Abstract

Função normal de classe antígeno leucocitário humano I (HLA-I) e maquinaria de processamento de antigénios de proteínas (APM) é necessária para T anti-tumor ou imunidade antiviral, ao passo que a sobrevivência do tumor indica uma falha do hospedeiro em vigilância imunológica associada com a disfunção na apresentação de antigénio, principalmente devido à desregulação em HLA mediada por células expressão ou função -I e APM. A regulação pós-transcricional de HLA-I e expressão APM pode associar-se com modificações epigenéticas no desenvolvimento do câncer que não foi descrito até agora. Aqui demonstramos que o desenvolvimento de neoplasia intra-epitelial cervical (CIN) e carcinoma de células escamosas do colo do útero (CSCC) em mulheres uigures foi acompanhada com a perda parcial ou total da expressão da proteína do HLA-I, SS2-M e os componentes de APM, incluindo o transportador associadas com o processamento do antigénio (TAP1 /2), proteína baixa massa molecular (LMP2, LMP7), retículo endoplasmático aminopeptidase 1 (ERAP1), moléculas chaperonas incluem calreticulina (CLR), calnexin (CNX) e ERp57, e isso foi provado novamente por análise de transcrição dos mesmos genes em adição aos três genes HLA-a, B e C que codifica para HLA-I. Por abordagem seqüenciamento bissulfito, identificamos alvo ilhas CpG metilado na região promotora do gene da TAP1, TAP2, LMP7, tapasina e ERp57 em células de carcinoma do colo do útero. Uma análise mais aprofundada de metilação de CpG local específico destes genes em casos de CIN CSCC e demonstrou uma correlação inversa da ilha CpG alterada metilação de TAP1, LMP7 e ERp57 com alterações na expressão da proteína. Além disso, o promotor de metilação desses genes foi significativamente maior nos casos positivos para o vírus do papiloma humano 16 (HPV 16) do que negativas. Nossos resultados sugerem que modificações epigenéticas são responsáveis ​​pela expressão aberrante de determinados genes HLA-I e APM, e pode ajudar a compreender os mecanismos não reveladas de fuga tumor da vigilância imunológica na carcinogênese cervical

Citation:. Hasim A, Abudula H, Aimiduo R, Ma JQ, Jiao Z, Akula L, et ai. (2012) pós-transcricional e regulação epigenética do Antigen Processing Machinery (APM) Componentes e HLA-I em cancros cervicais de Uighur Mulheres. PLoS ONE 7 (9): e44952. doi: 10.1371 /journal.pone.0044952

editor: Torbjörn Ramqvist, Karolinska Institutet, na Suécia

Recebido: 20 Janeiro, 2012; Aceito: 14 de agosto de 2012; Publicado: 14 de Setembro 2012 |

Direitos de autor: © Hasim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada com financiamento do Xinjiang Uighur Autónoma Fundo Região (2009211B14) e National Natural Science Foundation da China (81.060.164). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

A formação e sobrevivência de uma célula de tumor é um sinal de fuga imunológico bem sucedido e uma falha na vigilância imune do hospedeiro e eliminação. função normal de leucócitos humanos classe antígeno I (HLA-I) e máquinas de processamento de antigénio (APM) é um pré-requisito para as respostas imune inata e adaptativa mediada por células T contra a infecção viral ou carcinogênese celular [1] – [3]. HLA-I é um actor central e trabalha em conjunto com os membros de APM na montagem de carga, e apresentar o péptido antigénico endógena, bem como a regulação da imunidade celular e humoral [4] – [5]. Deste modo, a eliminação das células tumorais pelo sistema imunológico depende muito da expressão de AFM e HLA-I.

Nos últimos anos, foram feitos progressos na compreensão de como os péptidos apresentados por moléculas HLA-I. Em particular, sabe-se que as proteases estão envolvidas e como vias intracelulares influenciar apresentações de antigénio em células apresentadoras de antigénios profissionais e em vários tipos de doença maligna [6] – [8]. O APM da célula é um sistema complexo de proteínas interactuantes, incluindo subunidades de proteassoma, proteínas de baixo peso molecular em massa 2 e 7 (LMP2 e LMP7), transportadores associados ao processamento do antigénio 1 e 2 (TAP1 e TAP2), retículo endoplasmático aminopeptidase 1 (ERAP1), e as proteínas chaperonas ER calnexina, calreticulina, e tapasina. Além disso, a oxidorredutase tiol ERp57 é responsável pela apresentação de HLA-I péptido complexos sobre a superfície da célula e é crucial para o reconhecimento de células infectadas por vírus ou malignamente transformados, manutenção da auto-tolerância, e vigilância de tumores recentemente resultantes pelo sistema imune [ ,,,0],9]. Regulação negativa de componentes I e HLA-APM tem sido observada em muitos tumores e está intimamente associada com immunoevasion tumoral, crescimento e capacidade metastática [6] – [8]. Os mecanismos moleculares subjacentes ao nível relativamente baixo de transcrição de HLA-I e componentes de APM em células de cancro são largamente não explicada. Epigenetic modificações do genoma humano, tais como a metilação do DNA aberrante, representam tumorais genética eventos que são funcionalmente equivalentes a alterações genéticas. Regulação negativa de HLA-I expressão causada pela hipermetilação dos genes HLA-I tem sido documentada em carcinoma do esófago de células escamosas, carcinoma do cólon, e linhas celulares de melanoma, e isso pode ser revertido após tratamento com inibidores da DNA metiltransferase [10] – [11].

o papilomavírus humano (HPV) desempenha um papel central na patogénese de neoplasia intra-epitelial cervical (CIN) e cancro cervical com a infecção pelo HPV considerado como uma condição necessária, mas nem sempre é suficiente, causar [12]. Desenvolvimento de cancro cervical humano sem o envolvimento de um HPV específica é excepcional, e é amplamente aceito que, além de infecção pelo HPV, outros co-fatores, incluindo hormônios endógenos, fatores genéticos como HLA-I, e outros fatores relacionados à resposta imune do hospedeiro , pode ter um papel importante no desenvolvimento de lesões cervicais [13].

o câncer cervical em uigur foi ocorreu com alta morbidade e mortalidade mulheres na região de Xinjiang e considerada como uma doença de alta incidência da região na China [14]. infecção pelo HPV se acredita ser a causa principal de desenvolvimento de cancro do colo do útero, e a infecção do vírus, especialmente os tipos de HPV de alto risco é detectável em mulheres uigures com cancro do colo do útero a uma taxa comparável com outras populações, dentro e fora da China [15] . Nossos estudos anteriores mostraram que a tendência da taxa de perda de expressão da proteína HLA-I foi comparável para ambas as mulheres de grupos étnicos uigur e han em desenvolvimento do câncer cervical, mas a taxa de perda total de HLA-I em amostras de carcinoma de células escamosas do colo do útero (CSCC) e suas lesões precursoras (CIN II ou III) foi maior nas mulheres uigures (27% e 53%, respectivamente) do que nas mulheres Han (18% e 37%, respectivamente) [16]. Parece que as diferenças étnicas pode ter, em certa medida, influência sobre o desenvolvimento do tumor devido às diferentes antecedentes genéticos, hábitos de vida ou ambiente geográfico. Portanto, considerando-se que a expressão aberrante de superfície de HLA-I no cancro cervical associado com a infecção por HPV16 de alto risco frequentemente causada pela ausência de APM [17] – [18], pode-se perguntar se modificações epigenética que modulam a expressão de superfície de HLA- I directa ou indirectamente, ao silenciar ou inactivação dos genes componentes APM e levar ao desenvolvimento de câncer cervical em mulheres uigures.

neste estudo, nós nos concentramos em 10 genes candidatos pertencem ao HLA-I ea família APM, analisaram a associação de desenvolvimento de câncer com a expressão do gene alterado em diferentes níveis, incluindo a metilação do gene promotor, transcrição e expressão da proteína. Estes dados fornecem uma visão sobre mecanismos desconhecidos da carcinogénese do colo do útero em relação ao HLA-I e Regulação da Expressão APM e podem fornecer com perfil de marcador molecular para o diagnóstico precoce baseia-se na detecção de modificações epigenética e expressão destes genes. Além disso, este estudo permite uma maior compreensão do impacto do HLA-I mediada apresentação de antígenos na imunidade ou anormalidades antiviral ou anti-tumor causado por, ou que conduza a, carcinogênese cervical.

Materiais e Métodos

características clínicas e amostras de tecidos

Fresh ou e amostras de tecido do colo do útero embebidos em parafina foram coletadas de mulheres uigures com carcinoma cervical de células escamosas (CSCC) e neoplasia intra-epitelial cervical (CIN) fixado em formol, ou sem doenças do colo do útero , mas tratada por histerectomia. Todos os pacientes com câncer cervical referidos entre junho de 2009 e março de 2010 por causa de câncer cervical foram convidados a participar de nosso estudo durante a sua primeira visita ao Departamento de Ginecologia do Hospital First Affiliated na Universidade Médica de Xinjiang. O consentimento informado foi obtido de todos os pacientes e controles que participaram deste estudo. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética do nosso hospital.

O exame ginecológico foi realizada em todos os doentes com cancro do colo do útero para o estadiamento de acordo com a Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia (FIGO critérios). 152 casos de, (FFPE) amostras de tecido embebidos em parafina fixadas em formalina foram obtidos a partir do arquivo de amostra de tecido do departamento patológico após exame de lâminas de arquivamento por patologistas experientes. As amostras FFPE (ou tecidos cervicais congelados frescos descritos abaixo) foram inicialmente recolhidos durante a visita inicial ao ambulatório ou pelo exame ginecológico ou após tratamento cirúrgico sob anestesia geral. Dos pacientes com CSCC incluídos neste estudo, foi de 29 FIGO estádio IIB, 25 FIGO estágio IIIB, 9 FIGO estádio IVB. Entre eles, 28 casos foram patologicamente caracterizada como bem diferenciado, 19 moderadamente diferenciado e 16 tumores pouco diferenciados. Metástases linfonodais foi documentada por 31 pacientes com tumor. Um total de 64 pacientes com NIC foram selecionados para este estudo, incluindo 33 casos com CIN I-II e 31 com NIC III. A idade média dos pacientes com câncer cervical foi de 49,5 anos (variação de QI 29-67 anos). casos de controle (n = 25) foram obtidas de pacientes sem história de lesões cervicais ou qualquer forma de câncer e planejado para passar por uma histerectomia por motivos não-malignas durante o mesmo período. As indicações para a histerectomia foram miomas, Prolaps úteros ou adenomiose ou principalmente uma combinação de miomas com Prolaps úteros.

Além disso, 55 biópsias congeladas, incluindo 20 casos de CIN, 20 CSCC e 15 casos de controlo, foram recolhidos de acordo com a os critérios acima descritos, para a detecção da transcrição de genes por semi-quantitativa da reacção de transcrição reversa em cadeia da polimerase (RT-PCR).

Estudos imuno-histoquímica

imuno-histoquímica (IHC) coloração foi realizada com primários anticorpos que reconhecem proteínas alvo e kits de IHC contendo anticorpos secundários marcados com biotina. a classe de mAb de rato HLA I da cadeia pesada (HC-10,1:300; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA) foi reconhecido como SS2-m-livre [19]. O anticorpo policlonal de coelho anti-B2-M-anticorpo foi adquirido a partir de (1:100; Jingtian Xangai, Biotecnologia, China),, LMP2 e LMP7 anticorpo TAP1 e TAP2 anticorpo (1:300, Santa Cruz Biotechnology, respectivamente) (1:100 ; Abcam, Cambridge, MA, EUA, respectivamente), anticorpo ERAP1 (1:200; Abcam), anticorpo ERp57 (1:300, Santa Cruz Biotechnology), calnexin e anticorpo calreticulina (1:50, Xangai Jingtian, Biotecnologia, China, respectivamente), e tapasina anticorpo (1:300, Santa Cruz Biotechnology). Resumidamente, secções de 3 um de espessura foram cortadas a partir dos blocos de tecido embebidos em parafina. Depois de ser desparafinados em xileno e re-hidratadas em álcool e água destilada, o antigénio foi recuperado por meio de aquecimento no forno de microondas durante 15 min a 95 ° C em tampão de EDTA (pH 8,0). Após arrefecimento e lavagem em água destilada, a actividade da peroxidase endógena foi bloqueada por secções incubação durante 15 min em 3% H

2O

2, seguido por lavagem em PBS 0,01 M (pH 7,4) durante 10 min. As amostras foram pré-incubadas com uma solução de bloqueio de proteína durante 10 minutos e as secções foram incubadas a 4 ° C durante a noite numa câmara húmida com os anticorpos indicados, as lâminas foram lavadas três vezes em PBS e depois incubadas com um anticorpo secundário biotinilado (Biotecnologia Zhong Shan Goldenbridge Co. Ltd., China) durante 15 min à temperatura ambiente. Os produtos da reacção foram visualizados com diaminobenzidina (DAB Kit; Zhongshan Goldenbridge Biotechnology). PBS foi usado em lugar do anticorpo primário como um controlo negativo e as lâminas foram contrastadas com hematoxilina, desidratadas, e avaliadas sob a luz do microscópio.

A percentagem e a intensidade de células de tumor coradas positivamente em cada lesão foi investigada por dois patologistas que não tinham conhecimento das características dos pacientes. Um número consenso foi alcançado para cada amostra de tumor entre os dois investigadores. Os resultados foram classificados numa escala de 0 a 3 pela percentagem e a intensidade de células positivas entre as células tumorais. A percentagem de células positivas foi pontuada como 0 para ≤10%, 1 para 11-25%, 26-50% para 2, 3 para a 51-75%, para 4% ≥76. A intensidade da coloração é como se segue: 0 indica ausência de coloração, 1 indica coloração fraca, 2 indica coloração moderada, e 3 indica uma coloração intensa. A soma de ambas as pontuações foi usada para identificar três categorias de expressão: expressão normal (contagem total de 7-8), a perda parcial da expressão (3-6), e a perda total da expressão (0-2). IHC demonstraram coloração forte expressão de HLA-I no tecido do estroma e células inflamatórias, proporcionando assim um controlo positivo interno, tal como sugerido por um estudo prévio que se infiltram no tumor [20].

Extração de RNA e RT-semi-quantitativa PCR

o ARN total foi extraído dos tecidos do paciente, usando Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) tal como recomendado pelo fabricante. O ARNm (1 ug) foi submetido a transcrição inversa em ADNc com RevertAid (MBI Fermentas, Burlington, Ontário, Canadá) a 42 ° C durante 60 min. O ADNc (20 ng) foi amplificada por PCR numa mistura de 25 l sob as seguintes condições: 95 ° C durante 1 min, seguido de 25 ou 30 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 30 seg, emparelhamento a 60 ° C durante 30 seg, e síntese a 68 ° C durante 1 min, e uma extensão final a 68 ° C durante 10 min. Os produtos de PCR foram separados num gel de agarose a 4%, visualizado com I GoldView (Pequim Solarbio Co., Pequim, China) para a detecção ultravioleta e quantificação por Gel Imaging System e software profissional (XR GelDoc, Bio-Rad Laboratories, CA, EUA) . Cada análise foi repetida pelo menos duas vezes para garantir reproduzida ARNm, o ARNm β-actina foi utilizado como um controlo de carga interno e normalização. Frente e verso, pares de primers e seus produtos estão listadas na Tabela S1

Linhas Celulares

As células de carcinoma humanas SiHa foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, EUA). . As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado com 10% de FCS, L-glutamina, e antibióticos (Sigma-Aldrich).

A extracção de ADN, bissulfito de tratamento, e bissulfito-sequenciação de PCR (BSP)

o DNA foi extraído a partir de células SiHa, usando um kit de extracção de ADN (Qiagen, Valencia, CA, EUA), e ADN genómico (500 ng) foi bissulfito-modificada utilizando o kit EZ metilação ouro (Zymo Research, Orange, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante [21]. CpG primers específicos fragmento ilha foram projetados pela digitalização regiões promotoras de genes usando software especializado Metil Primer Express (empresa ABI) com base em informações genéticas obtidas a partir do banco de dados GenBank. Bissulfito de ADN tratado a partir de células do cancro do colo do útero foi amplificado por PCR. Os iniciadores utilizados para amplificações posteriores estão listados na Tabela S2. modificação com bissulfito completa foi confirmada por análise da sequência. BSP amplificações foram realizadas em misturas reaccionais de 50 ul contendo 2 ul de ADN modificado com bissulfito genómico, dNTP 2 uL, 1,2 ul iniciadores, 2 ul de MgCl

2, 20 nM de sulfato de amónio,

. 75 nM de Tris-HCl (pH 8,3), e 3 U de Taq ADN polimerase. O esquema de PCR touch-down foi aplicado a amplificar com as seguintes condições de ciclo: 95 ° C desnaturação durante 15 min, 95 ° C durante 20 s, as temperaturas de recozimento que variam de 62 ° C a 56 ° C durante 1 min, extensão a 72 ° C durante 1 min durante 45 ciclos, e incubação final a 72 ° C durante 7 min. As temperaturas de recozimento foram como se segue: HLA-B: 60 ° C, TAP1:62 ° C, TAP2:56 ° C, LMP: 60 ° C, LMP2:58 ° C, tapasina: 58 ° C, ERAP1:62 ° C, e ERP57:56 ° C. A PCR foi seguida de clonagem em vectores de sequenciação e para identificar os locais de CpG relacionadas com a metilação do promotor do gene.

Isolamento de ADN genómico e ADN quantitativa metilação Análise

O ADN genómico foi extraído usando um kit QIAamp DNA Mini ( QIAGEN, Valencia, CA). Para a detecção quantitativa do ADN metilado, MassARRAY (Sequenom, San Diego, CA, EUA) foi utilizado para analisar o ADN de tecido cervical para o teor CpG. gene alvo específico pares de iniciadores foram utilizados para comparar os níveis de metilação de fragmentos alvo e locais CpG entre diferentes amostras de acordo com as instruções do fabricante e como descrito anteriormente [22] – [23]. As regiões analisadas e locais de CpG de promotores de genes candidatos são mostrados na Tabela S3. Os iniciadores utilizados foram projetados de acordo com a Sequenom Padrão EpiPanel (Sequenom, versão de Novembro de 2007 e Tabela S4). A amplificação por PCR foi realizada com os seguintes parâmetros: a mistura de PCR continha 10 ng de ADN tratado com bissulfito, os dNTP 200 mM, 0,2 U de ‘Hot Start Taq DNA polimerase (Qiagen), e 0,2 mM de iniciadores directos e inversos em um volume total de 5 ul. Os ciclos incluiu um arranque a quente a 94 ° C durante 15 min, seguido de desnaturação a 94 ° C durante 20 seg, emparelhamento a 56 ° C durante 30 seg, extensão a 72 ° C durante 1 min (45 ciclos), com uma última de incubação a 72 ° C durante 3 min. Não incorporados dNTPs foram desfosforilado pela adição de 2 ml de pré-mistura incluindo 0,3 L de fosfato alcalina de camarão (SAP; Sequenom). A mistura de reacção foi incubada a 37 ° C durante 40 min e, em seguida, a SAP foi inactivado pelo calor durante 5 minutos a 85 ° C. Após o tratamento SAP, 2 mL do produto de PCR foi utilizado como um molde para

In vitro

transcrição e RNase A clivagem foi utilizado para a reacção reversa, seguindo as instruções do fabricante (Sequenom). As amostras foram acondicionadas e viu em um 384-pad Spectro-CHIP (Sequenom) usando um nanodispenser MassARRAY (Samsung, Irvine, CA, EUA), seguido pela aquisição de espectro em um compacto espectrômetro de massa MALDI-TOF analisador MassARRAY (Sequenom). As análises de metilação foram realizadas utilizando a aplicação EpiTYPER (Sequenom) para gerar resultados quantitativos para cada local de CpG ou um agregado de vários sites CpG.

Determinação do HPV genótipos

DNA genômico foi extraído de tecidos cervicais utilizando um DNA QIAamp Mini Kit? (Qiagen, Dusseldorf, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. A concentração e a pureza do ADN foram determinadas por absorvência a 260 e 280 nm. genótipos de HPV foram detectadas utilizando o Papilomavírus Humano Genotipagem Diagnóstico Kit (yjkuang Genetel Pharmaceuticals, Shenzhen, China) e analisados ​​por meio de genótipos de HPV DNA sistema de leitor de microarray (HPV-GenoCam-9600, yjkuang Genetel Pharmaceuticals, Shenzhen, China)), como descrito [24]. Resumidamente, o ADN de HPV foi extraído e amplificado por PCR utilizando os seguintes parâmetros: desnaturação a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 30 segundos, 52 ° C durante 45 seg, e 65 ° C durante 90 seg. No final do último ciclo, a mistura foi incubada a 65 ° C durante 5 min. O gene chip foi preparado, produtos de PCR hibridizado, e visualizados.

Análises Estatísticas

Todas as análises estatísticas foram realizadas com o pacote de software SPSS versão 17. Todos os valores de P foram em frente e verso eo nível de significância foi de

P Art 0,05. teste de Mann-Whitney foram usados ​​para testar as variáveis ​​contínuas para diferenças nas pontuações de coloração imuno-histoquímica entre tumores e tecidos normais para os componentes HLA-I e APM. O teste exato de Fisher foi utilizado para avaliação das associações com parâmetros patológicos clínicos. dados de metilação do DNA quantitativos derivados de MassARRAY foram tratados como variáveis ​​contínuas e medições em falta foram imputados em regressão multivariada análises usando amostras com reposição para os valores nonmissing (imputações individuais). associações lineares entre 2 variáveis ​​contínuas foram quantificados pelo coeficiente de correlação de Pearson.

Resultados

APM componente e HLA-I Expressão em lesões cervicais

Todos os anticorpos foram testados em formalina fixo, embebido em parafina, tecidos cervicais normais, CIN e CSCC. os padrões de coloração representativo para a HLA de classe I cadeias pesadas, os beta2-M e APM componentes são mostrados nas Figs. A Figura 1 e S1. Como mostrado na Figura 1, a coloração de HLA de classe I, as cadeias pesadas e SS2-m foram localizados nas membranas das células do epitélio cervical e células intersticiais, ao passo que a coloração componentes APM foram principalmente localizada no citoplasma do epitélio cervical. anticorpos anti-SS2 m anti- HLA de classe I e mostraram forte coloração das membranas das células no tecido cervical normal, enquanto que um perfil de expressão altamente variável em amostras de tecido e CIN cSCC, variando de uma perda parcial para a perda total de expressão, mas diminuição da expressão, a expressão normal. Expressão de HLA de classe I cadeias pesadas, os componentes beta2-M e APM estão resumidos na Tabela 1.

A-C. Os padrões de coloração de HLA-I, m e SS2-ERAP1, respectivamente. (Outros componentes APM TAP1, TAP2, LMP2, LMP7, calnexin, calreticulina, ERp57 e coloração tapasina mostrado na Figura S1), Painéis A1-C1 retratam tecido normal colo uterino com a expressão da proteína normal. Painéis A2-C2 mostram a neoplasia intraepitelial cervical, com perda parcial da expressão da proteína. Painéis A3-C3 mostrar carcinoma cervical com perda de fraca ou total de expressão da proteína.

Dos 64 casos CIN ea CSCC 63 casos incluídos neste estudo (Tabela I e Figura 2), o nível de componentes de HLA de classe I e de APM a expressão da proteína foi alterada de expressão normal à perda parcial ou perda total, com o desenvolvimento do epitélio normal da cérvix uterina e para CIN CSCC. A perda total de expressão da proteína foi notável para a maioria dos membros do HLA de classe I e da família APM em CSCC em comparação com controles CIN ou normais, exceto para CNX e CRT. A perda parcial da expressão da proteína HLA-I, SS2-m, TAP1, TAP2, LMP2, LMP7, ERAP1, tapasina e ERp57 foi estatisticamente significativa para casos CIN, em comparação com controles normais.

Analisar as características clínico-patológicas ( grad tumor, estágio clínico e metástases linfonodais) com a expressão da proteína de HLA-I e componentes APM (TAP-1, TAP-2, LMP2, LMP7, tapasina, ERAP1, CNX, CRT e ERp57) em cancer.Results cervicais são representados como percentagem (%). superior histograma A1 show de componentes APM HLA-I e expressos em tumores bem diferenciados, A2 mostram expressa em moderada a tumor pouco diferenciado. B1 mostram expressa em ≤II um show do tumor e B2 expressa em ≥II B, C1 mostram expressa em metástases linfonodais tumor negativo e C2 mostram expressa em metástases linfonodais tumor positivo, respectivamente. *

P Art 0,05.

A associação entre a expressão de HLA de classe I, SS2-m, e componentes APM e as características clinicopatológicas foi investigada em lesões cSCC. Como pode ser visto na Figura 2A, houve uma correlação inversa com a regulação negativa de HLA-I, SS2-m TAP1, LMP7, e a expressão da proteína ERp57 e grau de diferenciação do tumor. Utilizando critérios de paragem FIGO, a expressão da proteína ERp57 foi significativamente menor nos tumores estágio inferior do que em fases mais elevadas (Figura 2B). Além disso, a regulação negativa de HLA-I, TAP1, LMP7, tapasina, CRT, e ERp57 teve uma correlação inversa com metástase axilar (Figura 2C). Ambas as correlações foram estatisticamente significativas (P 0,05). A regulação negativa da SS2-m, TAP1, TAP2, LMP7, ERAP1, tapasina e expressão da proteína ERp57 positivamente associada com a expressão HLA-I em lesões CIN, enquanto SS2-m, TAP1, TAP2, LMP2, LMP7, ERAP1, ERp57 e expressão tapasina positivamente associado com HLA-I nas lesões cancerosas. A regulação negativa de qualquer componente APM exceto calnexin e calreticulina foi significativamente associada com HLA de classe I sub-regulação CIN e grupo CSCC (P 0,05).

Para verificar ainda mais os resultados da análise de coloração imuno-histoquímica, detectamos a transcrição de componentes de APM de HLA de classe I e por semi-quantitativa por RT-PCR. O nível de expressão de HLA-A, -B e -C codifica para HLA-I foi mais baixa em ambos CIN e CSCC do que nos controlos (Figura 3). As transcrições de TAP-1/2 e LMP2 /7 eram difíceis de detectar, e nenhuma transcrição de tapasina e ERp57, em tecidos CIN e cSCC. No entanto, nenhuma diferença foi encontrada para CNX e CRT transcrição entre CIN ou CSCC e controles (Figura 4). Embora as amostras para análise IHC RT-PCR e foram de origem diferente, estes resultados sugerem que a tendência da regulação negativa da expressão do gene alvo, tanto a nível da transcrição e tradução foi comparável no desenvolvimento de cancro cervical, especialmente na patogénese das lesões precursoras.

M: 100-600 escadas bp marcador. Lanes 1 mostram tecido cervical normal, 2 e 3 mostra CIN, 4 mostra tecido CSCC. Os níveis de ARNm foram normalizados para a p-actina ARNm (D). A expressão falta mRNA de um único alelo de HLA-I irá afectar a expressão normal de superfície de moléculas HLA-I de acordo com a proteína detectada por IHQ.

Os níveis de expressão dos componentes APM (TAP-1, TAP-2, LMP2, LMP7, tapasina, ERAP1, CNX, CRT e ERp57) foram analisados ​​por Semi-RT-PCR quantitativo no tecido do colo uterino normal, CIN e CSCC. Em comparação com o controlo, CIN e CSCC, os níveis de ARNm foram normalizados para a p-actina ARNm. O histograma superior tem mostrado os níveis dos componentes de APM em expressão em tecido normal do colo uterino, CIN e CSCC. Os resultados de RT-PCR são representados como médias ± DP a partir de 15 controlos, 30 e 33 CIN CSCC respectivamente. *

P Art 0,05.

Perfis de metilação do gene da família de APM em um CSCC Linha celular

Devido à relação teórica entre a hipermetilação do promotor do gene como uma modificação epigenética com a regulação negativa da transcrição de genes, nós analisado o HLA-B, TAP1, TAP2, LMP2, LMP7, ERAP1, tapasina, e ERp57, devido à regulação negativa destes genes em lesões cancerosas ou precursores do colo do útero, para o estado de metilação de ilhas de CpG na região do promotor em células de carcinoma cervical SiHa pela abordagem bisulfite-sequenciação. Por amplificação de ilhas CpG-alvo identificados pelo software profissional com iniciadores de sequenciação bissulfato (BSP, figura 5) usando DNA genómico como modelo e, em seguida por clonagem e sequenciação, encontramos várias extensões de CpG site de metilação do TAP1, TAP2, LMP7, tapasina e ERp57 genes. No entanto, não foi detectado metilação para HLA-B, LMP2, e ERAP1. Todos os locais CpG metilados de genes candidatos são mostrados na Tabela S4, na qual o local de iniciadores foram apresentados em sublinhados, os locais alvo em itálico CpG e CpG metilados em negrito.

Cada verticais indicam um local individual CpG . posições sólida linha de primers BSP. Todos os primers BSP são projetados para cobrir o local de início da transcrição deve ser perto de transcrição começar site. Painéis AH retratam HLA-B, a TAP-1, TAP-2, LMP2, LMP7, tapasina, ERAP1 e ERp57.

DNA metilação em lesões cervicais e sua associação com a expressão do mRNA e Infecção HPV

por uma abordagem usando a plataforma Sequenom MassARRAY para a detecção quantitativa de DNAs metilados, descobrimos que o nível de metilação global alvo ilhas CpG de TAP1, LMP7 e genes ERp57 foi significativamente maior no DNA genômico de CSCC do que em qualquer CIN ou normal controles (

P

0,05), mas nenhuma diferença foi encontrada para TAP2 e tapasina (Tabela 2). O nível de metilação TAP1 foi significativamente mais elevada em ambos CIN e CSCC do que nos controlos (

P

= 0,015 e 0,001, respectivamente). De LMP7 e genes ERp57, o nível de metilação em CSCC, mas não em CIN, significativamente diferente do controlo (

P = 0,001

). Uma análise mais aprofundada do sítio CpG única metilação específica dentro TAP1, LMP7 e ERp57 indicou um aumento significativo do nível de metilação da maioria dos locais de CpG na Target ilhas CpG de TAP1, LMP7 e genes ERp57 em CSCC comparados aos controles, enquanto que sem significância estatística foi encontrada entre CIN eo controle (

P Art 0,05).

Uma análise mais aprofundada dos dados resultou da análise quantitativa de único site metilação CpG pela plataforma Sequenom MassARRAY, tem mostrou que gene TAP1 contém 23 locais CPG e o nível de metilação entre dois ou três locais CpG de CpG_1, CpG_2.3, CpG_4, CpG_16, CpG_19, CpG_20, CpG_21, CpG_22 e CpG_23 associados uns com os outros, mas não foi encontrada associação para o relação de metilação de outros locais de CpG. gene LMP7 contém 22 locais de CpG e o nível de metilação entre CpG_1, CpG_2, CpG_6, CpG_8, CpG_9, CpG_12, 13, 14, e CpG_20 CpG_22 associados uns com os outros. gene ERp57 contém 9 locais de CpG, em que CpG_1, CpG_2, CpG_5, CpG_6, CpG_7 têm significância entre grupos controle e câncer. Embora sem significância estatística foram encontrados da meta toda nível fragmento de metilação CpG de TAP2 entre três grupos, a análise dos dados resultou da análise quantitativa de TAP2 único site metilação CpG mostrou que não havia diferenças significativas no nível de metilação dos locais CpG_8 entre CSCC e controles, mas não foi encontrada associação para a relação entre a metilação de outros locais CpG (

P Art 0,05).

Além disso, a análise comparativa dos TAP1, LMP7 e ERp57 metilação com os níveis de expressão de proteínas e infecção HPV16 de alto risco mostrou uma correlação inversa da alteração ilha metilação CpG com as mudanças na expressão de proteínas de genes correspondentes. Além disso, o nível de metilação desses genes foi significativamente maior nos casos positivos para a infecção por HPV16 do que nos negativos (Tabelas 3 e 4).

Discussão

imunocompetência reduzida associada com a regulação negativa da expressão de HLA-I tem sido frequentemente relatado para pacientes com o aumento da invasão de tumores e metástases, o que implica que a anormalidade funcional de HLA-I na apresentação de antigénios celulares mais provavelmente ser um acontecimento chave no desenvolvimento e progressão do tumor [20], [ ,,,0],25] – [26]

neste estudo, foi investigada a associação de carcinogênese cervical e patogênese da suas lesões precursoras com a regulação aberrante de HLA-I e expressão APM em diferentes níveis, incluindo a metilação do promotor do gene, a transcrição. e a expressão da proteína.