Abstract

O uso de pequenos peptídeos ou bacteriocinas antimicrobianos, como a nisina, para tratar o cancro é uma nova abordagem que é uma grande promessa. A nisina exemplifica esta nova abordagem, pois ela tem sido utilizada de forma segura em seres humanos, durante muitos anos como um conservante de alimentos, e estudos laboratoriais recentes suportam o seu potencial anti-tumor no cancro da cabeça e pescoço. Anteriormente, mostramos que a nisina (2,5%, baixo teor) tem um potencial antitumoral em carcinoma de cabeça e pescoço de células escamosas (CECP)

in vitro

e

in vivo

. Os estudos atuais explorou uma variante que ocorre naturalmente da nisina (ZP nisina; 95%, índice elevado) para os seus efeitos antitumorais

in vitro

e

in vivo

. Nisina ZP induziu o maior nível de apoptose em células de CECP em comparação com baixo nisina conteúdo. CECP células tratadas com concentrações crescentes de nisina ZP exibiram aumento dos níveis de apoptose e diminuição dos níveis de proliferação celular, capacidade clonogénicas, e formação de esferas. A nisina ZP apoptose induzida através de uma via dependente de calpaina em células CECP mas não em queratinócitos humanos por via oral. Nisina ZP também induziu apoptose dependente da dose nas células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) com a diminuição concomitantes na formação de broto vascular

in vitro

e redução da densidade de microvasos intratumoral

in vivo

. Nisina ZP reduzida tumorigênese

in vivo tratamento a longo prazo com a sobrevivência estendida nisina ZP Comprar e. Além disso, os ratinhos tratados exibiram nisina histologia do órgão normal sem evidência de inflamação, fibrose ou necrose. Em resumo, exposições ZP nisina maiores efeitos anti-tumorais do que a baixa nisina conteúdo, e, portanto, tem o potencial de servir como uma terapêutica inovadora para HNSCC

Citation:. Kamarajan P, Hayami T, Matte B, Liu Y, Danciu T , Ramamoorthy A, et al. (2015) nisina ZP, uma bacteriocina e Alimentação conservante, inibe o cancro principal e Tumorigênese e prolonga a sobrevivência. PLoS ONE 10 (7): e0131008. doi: 10.1371 /journal.pone.0131008

editor: Hari K. Koul, Louisiana State University Health Sciences Center, United States |

Recebido: 10 de fevereiro de 2015; Aceito: 26 de maio de 2015; Publicação: 01 de julho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Kamarajan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão disponíveis dentro do papel e seu arquivo de Informações de Suporte

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pela Universidade de Michigan MCUBED Financiamento # U036798 para YK, FPW, e AR. BM foi apoiado pela CAPES brasileiros e CNPq patrocinado, programa Ciência sem Fronteiras. YL foi apoiado pelo Programa Scholars de Peking University School e Hospital de Estomatologia

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Head and carcinoma de células escamosas do pescoço (CECP) é a sexta maior causa de morte no mundo. Os pacientes diagnosticados com carcinoma epidermóide são tratados com cirurgia, radioterapia e quimioterapia. Dada a sua localização anatômica, HNSCC ressecção cirúrgica é muitas vezes destrutivo e, muitas vezes, a remoção completa da massa tumoral não é uma opção viável, muitas vezes tornando estes pacientes com doença incurável seguintes tratamentos com quimioradioterapia [1]. Há opções quimioterápicos limitadas para pacientes uma vez que sua doença não é mais passível de cura, e as taxas de sobrevida em 5 anos baixos para pacientes com CECP metastático não melhoraram em décadas [2,3]. Estes fatos enfatizam a urgência de melhorar as opções de tratamento para esses pacientes.

Alguns relatórios sugeriram que peptídeos antimicrobianos ou bacteriocinas têm efeitos citotóxicos contra células cancerosas [4-8]. Dada esta premissa interessante, nós exploramos as propriedades citotóxicas e antitumorais do peptídeo antimicrobiano, nisina, e descobriu que ele blocos HNSCC tumorigênese [9]. A nisina é um péptido policíclico ácido 34-amino antibacteriana que é produzido por fermentação da bactéria gram-positiva

Lactococcus lactis

. Muitos agentes antibacterianos são eficazes contra espécies bacterianas semelhantes; No entanto, a nisina tem efeitos de largo espectro, como também inibe as bactérias gram-negativas [10]. A nisina não é tóxico para os animais e é seguro para consumo humano [11]. Nisina foi aprovado para uso humano como conservante de alimentos pela Organização Mundial de Saúde (OMS) em 1969 e pela Food and Drug Administration (FDA) em 1988, e foi dada uma designação geral-considerado-as-seguro (GRAS) pelo FDA [12]. Estima-se que 0,94 a 2,24 mg de nisina são consumidos por pessoa por dia em os EUA [12]. Enquanto bacteriocinas, como a nisina, foram usados ​​ao longo de décadas na prevenção do crescimento de bactérias em alimentos, que apenas recentemente foram testados para a prevenção do crescimento ou indução de apoptose de células cancerosas. A apoptose ou morte celular programada é um processo natural que elimina as células indesejadas ou mais velhos. No entanto, as células cancerosas são resistentes a apoptose. Assim, existe um grande esforço para compreender os mecanismos que regulam a apoptose nestas células, de modo que os novos agentes podem ser desenvolvidos para induzir a apoptose das células cancerosas. Nisina pode servir nesta capacidade e desenvolvimento da nisina como uma terapêutica de câncer podem ser prontamente perseguido seguindo determinações de dosagem.

Recentemente, relatou que a nisina, pode servir como um romance terapêutica potencial para tratar HNSCC [9]. A nisina medeia a esses efeitos por induzir a apoptose preferencial, a paragem do ciclo celular, e reduzir a proliferação de células em células de CECP, em comparação com queratinócitos primários. Nisina também reduz HNSCC tumorigênese in vivo. Mecanicamente, nisina exerce esses efeitos em CECP, em parte, através do transporte de cátions regulador homólogo 1 (CHAC1), um regulador de transporte de cátions pró-apoptótica e através de um fluxo independente de CHAC1 concomitante de cálcio extracelular [9,13]. Estes resultados suportam a utilização de nisina como uma terapêutica potencialmente novo para HNSCC, e uma vez que a nisina é segura para consumo humano, como um conservante de alimentos, a sua tradução para um ambiente clínico pode ser facilitada.

nisina actua alterando a integridade da membrana celular e que formam poros de vida curta, mudando assim o potencial de membrana [14]. A nisina fica imersa na membrana da célula através das porções catiónicos de aminoácidos estendendo-se para um dos lados da molécula. Estas porções catiónicos interagir com as cabeças de fosfolípidos carregados negativamente, enquanto que a porção hidrofóbica da nisina interage com o núcleo de membrana [15]. O envolvimento da nisina com a membrana, portanto, medeia fosfolipídios reorganização e permite um influxo de íons [14,16]. Uma vez que as células CECP e queratinócitos primários diferem na sua composição de membrana lipídica e a função e resposta a fluxos de cálcio, a capacidade da nisina para alterar a composição potencial transmembrana e de membrana de células podem conduzir a efeitos diferenciais sobre estas células [17-22]. Com efeito, os nossos dados suportam esta premissa como a base para a morte celular por apoptose mediada por diferencial de nisina e a proliferação reduzida de células CECP comparação com queratinócitos primários [9].

Dado o papel da nisina como uma bacteriocina seguro para a conservação de alimentos, e o conhecimento de que outras bacteriocinas possuem propriedades pró-apoptóticos contra as células cancerosas, as nossas descobertas sobre os efeitos da nisina no HNSCC tumorigénese ajudar a proporcionar uma base para a nisina como um novo potencial terapêutico para HNSCC. Assim, o nosso foco no presente estudo foi estender este conhecimento de base. Anteriormente, foi utilizado uma formulação de 2,5% de nisina (baixo teor). Neste estudo, o nosso objectivo foi testar a eficácia de um 95% de nisina (elevado teor de) em células de carcinoma epidermóide apoptose e a proliferação in vitro e a tumorigénese in vivo. Especificamente, nós nos concentramos em seu potencial translacional examinando uma forma altamente pura, de qualidade alimentar da nisina para sua em efeitos a longo prazo vivo e. Para este fim, nós testamos duas que ocorrem naturalmente, altos variantes de conteúdo nisina, ZP nisina e AP nisina. Considerando a segurança de nisina para consumo humano e dada a sua in vitro e in vivo eficácia em CECP, nisina poderia ser desenvolvido como um novo câncer terapêutico para CECP.

Materiais e Métodos

Aprovação Institutional Review Board

Este estudo foi aprovado pelo e foi conduzido de acordo com as normas estabelecidas pelo conselho de revisão institucional e da comissão sobre o uso e tratamento dos animais na Universidade de Michigan.

cultura celular

Quatro linhas de células de carcinoma epidermóide humanos foram utilizados para estes estudos. autenticação de linha de células de CECP e origem foi fornecido por suas fontes e publicou extensivamente. As linhas de células de carcinoma epidermóide humanos, UM-SCC-17B (supraglote /tecidos moles do pescoço) e UM-SCC-14A (assoalho da boca) foram fornecidos pelo Dr. Thomas Carey (Professor, Universidade de Michigan, MI) [23]. A linha de células CEC oral HSC-3 (língua) foi fornecido pelo Dr. Randall Kramer (Professor, Universidade da Califórnia, San Francisco, CA) [24]. A linha de células SCC oral, CEB-3 (língua) foi fornecido pelo Dr. Mark Lingen (Professor, Universidade de Chicago). CECP células foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino, 1% de penicilina e 1% de estreptomicina. As células normais humanas endoteliais da veia umbilical (HUVECs), e meios de comunicação e suplementos (Kits EGM-2 de bala), que acompanha de cultura de células foram obtidas a partir de Lonza (Allendale, NJ). VEGF165 recombinante humano foi obtido da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) e Matrix Matrigel foi obtido a partir de BD Biosciences (San José, CA). As HUVECs foram cultivadas em EGM-2, testando a 37 ° C em 5% de CO

2.

A nisina

nisina A e nisina Z são duas variantes de ocorrência natural de nisina que são produzidos por fermentação de

Lactococcus lactis

e diferem por um único resíduo de aminoácido na posição 27; histidina em nisina A e nisina asparagina em Z [25]. formas elevado teor destas duas variantes, ZP nisina e AP nisina (teor de 95% /ultrapura;% peso /peso; potência hidratado ≥38,000 UI /mg) foram adquiridos a Handary (Bruxelas, Bélgica) e baixo teor de nisina A (2,5% conteúdo em cloreto de equilíbrio de sódio e sólidos de leite desnaturado; potência ≥1,000,000 por UI /g) foi adquirido a partir de Sigma-Aldrich (N5764). A nisina e ZP AP e baixo teor de nisina foram reconstituídos em água e usada para todas as experiências.

A proliferação celular e ensaios de formação de colónias

Para determinar o efeito da nisina sobre a proliferação celular, a célula CyQUANT NF Ensaio de proliferação Kit foi utilizada de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen /Life Technologies, Grand Island, NY). Para os ensaios de formação de colónias, 2000 células foram semeadas numa placa de 6 poços. Após incubação durante a noite, as células foram tratadas com diferentes concentrações de nisina ZP durante 48 horas. Após o tratamento, o meio fresco foi adicionado a cada 2 dias durante um período de 10 dias. As colónias foram depois coradas com 0,5% de violeta de cristal e as colónias que continham 50 células foram contadas. As experiências foram repetidas em triplicado.

Orasphere Ensaio

ensaios Sphere foram usadas para avaliar o crescimento independente de ancoragem, uma propriedade pensado para contribuir para o potencial metastático. oraspheres CECP (UM-SCC-17-B) foram preparados como anteriormente relatado [26-29]. Em resumo, as células que sobrevivem formulário de retirada agregados ou oraspheres multicelulares ancoragem. Oraspheres foram desenvolvidos através da manutenção de células em condições de suspensão de poli (metacrilato de 2-hidroxietilo) (poli-HEMA) placas revestidas (7,5 mg /mL em etanol a 95%, Sigma-Aldrich) durante 36 horas. Um orasphere é definido como um agregado de células que é, pelo menos, 50 um de diâmetro. A área total ocupada por oraspheres em cada poço foi quantificado para cada condição de tratamento utilizando o software de imagem NIS Elements BR4.13.04. As experiências foram realizadas em triplicado. A nisina foi adicionado a cada poço na altura do plaqueamento de células.

Apoptose Os ensaios

Para determinar os efeitos de três diferentes formas de nisina na apoptose de células de carcinoma epidermóide três ensaios diferentes foram realizados. A apoptose foi avaliada em células de nisina tratada usando um método direto de coloração, um ensaio de fluxo baseado em citometria, e uma abordagem western blot para avaliar proteínas apoptóticos sinalização conhecidos

apoptose:. Coloração e Microscopia

Ethidium e brometo de laranja de acridina (EB /aO) coloração foi utilizado para medir a apoptose como descrito anteriormente [30]. Para estes ensaios, as células foram plaqueadas em placas de 96 poços a 2 x 10

4 células /cm

2, e depois de 24 horas, tratados com várias concentrações de nisina (0, 100, 200, 400 e 800 ug /mL), durante 24 horas. As células foram então coradas com uma mancha EB /AO. EB foi obtido a partir de Bio-Rad (Berkeley, CA) e AO foi obtido a partir de Acros Organics (Geel, Bélgica). O reagente corante EB /AO foi composta de 100 ug /ml de brometo de etídio e 100 ug /ml de laranja de acridina em PBS. O corante EB /AO foi adicionada a cada poço, removido, e, em seguida, as imagens de células coradas foram capturadas usando um microscópio equipado com um sistema de imagens digitais (Eclipse 50i Nikon, Melville, NY). As células foram contadas e, com base na sua cor, foram classificados como vital, apoptótica ou necrótica. AO permeia todas as células e faz com que os núcleos aparecem em verde. EB só é tomada pelas células quando a integridade da membrana citoplasmática é perdida, e cora os núcleos, de forma que aparece vermelho. Assim, as células início apoptóticos aparecem em verde com os pontos verdes brilhantes nos núcleos devido à condensação da cromatina e fragmentação nuclear. Final de células em apoptose aparecem laranja (combinação de cores verde e vermelho) com a condensação da cromatina mais significativo e fragmentação nuclear. células necróticas aparecer de laranja, mas a sua morfologia nuclear que se assemelha de células viáveis, assim, há uma ausência de condensação da cromatina. A percentagem de células em cada categoria foi determinada pela contagem de um mínimo de 100 células. As experiências foram realizadas em triplicado

A apoptose:. A citometria de fluxo

A percentagem de células apoptóticas induzidas por tratamento nisina foi determinado por citometria de fluxo. Resumidamente, as células foram destacadas por incubação com tampão de dissociação isento de enzima (Invitrogen), peletizadas por centrifugação, e coradas com Anexina V (BD Pharmingen) para análise por citometria de fluxo (classificador FACSDiVa celular, Becton Dickinson).

apoptose: Western Blotting

para avaliar os efeitos da ZP nisina na expressão de proteínas pró-apoptóticas em células CECP, realizada análises de Western blot de células de UM-SCC-17B que foram tratados com nisina ZP durante 18 horas . Um inibidor da calpaína também foi examinado, neste contexto, para a sua capacidade para inverter os efeitos apoptóticos induzidos pela nisina ZP; ou seja, bloqueando a clivagem PARP. O inibidor de calpaina foi adquirido de Sigma-Aldrich (A6185, St. Louis, MO), reconstituída em água, e utilizada a uma concentração de 500 nM. Após vários tratamentos, as células foram recolhidas, lavadas uma vez com solução salina tamponada com fosfato e lisadas durante 30 minutos em gelo, enquanto no ensaio de radioimmunoprecipitatation (RIPA) tampão (R0278, Sigma-Aldrich) que continha uma mistura de inibidores de protease 1% (P8340, Sigma- Aldrich). Os lisados ​​foram ajustados para a concentração de proteína com o kit de ensaio de proteína BCA (Bio-Rad, Berkeley, CA). Os lisados ​​de proteínas foram resolvidas por electroforese de sódio dodecil sulfato de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e transferidos para membranas Immobilon-P (Millipore, Billerica, MA). As análises de Western blot foram realizadas utilizando um anti-poli (ADP-ribose) polimerase-1 (PARP, SC-7150, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anticorpo primário, um anticorpo primário de caspase-3 (SC-7148, Santa Cruz Biotechnology), um anticorpo primário calpaína (MAB3083, Millipore) seguida por um anticorpo conjugado com peroxidase de rábano anti-coelho (SC-2004, Santa Cruz Biotechnology) ou anticorpo anti-ratinho (A9044, Sigma-Aldrich). As manchas foram, em seguida, desenvolvida com o sistema de detecção ECL Plus (Pierce). Para avaliar as amostras de carga de proteína igual, as membranas foram despojado e sondado com um anticorpo anti-β actina (SC-1615, Santa Cruz Biotechnology).

In Vitro Angiogenesis Ensaio

Para determinar o efeito de ZP nisina na angiogénese, foram realizadas em ensaios in vitro broto [31]. Para os ensaios de Sprout, células HUVEC foram tratadas com tripsina e suspensas em meio de crescimento celular endotelial (EGM-2) contendo 50 ng /ml de factor de recombinante de crescimento endotelial vascular (VEGF) e várias concentrações de ZP nisina (0, 100, 400 e 800 ug /mL ). As células foram semeadas a 1 x 10

4 células /cm

2 em Matrigel revestidas placas de 96 poços e incubadas durante a noite. Imagens dos brotos foram capturados usando o XL Núcleo Imaging System EVOS (Life Technologies, Grand Island, NY), então comprimento total broto foi medida usando o Image J (National Institutes of Health). Os ensaios foram realizados em triplicado.

Análises de imuno-histoquímica

Para avaliar os efeitos da nisina sobre a angiogênese in vivo, análises de imuno-histoquímica foram usadas para avaliar a expressão de CD31, uma molécula de adesão de células endoteliais, em cortes de tecidos tumorais mouse. Resumidamente, após a recuperação de antigénios por pré-tratamento de micro-ondas (tampão de citrato, 10 mM, pH 6,0), as lâminas foram incubadas com um anticorpo primário CD31 (DAI-310, Dianova, Hamburgo, Alemanha) durante a noite a 4 ° C. Depois de cromogénio diaminobenzidina reacção (DAB), as lâminas foram contrastadas com hematoxilina de rotina. coloração imuno-histoquímica para CD31 foi classificado e marcado por um patologista de forma cega.

rato O câncer oral modelo

Para examinar os in vivo efeitos antitumorais de ZP nisina, um câncer bucal do chão de- foi utilizado um modelo de rato boca. células de UM-SCC-17B foram injectados por via submucosa no chão da boca em ratinhos como previamente descrito [9, 28, 29, 32]. Todos os protocolos para os estudos in vivo foram aprovadas pelo Comitê sobre o Uso e tratamento dos animais na Universidade de Michigan. Especificamente, as células foram cultivadas até 70% de confluência, suspensas em DMEM, misturado com um volume igual de crescimento Matrigel matriz de membrana basal reduzida-fator (BD Biosciences, San Jose, CA) a uma concentração final de 1,25 x 10

4 /0,05 mL. camundongos atímicos (NCr-nu /estirpe nu, NCI, Frederick, MD) foram anestesiados de seis semanas de idade, por injecção intraperitoneal com 100 mg /kg de ketamina e 10mg /kg de xilazina. Um volume total de 0,05 ml de células SCC /suspensão de Matrigel foi injectado por via submucosa no chão da boca. Três semanas após as injeções de células tumorais e após a confirmação de que os tumores foram estabelecidos, os animais foram igualmente distribuídos em seis grupos: um grupo controle que recebeu água (volume igual /controle) por sonda oral durante 3 semanas e cinco grupos de tratamento diferentes que foram dadas nisina tratamento por sonda oral durante 3 semanas. Após as injecções de células de tumor, os ratinhos foram monitorizados em dias alternados. Os grupos de tratamento consistiram de ratinhos que receberam a nisina ZP a duas concentrações diferentes (400 e 800 mg /kg por dia) e murganhos que receberam nisina AP a duas concentrações diferentes (400 e 800 mg /kg por dia). Houve também um outro grupo de ratos que foi dado nisina ZP (800 mg /kg por dia) durante um período prolongado de tempo (meses). Após a conclusão da administração de nisina, os ratinhos foram sujeitos a eutanásia por CO

2 sobredosagem e deslocamento cervical, em seguida, os tumores foram colhidos, lavados em solução salina tamponada com fosfato (PBS), fotografada, e fixados durante a noite em 10% de formalina tamponada. Um paquímetro digital foi utilizado para determinar o volume do tumor usando a fórmula

a

x

a

x

b

/2, onde

um

é o menor dimensão. Em geral, os ratinhos foram eutanizados se ratinhos exibiram sinais fisiológicos do stress a partir de incapacidade de comer ou beber, perda de peso, ou quando os volumes tumorais atingir uma gama de 300-500mm

3, e, assim, os ratinhos foram sacrificados em geral em cerca de 3 semanas para o protocolo de curto prazo. Os ratos foram sacrificados por uma CO

2 overdose.

Análise Estatística

Em geral, os valores foram expressos em média ± SD. diferenças entre os grupos foram analisados ​​por análise de variância (ANOVA) e teste de Tukey-Kramer HSD. Para os estudos in vivo, foram utilizados testes t independentes com variâncias desiguais.

Resultados

nisina ZP e nisina AP induzir dose-dependente significativa apoptose celular HNSCC e além disso em baixa nisina conteúdo

O tratamento com ambos ZP nisina (95%) e AP nisina (95%) induziu um aumento significativo na apoptose em células CECP (UM-SCC-17B e HSC-3) em comparação com o tratamento com baixo nisina teor (2,5% ) (Figura 1A e 1B). A apoptose foi medida usando brometo de etídio e laranja de acridina (EB /AO) coloração e microscopia. Os efeitos de AP ZP nisina e na apoptose foram dose-dependente e aumentou à medida que as concentrações de nisina e ZP AP aumentou de 200 para 400 ug /ml. Embora as diferenças de apoptose entre ZP nisina e nisina AP não foram significativas, nisina ZP exibiu melhor solubilidade, e, portanto, a maioria dos experimentos foram realizados com ZP nisina.

A e B

, nos gráficos que mostram alterações na percentagem de células apoptóticas CECP (HSC-3 e de UM-SCC-17-B) tratadas com meio de controlo ou meio contendo 2,5% de nisina, 95% nisina AP, ou 95% ZP nisina, durante 24 h. As células foram então coradas usando uma laranja de acridina e brometo de etídio (EB /AO) e mancha contadas. As comparações entre os grupos em relação aos controles foram analisados ​​por ANOVA com o nível de significância de * p 0,05.

C

, imagens microscópicas mostram morphologhy de células CECP tratados com meios de controle ou meios que contenham ZP nisina (100 a 800 mg /mL) durante 24 h, em seguida, coradas com EB /AO (barras de escala, de 100 mm).

DF

, nos gráficos que mostram mudanças no percentual de células vitais, apoptóticos e necróticos (UM-SCC-17B, HSC-3 e queratinócitos orais normais) tratados com meios de controle ou meios contendo nisina ZP (400 ou 800 ug /mL) durante 24 h. As comparações entre os grupos em relação aos controles foram analisados ​​por ANOVA com o nível de significância de * p 0,05 células vitais; # P . 0.05 células apoptóticas

Além disso, os efeitos da ZP nisina na apoptose de células de carcinoma epidermóide foram significativas ao longo de uma ampla gama de doses de 100, 200, 400 e 800 ug /mL (Fig 1C- 1E) e em várias linhas de células de carcinoma epidermóide (UM-SCC-17B e HSC-3). Coordenadamente, as células tratadas com doses crescentes de nisina ZP exibiu diminuição significativa do número de células vitais e significativamente o aumento do número de células apoptóticas, ao passo que o número de células necróticas permaneceu relativamente baixa e constante. Em contraste, queratinócitos primários não apresentaram níveis melhorados de apoptose como aquele visto em linhas de células de carcinoma epidermóide (Fig 1F).

nisina ZP induz a apoptose através de calpaína, caspase 8 e PARP clivagem

Para mais analisar o mecanismo de apoptose mediada por nisina, foram empregados ensaios adicionais apoptóticas e proteínas de sinalização de apoptose conhecido pesquisados. Quatro linhas de células de carcinoma epidermóide foram examinadas quanto à sua capacidade de resposta a nisina. A nisina aumentou significativamente a apoptose em todas as células de quatro linhas CECP como avaliado por coloração de anexina V e citometria de fluxo (Fig 2A).

Um

, gráficos que mostram mudanças na percentagem de células apoptóticas (UM-SCC -17B, HSC-3, UM-SCC-14A e CEB-3) tratados com meio de controlo ou meio contendo ZP nisina (400 jig /mL) durante 24 h. As células foram então coradas com Anexina V e a apoptose foi avaliada por citometria de fluxo. As comparações entre os grupos em relação aos controles foram analisados ​​por ANOVA com o nível de significância de * p 0,05.

B

, Imunotransferência mostrando calpaína 1, caspase-8, os níveis de caspase-3, e proteína PARP em HNSCC (UM-SCC-17b) e

C

, lisados ​​de células de queratinócitos humanos normais após orais ZP tratamento com nisina, durante 18 h.

D

, Imunotransferência mostrando PARP e calpaína uma activação em lisados ​​de células de carcinoma epidermóide após o tratamento durante 18 horas com meios de controlo, meios contendo nisina ZP (400 ug /mL), meios contendo um inibidor da calpaína (ALLN, 500 nM) , ou meio contendo ambos um inibidor da calpaína (ALLN, 500 nM) e de nisina (400 jig /mL).

D

, An immunoblot para ß-actina mostra os controles de carga.

Dadas as nossas descobertas anteriores de que a nisina medeia a apoptose dependente de cálcio, exploramos o potencial envolvimento da calpaína, um conhecido cálcio mediador dependente da apoptose [9]. Com efeito, a nisina tratada CECP células exibiram uma diminuição dos níveis de expressão da subunidade pequena da calpaína 1, indicativos de uma activação da calpaína (Fig 2B). A expressão decrescente da subunidade pequena da calpaína um espelhado as doses crescentes de nisina ZP 100-400 ug /ml, e, assim, foi dependente da dose.

Para explorar ainda mais o mecanismo de apoptose induzida por nisina ZP, caspase -8 e a clivagem de caspase-3 foram examinados neste contexto. A nisina induziu activação de caspase-8 de um modo dependente da dose (Fig 2B). No entanto, o tratamento das células com CECP ZP nisina induziu apoptose independente de caspase-3 (Fig 2B). Western blotting para a caspase-3 em células tratadas ZP nisina revelou níveis estáveis ​​de expressão da caspase-3 e a ausência de caspase-3 clivada, independentemente da dose de nisina testados (Fig 2B).

nisina ZP células tratadas também apresentaram poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) clivagem, uma característica da apoptose (Fig 2B). clivagem de PARP aumentada dependentemente da dose em doses ZP nisina aumentada. Para determinar se a clivagem de PARP mediada por nisina era um mecanismo dependente de calpaína, um inibidor da calpaína (ALLN) foi examinada neste contexto (Figura 2C). O tratamento de células com ambos CECP nisina ZP e um inibidor da calpaina, a clivagem de PARP eficaz reduzida, em comparação com as células tratadas apenas com nisina. orais queratinócitos humanos normais não apresentaram activação da calpaína, caspase-8, caspase-3 ou PARP, em resposta ao tratamento com nisina ZP (Figura 2D). apoptose Assim, induzida nisina ZP de células CECP através da activação /clivagem da calpaína, caspase-8 e PARP, mas independente da caspase-3 clivagem.

nisina ZP e nisina AP reduzir significativamente HNSCC tempo-proliferação celular ea dose -dependently

foram examinados os efeitos de ZP nisina e AP na proliferação celular HNSCC seguinte, e descobrimos que o tratamento com ambos ZP nisina e proliferação nisina AP significativamente reduzido de células HNSCC (UM-SCC-17B) (Fig 3A ). Os efeitos de AP ZP nisina e sobre a proliferação de células de carcinoma epidermóide foram dependente da dose, uma vez que os níveis de proliferação diminuíram como a concentração de nisina e ZP AP aumentou 400-800 ug /ml. Além disso, as diferenças na proliferação de células de carcinoma epidermóide induzidas por ZP nisina contra nisina AP tratamento foram significativas, de tal modo que os efeitos induzidos por ZP nisina foram mais pronunciadas. Assim, tendo em conta os maiores efeitos de ZP nisina na redução da proliferação e tendo em conta a melhoria da solubilidade da nisina ZP sobre AP nisina, ZP nisina foi seleccionado para posterior estudo. Os efeitos de ZP nisina na proliferação de células de carcinoma epidermóide foram significativas ao longo de uma ampla gama de doses de 100 a 800 ug /ml e em várias linhas de células de carcinoma epidermóide (Fig 3B). Além disso, a redução de nisina ZP-mediada na proliferação de células de carcinoma epidermóide foi dependente do tempo, mostrando efeitos significativos nos 6, 12, 24, e 48 h (Fig 3C). A proliferação celular reduzida provavelmente reflete, em parte, a parada do ciclo celular mediada por nisina [9]; ainda mais evidenciado pela diminuição da fosforilação do marcador checkpoint do ciclo celular, cdc2 (S1 Fig).

A

. Os gráficos que mostram alterações na proliferação celular em células de UM-SCC-17B tratados com meio de controlo ou meio contendo AP nisina ou ZP (400 ou 800 ug /mL) durante 48 h. As comparações entre os grupos em relação aos controles foram analisados ​​por ANOVA com o nível de significância de * p 0,05. # Comparação entre AP nisina e nisina ZP * p ≤ 0,05.

B

. Os gráficos que mostram alterações na proliferação celular em células CECP (UM-SCC-17B, HSC-3 e de UM-SCC-14-A) tratadas com meio de controlo ou meio contendo doses crescentes de ZP nisina (100 a 800 ug /mL) durante 48 h. As comparações entre os grupos em relação aos controles foram analisados ​​por ANOVA com o nível de significância de * p 0,05. ¶Comparison entre os 100 ug /ml de grupo relativamente ao controlo para as células SCC-UM-17B * pμ0.05.

C

. Os gráficos que mostram alterações na proliferação celular em células de UM-SCC-17B tratados com meio de controlo ou meio contendo ZP nisina (400 jig /mL) durante 6, 12, 24 e 48 h. As comparações entre os grupos em relação aos controles foram analisados ​​por ANOVA com o nível de significância de * p 0,05.

D

, as imagens são de células UM-SCC-17B tratadas por 48h com os meios de controle ou meios contendo nisina ZP (400 ou 800 mg /mL), em seguida, cultivadas por 10 dias, coradas com violeta de cristal e fotografada para avaliar a capacidade clonogênica.

E

, O gráfico mostra a percentagem de colónias presentes em relação aos controles para ensaios de medição da capacidade clonogênica. As comparações entre os grupos em relação aos controles foram analisados ​​por ANOVA com o nível de significância de * p 0,05.

F

. Os gráficos que mostram alterações na proliferação celular em queratinócitos humanos normais tratados por via oral com o meio de controlo ou meio contendo ZP nisina (100, 200, 400 ou 800 ug /mL) durante 48 h. As comparações entre os grupos em relação aos controles foram analisados ​​por ANOVA com o nível de significância de * p . 0,05

nisina ZP reduz a formação de colónias de células HNSCC

Nós exploramos ainda mais os efeitos de ZP nisina sobre a proliferação celular, medindo os seus efeitos a longo prazo utilizando ensaios de formação de colónias. De acordo com os ensaios de proliferação a curto prazo, o tratamento com nisina ZP inibiram a formação de colónias em células CECP (Fig 3D e 3E). Os efeitos inibidores na formação de colónias foram dependente da dose, uma vez que a formação de colónias diminuiu significativamente à medida que a dose aumentou ZP nisina 400-800 ug /ml. CECP células tratadas com estas duas doses exibiu uma redução de 2 e 50 vezes na capacidade clonogénico. Nisina não inibiu a proliferação de queratinócitos orais humanos normais, como que em células de CECP (Fig 3F).

blocos nisina ZP orasphere formação

Nós ainda descobriram que o tratamento com ZP nisina bloqueou significativamente orasphere formação ou o crescimento independente de ancoragem (Fig 4A e 4B). formação Orasphere ou o crescimento independente de ancoragem é uma propriedade que contribui para o potencial tumorigénico. Os efeitos da nisina ZP sobre orasphere formação foram dose-dependentes, de modo que a área total orasphere diminuiu de forma constante após o tratamento com doses de nisina de 100, 200, 400 e 800 mg /mL.

A

, Fase contrastam imagens e

B

, gráfico que mostra a porcentagem de inibição orasphere (área total) em células de CECP (UM-SCC-17B) cultivados em condições de suspensão e tratada com meios de controle ou meios contendo nisina ZP (100 a 800 ug /ml) durante 36 h. As comparações entre os grupos em relação aos controles foram analisados ​​por ANOVA com o nível de significância de * p . 0,05

nisina ZP induz a apoptose de células endoteliais e inibe a brotação angiogênico

Nós já mostrou que o tratamento com baixo teor de nisina inibiu o crescimento tumoral e resultou em tumores pequenos pálido, o que sugere que a nisina afectado o fornecimento de sangue do tumor. Nós também relatado anteriormente que os efeitos antitumorais da nisina foram mediados por CHAC1, um indutor pró-apoptóticos em células endoteliais [9]. Assim, para determinar se a nisina ZP afeta a angiogênese, foram avaliados os efeitos de ZP nisina sobre a apoptose de células endoteliais e germinação.