitrogen) coloração foi realizada conforme o protocolo literatura [25]
(detalhadas no S1 Arquivo)
.
citrato sintase (CS) Atividade
CS actividade foi medida espectrofotometricamente em todo o lisados celulares de células A2780 após tratamento com diferentes doses de AOAA durante 3 horas seguindo um método relatado literatura [26].
NAD /NADH de medição da relação
NAD /NADH foi medido utilizando Abcam NAD /NADH Assay Kit (ab65348) em lisados de células inteiras de acordo com o protocolo do fabricante (ver pormenores no
S1 Arquivo
).
ATP total e ADP /ATP relação
Os níveis totais de ATP em CBS silenciados células A2780 e A2780 AOAA trataram células foram medidos utilizando Sigma adenosina 5′-trifosfato (ATP) Bioluminescent Assay Kit (Flaa) e ADP /relação de ATP foi medido utilizando ADP da Abcam /kit de ensaio razão ATP conforme os protocolos dos fabricantes. protocolo detalhado no
S1 Arquivo.
siRNA Preparação lipossomal
Para
in vivo
entrega, siRNA foi incorporada DOPC como descrito anteriormente [18]. Para mais detalhes veja
S1 Arquivo.
Ortotópico Modelo de câncer de ovário
Antes de células tumorais injecção no ratinhos (8-12 semanas de idade), as células foram lavadas duas vezes com PBS, individual por EDTA a 0,1% frio, centrifugou-se durante 7 min, e reconstituída em HBSS (Invitrogen). A viabilidade das células foi confirmada por exclusão de azul de tripano. Os tumores foram estabelecidos por injecção i.p. injecção de 1,0 × 10
6A2780 células /CP20. Uma vez estabelecido, este modelo de tumor reflete o padrão de crescimento do câncer de ovário avançado [27]. Para avaliar os efeitos da terapia de ARNsi no crescimento do tumor, o tratamento foi iniciado uma semana depois da administração i.p. injecção de células tumorais. Os indivíduos que fizeram as necropsias, coleções tumorais e processamento de tecidos foram cegos para as atribuições do grupo de tratamento (Arquivo S1).
A imuno-histoquímica de amostras de tumores
OCT amostras de tumores congelados foram seccionados e corados para H e, Ki-67 (MIB-1, Dako, M7240) ou CD31 (PECAM-1, Santa Cruz, SC-1506-R) como anteriormente descrito [28]. (S1 Arquivo).
Análise Estatística
Todos os resultados são apresentados como média +/- D.P.. A significância estatística foi determinada pelo teste t de Student bilateral, e um valor de P ≤ 0,05 (*) foi considerado significativo e p≤0.01 como altamente significativa (**). Para comparação entre os vários grupos, One-way ANOVA foi utilizada (File S1).
Resultados
CBS é abundante na Primária epitelial cancro do ovário e linhas celulares de cancro do ovário
Tissue os estudos de distribuição em seres humanos revelaram que o fígado e o pâncreas tem a expressão mais elevada de ARNm de CBS com alguma expressão no cérebro e rim [29]. Em modelos murinos, a CBS tem sido sugerido para ser envolvido no desenvolvimento dos oócitos e
CBS
– /- ratos sofrem de disfunção uterina [11], [30]. Para compreender o papel da CBS no cancro do ovário humano, avaliou o nível de expressão da CBS em amostras de cancro do ovário primárias e sua relação com fatores cirúrgico-patológicos. Utilizando uma série de microarrays de tecido (TMAs) construídos a partir de cancros do ovário epiteliais primárias foram identificados 210 casos com a coloração avaliável usando TMAs. Encontrámos expressão de CBS de ser comum no citosol de tumores ovarianos primárias, particularmente no carcinoma seroso, a variante histológica mais comum. A tabela 1 resume os fatores demográficos, clínicos e histológicos que foram avaliados por uma associação com moderada a expressão CBS forte (Tabela 1). Resumidamente, a expressão moderado-forte foi relacionado com a histologia serosa (69,8% vs 41,0% vs nonserous serosa, p 0,001) e cancros de grau superior (64,7% vs 31,6%, de grau 3 ou 4 de grau x 1 ou 2, p = 0,005) (Fig. 1A). Embora estatisticamente significativamente diferente entre os estágios, expressão ainda estava presente em 35% dos tumores em fase inicial. Ao considerar apenas os 149 casos graves da coorte maior, expressão era moderada a forte em 8/11 fase inicial (FIGO fases I e II) cancros, sugerindo que a expressão CBS é uma característica relativamente precoce do câncer de ovário seroso. Tendo demonstrado a expressão do CBS em tecidos tumorais humanos, comparou-se a expressão do CBS em ovário normal versus linhas de células de cancro. Utilizou-quantitativo PCR em tempo real (qRT-PCR) e imunotransferência para avaliar a expressão do ARNm no CBS e os níveis de proteína respectivamente (Fig. 1B-D). Tanto no nível de proteína e de ARNm, mínima ou nenhuma expressão de CBS foi observado na linha não-malignas das células epiteliais da superfície do ovário (OSE). No entanto em 4 de 6 linhas celulares de cancro expressa significativamente alta CBS tanto ao nível do mRNA e de proteínas. Curiosamente, foi observada a expressão de CSE em linhas celulares que expressam pouco ou nenhum CBS incluindo OSE, sugerindo uma correlação inversa entre a expressão de ambas as enzimas (Fig. 1B). Depois de confirmar que a CBS é expresso tanto em linhas celulares, e em cancros do ovário primárias nós próxima procurou examinar o significado funcional da CBS.
(A) coloração imuno-histoquímica de um tissue microarray de amostras de câncer epitelial de ovário. Imagens representativas são mostrados de nenhum (I), fraca (II), moderada (III), e a coloração forte (IV). (B) Expressão de CBS e CSE em várias linhas de células de ovário como determinado por imunotransferência. α-tubulina é utilizado como o controlo da carga. de dados (C) RT-PCR que apresentam a expressão dos ARNm do CBS em várias linhas de células de ovário. de dados (D) de RT-PCR que apresentam a expressão de mRNA de CSE em várias linhas de células de ovário. (E) Efeito do CBS knockdown sobre a proliferação de dados (F) Immunoblotting OV202, SKOV3, A2780 e A2780 /CP-70 e as células para determinar a extensão de knockdown mediada por siARN. (G) Efeito da inibição da CBS sobre a proliferação de OV202, SKOV3 e células A2780 por AOAA (24 h de tratamento) determinado através de ensaio de MTS.
regulação negativa do CBS danifica Proliferação Celular
in vitro
para determinar qualquer papel para CBS na proliferação de células de cancro do ovário, a CBS foi silenciada no A2780, A2780 /CP-70, células OV202 e SKOV3 usando siRNA específico da CBS. Para excluir a segmentação não específica do siARN, knockdown e a proliferação foi avaliada com ARNsi de duas fontes diferentes. Uma diminuição significativa na proliferação foi observada em todas as linhas de células de cancro do ovário estudou em cima CBS knockdown por (
3H) -timidina incorporação (Fig. 1E). knockdown eficiente da CBS (~ 80%) foi também confirmada por imunotransferência 48 h pós-transfecção, em comparação com células mexidos siARN transfectadas (Fig. 1F). Para confirmar ainda mais os efeitos de silenciamento CBS sobre a viabilidade das células do cancro do ovário, foi utilizado um inibidor químico específico de CBS, Ácido Aminoxyacetic (AOAA) [8]. Viabilidade de A2780, as células SKOV3 e OV202, tratados com diferentes concentrações de AOAA durante 24 h foram avaliadas através do ensaio de MTS. A viabilidade celular diminuiu acentuadamente para 50% a -7 concentração AOAA mM com diminui ainda mais dependentes da dose até a uma concentração de ~ 10 mM para as células A2780 e SKOV3 enquanto em OV202 o efeito foi menos pronunciado (Fig. 1G). Estes dados sugerem que um valor-limite para a atividade CBS existe o que é necessário para sustentar a proliferação de células de cancro do ovário.
regulação negativa do Níveis CBS Altera antioxidante, Triggers apoptose Cascades e aumenta a sensibilidade da droga
A saída de CBS reacções inibida na célula pode ser, a) uma acumulação de Hcy b) diminuição H
2S e c) diminuição da cistationina, o precursor de GSH. Portanto, testado pela primeira vez, se Hcy era um fator causal para a proliferação diminuída (Fig. 2A, B). Nós completou o meio de cultura com concentrações crescentes de Hcy e, em seguida, determinada viabilidade da OSE e as células de câncer de ovário (SKOV3-ip e A2780) utilizando o ensaio MTS. O aumento dos níveis de Hcy não teve impacto sobre a viabilidade de qualquer das células testadas, assim, indicando que a diminuição dos níveis de H
2S ou cistationina foram provavelmente responsáveis pela proliferação reduzida (Fig. 2B). Além disso, não foram observadas diferenças significativas nos níveis de homocisteína celulares como medido por espectrometria de massa em cima CBS knockdown em células A2780, ainda excluir um papel para Hcy em causar reduziu a proliferação (Fig. 2A). No entanto, a falta de diferenças significativas nos níveis de homocisteína pode ser porque Hcy pode sofrer conversão rápida em metionina pela metionina sintetase ou pode ser utilizado por CSE para produzir H
2S mas não cistationina [31].
(A ) Variação dos níveis de homocisteína em lisados celulares de células A2780 tratada Sc-siRNA e CBS siRNA medidos por espectrometria de massa. (B) Experiência de sobredosagem Hcy para demonstrar o efeito de Hcy (24 h de tratamento) sobre a proliferação de OSE, A2780 e células SKOV3-ip por ensaio de MTS. (C) H
2S níveis em OV202, SKOV3 e células A2780 após a inibição crónica com diferentes doses de AOAA durante 3 h. (D) Na
2S experimento resgate após knockdown da CBS em células A2780. As células foram tratadas com diferentes doses de Na
2S durante 24 h e a viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTS. (E) Mudança no nível total de glutationa 48 h pós-transfecção com células A2780 controle mexidos e CBS siRNA em OV202, SKOV3 e. experimento de resgate (F) GSH após knockdown da CBS em células A2780. As células foram tratadas com várias doses de GSH para 24 h e a viabilidade celular foi avaliada por ensaio de MTS.
próximo testado a contribuição de H
2S no apoio a proliferação de linhas celulares de cancro do ovário . Uma diminuição dependente da dose nos níveis intracelulares de H
2S foi observada após a inibição de 3H CBS com diferentes concentrações de AOAA (Fig. 2C). A diminuição global em H
níveis 2S de OV202 células foi menos pronunciada do que em A2780 e células SKOV3 que poderia ser devido à existência de H
2S via alternativa de síntese em OV202 células. Estes resultados indicam que a CBS desempenha um papel crítico em H
síntese 2S nestas células de cancro do ovário. No entanto, o papel de CSE não podia ser excluído, neste ponto, embora seja improvável pois a maioria das linhas celulares do cancro do ovário testadas aqui demonstrado uma baixa a expressão de CSE desprezível tanto para o mensageiro e ao nível da proteína. Para confirmar adicionalmente o papel de H
2S nós completada o meio de cultura com concentrações crescentes de um H
2S doador, sulfureto de sódio (Na
2S) [(32, 33] em mexidos siRNA e CBS siARN tratada células A2780. de na 5 mM de
2S concentração foi observado um resgate ~ 20% na viabilidade celular (Fig. 2D). salvamento parcial da proliferação das células por H
2S em células CBS-silenciados sugere que outros para além de H vias
2S biossíntese, tais como GSH também pode desempenhar um papel importante. por isso, o próximo focada em decifrar um papel da GSH na proliferação de células de cancro do ovário. silenciamento CBS diminuíram significativamente os níveis totais de glutationa celular (GSH + GSSG) em células de cancro do ovário dramaticamente em comparação com as células de controlo (Fig. 2E). É importante notar, um resgate dependente da concentração de GSH da viabilidade celular foi observada em CBS silenciados células A2780, com resgate completo a uma concentração de 2 mM, durante 24 h (Fig. 2F). ao mesmo tempo aumentam de ROS celular foram observados níveis tal como determinado por H
2carboxy ensaio de fluorescência de DCF em células A2780 CBS-silenciados (Fig. 3A) o que corrobora com a queda nos níveis de glutationa intracelular total, em células CBS-silenciados. Estes resultados sugerem que o efeito mais significativo de silenciamento CBS em células cancerosas é a inibição da maquinaria celular antioxidante. A este respeito, de duas outras moléculas, p53 e NF-kB têm sido mostrados para ser notavelmente redox-sensíveis [34] – [38]. Na verdade, silenciando CBS em células A2780 induzida expressão de p53 e diminuição da expressão do
RelA
/p65 subunidade da NF-kB (Fig. 3B). Em conformidade, a activação de NF-kB também foi inibida em cerca de 50% em CBS silenciados células A2780, conforme determinado por um ensaio de luciferase do promotor tendo múltiplos de NF-kB (p65 /p50) sítios de ligação (Fig. 3C). No entanto, um papel mais directo para a CBS além ROS aumentada em causar diminuição da activação de NF-kB também é possível. Desde glutationa intracelular e ROS foram notavelmente afetado em CBS células silenciados, nós próxima determinado se combinação com cisplatina aumentaria a eficácia terapêutica [39]. De facto o tratamento de células A2780 com cisplatina diminuiu a
valor de IC50 de 13,1 uM em células transfectadas de ARNsi de controlo para 7,9 M em células transfectadas CBS ARNip conforme determinado pelo ensaio de MTS, 24 h pós-tratamento com cisplatina (Fig. 3D). Estes dados indicam que a CBS, agindo através de glutationa e H
2S pode fornecer uma grande vantagem de sobrevivência às células cancerosas contra insulto citotóxica.
(A) Efeito da CBS knockdown (48 h pós-transfecção) sobre o total ROS nível determinado pelo ensaio de DCF e quantificado por citometria de fluxo. de dados (B) Immunoblotting exemplificar o efeito de silenciamento CBS na expressão de p53 e p65 de NF-kB em células A2780. β-actina serve como controlo de carregamento. (C) Ensaio de repórter de luciferase que mostra o efeito do knockdown CBS sobre a actividade de NF-kB em células A2780 transfectadas com luciferase do pirilampo com sítio de ligação múltipla de NF-kB e mexidos ARNsi de controlo ou ARNsi CBS.
em peso
-renilla luciferase foi transfectado para normalizar a atividade da luciferase do pirilampo. (D) CBS silenciamento aumenta a actividade da cisplatina em células A2780. O (•) e (О) mostra o efeito da cisplatina no controlo scrambled siRNA e CBS siARN células tratadas. A viabilidade das células foi determinado após o tratamento com doses crescentes de cisplatina durante 24 h através de ensaio de MTS e a viabilidade celular foi expressa como uma razão percentual de células tratadas com os controlos não tratados. O
50 valores IC foram obtidos por análise de regressão não-linear.
Silenciando CBS Reduz respiração mitocondrial e inibe a ATP síntese