Sumário

Os cancros do pulmão expressar o loop autócrino colinérgicos, o que facilita a progressão das células cancerosas. Os antagonistas de mAChR foram demonstradas para deprimir o crescimento de cancros do pulmão de pequenas células (CPPC). Neste estudo destinado a investigar o efeito inibidor do crescimento de R2HBJJ, um novo antagonista muscarínico, em células de cancro de pulmão de células não pequenas (NSCLC) e os possíveis mecanismos. O ensaio de ligação competitiva revelou que R2HBJJ tinham uma elevada afinidade para M1 e M3 AChRs. R2HBJJ apresentou uma forte atividade anticolinérgica sobre a contração induzida por carbacol da traqueia de cobaia. R2HBJJ marcadamente suprimido o crescimento de células NSCLC, tal como H1299, H460 e H157. Em H1299 células, tanto R2HBJJ e seu composto líder R2-APS apresentaram atividade anti-proliferativa significativa como darifenacina antagonista do receptor M3. reabastecer exógena de ACh poderia atenuar a inibição do crescimento induzida por R2HBJJ. Silenciando receptor M3 ou Chat by específicas do siRNAs resultou em uma inibição do crescimento de 55,5% e 37,9% sobre H1299 células 96 h após a transfecção, respectivamente. Estudos adicionais revelaram que o tratamento com R2HBJJ prendeu o ciclo celular na fase G0 /G1 por sub-regulação da ciclina D1-CDK4 /6-Rb. Portanto, o presente estudo mostra que as células NSCLC expressar um sistema colinérgico autócrina e parácrina que estimula o crescimento de células NSCLC. R2HBJJ, como um novo antagonista mAChR, pode bloquear o loop colinérgicos locais antagonizando predominantemente receptores M3 e inibir o crescimento de células NSCLC, que sugerem que o antagonista do receptor M3 pode ser um potencial regime quimioterapêutico para NSCLC

Citation:. Hua N , Wei X, Liu X, Ma X, Ele X, Zhuo R, et al. (2012) A Novel Muscarínicos Antagonista R2HBJJ inibe Non-Small Cell Lung Cancer crescimento celular e Detenções do ciclo celular em G0 /G1. PLoS ONE 7 (12): e53170. doi: 10.1371 /journal.pone.0053170

editor: Michihiko Kuwano, da Universidade Kyushu, Japão

Recebido: 14 Agosto, 2012; Aceito: 26 de novembro de 2012; Publicação: 28 de dezembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Hua et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de câncer relacionados com o mortalidade em todo o mundo eo número de casos e mortes relacionadas com o cancro do pulmão está a aumentar em muitas partes do mundo. carcinoma do pulmão de não-pequenas células (NSCLC) é responsável por quase 80% de todos os casos de câncer de pulmão. Apesar dos esforços agressivos, os tratamentos não são satisfatórias e as taxas de sobrevivência permanecem dismal ( 20%) [1]. Portanto, são necessários ainda mais a compreensão da biologia do NSCLC e desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para o tratamento do cancro do pulmão.

A acetilcolina (ACh) é um importante neurotransmissor no sistema nervoso central e periférico e desempenha um papel-chave na aprendizagem, memória, controle autonômico, e contração muscular através da activação de receptores de acetilcolina (AChRs), incluindo a muscarínico (mAChR) e receptores nicotínicos (nAChR). Recentemente, verificou-se que a ACh é também amplamente sintetizados por uma variedade de tipos de células não neuronais, incluindo células epiteliais das vias aéreas [2], pleura pulmonar [3], intestino delgado e grosso, vesícula biliar, queratinócitos [4], glia [5], endotélio vascular [6] e células de cancro mais comuns, tais como NSCLC, carcinoma do pulmão de células pequenas (SCLC), cancro do cólon, carcinomas do ovário e da glia [7]. A expressão generalizada de acetilcolina não-neuronal é acompanhado pela presença ubíqua de colina acetiltransferase (ChAT), colinesterase e receptores (nAChRs, mAChR). Embora a função primária elucidado de forma incompleta, a acetilcolina não-neuronais parece estar envolvida na regulação das funções celulares importantes, tais como a mitose, a função trófica, automaticidade, locomoção, a actividade ciliar, o contacto célula-célula, citoesqueleto, bem como a barreira e imunológico funções [7] – [9]. Portanto, o sistema colinérgico e acetilcolina, agindo como uma hormona autócrina e parácrina local, não neuronal, devem ser discriminadas a partir do sistema colinérgico e neuronal da acetilcolina neuronal.

De modo semelhante, não-neuronal ACh estimula o crescimento celular, quer através de muscarínico colinérgico ou percursos colinérgicos nicotínicos. Tem sido relatado que o crescimento de células tumorais foi acelerada através da activação dos receptores muscarínicos no cólon [10], do pulmão [11] – [12], glial [13], e da próstata [14]. Em carcinomas do ovário, expressão de mAChR correlaciona-se com um prognóstico pobre [15]. Música

et ai relataram que a interrupção da sinalização colinérgico muscarínico M3 autócrino com antagonista do receptor de iodeto de 1,1-dimetil-4-diphenylacetoxypiperidinium (4-DAMP) ou darifenacina tem potencial para inibir o crescimento de células SCLC ambos

In vitro

e

in vivo

[16]. Além disso, muitos investigadores têm mostrado que a activação de nAChRs de nicotina ou do seu derivado cancerígena 4- (metilnitrosamino) -1- (3-piridil) -1-butanona (NNK) estimulou o crescimento de células de tumor no cancro da mama [17], do pulmão [18 ], mesotelioma pleural [19], do cólon [20], da bexiga [21] e o cancro cervical [22]. Estes estudos têm mostrado que A7 é a principal subunidade nAChR que medeia os efeitos proliferativos de nicotina em células de cancro.

cloridrato Penehyclidine (APS) é um fármaco anti-colinérgico derivado de hiosciamina e desenvolvida de forma independente pelo nosso instituto. Como o seu potencial actividade anticolinérgica, foi comercializado para o tratamento de envenenamento por pesticidas organofosforados aguda e doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC) [23] – [24]. APS é um composto racémico com dois centros quirais, que compõem quatro isómeros ópticos (Fig. 1). Nossos trabalhos anteriores revelaram que o isômero com R, R’-configuração (R2-APS) apresenta a maior atividade anticolinérgica. Para reduzir os efeitos colaterais, premindo o acesso ao sistema nervoso central, um novo agente anticolinérgico (R2HBJJ) é concebido por introdução de um grupo sal de amónio quaternário de molécula de R2-APS para o tratamento de doens perificas, tais como os cancros do pulmão e DPOC. No presente estudo, a seletividade de R2HBJJ para os receptores M1-M5 é avaliada em detalhe e a atividade antitumoral do R2HBJJ em linhas de células NSCLC

in vitro seus potenciais mecanismos Comprar e são explorados. Para o nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a investigar o efeito do antagonista M3 em células NSCLC.

Resultados

R2HBJJ exibida maior afinidade seletiva para M

3 e M

1 receptores

Saturação de ligação análise rendeu constante de ligação (K

D) valores para a afinidade [

3H] NMS em humanos M1, M2, M3, M4 e M5 de 0,29 ± 0,04, 0,81 ± 0,17, 0,53 ± 0,09, 0,19 ± 0,03 e 0,48 ± 0,13 nM, respectivamente. A selectividade relativa para os subtipos M1-M5 RACh de R2HBJJ foi determinada pela primeira vez ao nível da afinidade de ligação ao receptor em proteínas mAChR humanos (Fig. 2). Os valores de IC

50 e K

i de inibição R2HBJJ [

3H] NMS de ligação para subtipos de receptores M1-M5 foram resumidos na Tabela 1. R2HBJJ exibiram uma maior afinidade em relação ao receptor de M3 e M2 que M1 receptor. A patente de afinidade de R2HBJJ durante cinco mAChR diferentes foi M3 M1 M4 M5 . M2

mAChR proteínas foram incubadas com [

3H] -NMS a 37 ° C durante 2 h na ausência e na presença de concentrações crescentes de R2HBJJ. Os dados representam as médias ± SEM de três experiências independentes realizadas em duplicado.

R2HBJJ inibida induzida por carbacol traqueal contração

Para determinar o efeito de bloqueio de R2HBJJ em mAChR, um ex modelo vivo de contracção da traqueia de cobaia foi aplicado. A contracção da faixa traqueal isolada de cobaia foi induzida por 1 uM de carbacol, um agonista muscarínico não selectivo. E, em seguida, as concentrações crescentes de R2HBJJ (10

-10-10

-6,5 M) ou um antagonista de atropina como controlo, foram adicionados cumulativamente ao banho de órgãos. Obteve-se a resposta da concentração inibidora contra a contracção induzida por carbacol. Os resultados mostraram que a concentração R2HBJJ dependentemente inibiu as respostas contrácteis de traqueias de cobaio com o carbacol (Fig. 3). A concentração de inibição de 50% (IC

50) foi de 7,58 ± 1,05 nM, o que foi estatisticamente significativamente menor do que a atropina (10,21 ± 1,04 nM,

P

0,05). Os dados revelaram que R2HBJJ exibiu uma forte actividade antagonista de mAChR expressos em traqueia de cobaio.

O carbacol (1 mM) foi utilizado para induzir a resposta contráctil. Depois disso, as concentrações indicadas de R2HBJJ ou atropina foram adicionados cumulativamente ao banho de órgãos e foram obtidas as respostas de concentração inibitória contra a contracção induzida por carbacol. Os valores foram expressos como percentagens da resposta máxima contrátil na ausência de qualquer antagonista. Cada ponto representou a média ± SD de cinco experimentos independentes.

linhagens de células NSCLC expressas receptores colinérgicos e colina acetiltransferase

Se um loop autócrino colinérgicos é funcional em NSCLC, em seguida, as células devem expressar colina-acetiltransferase (ChAT), mAChR e /ou para os nAChRs ACh para proporcionar a estimulação colinérgica autócrino para o crescimento de células NSCLC. Para determinar se linhas celulares de NSCLC expressar AChRs e bate-papo, o mRNAs de cinco subtipos de mAChR (M1-M5), três subtipos de nAChRs (α7, α9 e α10) e bate-papo foram examinadas por RT-PCR em linhagens de células NSCLC humanas H1299, H157, H460, A549 e humanas imortalizadas BEP2D células epiteliais dos brônquios. Como mostrado na Fig. 4, o M1, M2, M5, α7, α9, subtipos de receptores α10 e conversar quase foram expressos em todas as células NSCLC testados. subtipo de receptores M3 foi expressa em H1299, H157and H460, e estava ausente em A549. M4 subtipo de receptor foi expresso em H1299 e H157, mas não em H460 e A549. Em contraste, humana imortalizada brônquios células epiteliais BEP2D expressa os mRNAs de diferentes subtipos AChRs em níveis mais baixos, exceto para α10 subtipo e conversar. Os resultados implicam um loop autócrino acetilcolina existente em células NSCLC.

RT-PCR foi realizada em ARN total preparado a partir das linhas celulares indicadas. Os iniciadores foram descritos na Tabela 3. GAPDH foi usada como controlo de carga.

R2HBJJ inibiu a proliferação de células NSCLC in vitro

Para avaliar o efeito de R2HBJJ no crescimento celular de CPNPC, as células foram tratados com concentrações crescentes de R2HBJJ (1,6-100 uM) durante 72 horas e a viabilidade celular foi determinada utilizando o ensaio de sulforrodamina B (SRB). Os resultados mostraram que o tratamento com R2HBJJ marcadamente suprimiu o crescimento celular de um modo dependente da concentração em H1299, H460 e H157 células, com uma concentração de inibição de crescimento de 50% (GI

50) de 8,5, 8,8 e 28,5 ^ M, respectivamente. Em comparação, as células A549 e BEP2D eram resistentes a R2HBJJ, com IG

50 de mais de 100 uM, a concentração mais elevada testada (Fig. 5A). Os dados sugerem que o efeito anti-proliferativo de R2HBJJ estava dependente das características de linhas de células e não a citotoxicidade não selectivo.

Efeitos de R2HBJJ em linhas de células NSCLC humanas e humanas imortalizadas de células epiteliais dos brônquios (A BEP2D ) e os efeitos de antagonistas de mAChR e nAChR em linhas de células H1299 (B e C, respectivamente). As células foram tratadas com as concentrações indicadas de R2HBJJ ou antagonistas dos receptores colinérgicos durante 72 h. A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de SRB. As células tratadas com o solvente (DMSO) foram usadas como um controlo, com o conjunto de viabilidade a 100%. Cada ponto de dados representa a média ± DP de três experiências independentes.

Além disso, os efeitos de outros mAChR (Fig. 5B) e nAChR (Fig. 5C) foram observadas antagonistas em H1299. Como mostrado na Fig. 5B e 5C, os antagonistas de M3 mAChR selectivos conhecidos darifenacina a proliferação das células H1299 significativamente inibida de uma maneira dependente da concentração, enquanto que o nAChR antagonista mecamilamina não selectivo mAChR antagonista de atropina, não selectivo, antagonista pirenzepina selectivo M1 mAChR, α4β2 selectiva /antagonista α4β4 DhβE e antagonistas α7 seletivo α-BGT não teve efeitos óbvios sobre a proliferação celular. O M2 /M4 antagonista selectivo AF-DX116 também tinha a inibição sobre a proliferação de células na concentração mais elevada testada. Em comparação, R2HBJJ e seu composto parental R2-APS inibiu significativamente a proliferação de células H1299 de um modo dependente da concentração, que potência inibidora foi cerca de 3,7 vezes maior do que a de darifenacina, o melhor entre os antagonistas testadas acima. Porque nenhum agonista AChR exógena foi aplicado, os dados revelaram que endógena ACh funcionava como um factor de crescimento autócrino sinalização em células NSCLC humanas, em parte através da activação do receptor M3.

exógena AChR agonista atenuada inibição do crescimento induzida R2HBJJ

Para determinar a correlação entre vias de sinalização colinérgicos e inibição do crescimento induzida R2HBJJ, foi utilizado agonista AChR exógena ACh. Foram observados os efeitos da acetilcolina sobre o crescimento de H1299 e sobre a inibição do crescimento induzida por R2HBJJ. Verificou-se que a ACh sozinha exógeno em 1, 10, e 100 ^ M durante 72 h teve nenhum efeito significativo sobre o crescimento de células H1299 (Tabela 2). R2HBJJ sozinho a 10 uM e 20 uM reduziu a viabilidade celular de 100 ± 1,61% para 54,13 ± 3,89% e 23,23 ± 2,14% (n = 3), respectivamente. Quando ACh foi administrado antes do tratamento R2HBJJ, a inibição do crescimento induzida por R2HBJJ (ambos 10 e 20 uM) foi atttenuated na presença de ACh exógena de um modo dependente da concentração. análise de duas vias de variância (ANOVA) mostrou um efeito siginificant do tratamento R2HBJJ, o tratamento ACh e tratamento R2HBJJ × interação tratamento ACh (

P Art 0,0001, respectivamente). Testes post hoc confirmou que as seguintes concentrações de pré-tratamento de ACH, 10 uM e 100 uM, atenuou significativamente a inibição do crescimento induzida por 10 pM ou 20 pM de R2HBJJ. Quando comparado com o tratamento R2HBJJ sozinho no nível de 10 uM, 10 uM e 100 uM de ACh pré-tratamento aumentou a viabilidade celular de 54,13 ± 3,89% para 82,29 ± 5,82% (

P

0,01) e 91,1 ± 3,65% (

P Art 0,01), respectivamente. Quando comparado com o tratamento R2HBJJ sozinho no nível de 20 uM, 10 uM e 100 uM de ACh pré-tratamento aumentou a viabilidade celular de 23,23 ± 2,14% para 35,57 ± 4,48% (

P

0,05) e 58,55 ± 2,83% (

P Art 0,01)., respectivamente (Tabela 2)

M3 = ovelhas e conversar siRNAs específicos diminuição da proliferação de células de câncer

Para demonstrar ainda que ACh endógena e sinal do receptor M3 estavam envolvidos na proliferação celular de células NSCLC humanas, as células H1299 foram transfectadas com M3 = ovelhas ou chat-específicas siRNAs e sua proliferação foi observada ao longo do tempo. Em primeiro lugar, a análise de Western blot foi usado para identificar os níveis destes genes. Como mostrado na Fig. Os níveis de proteína 6A e 6B, M3 e conversar diminuíram fortemente 72 h após transfecção com segmentação siRNAs em comparação com o controlo negativo siRNA. Utilizando ensaio de SRB em placa de 96 poços, a potência de inibição do crescimento causada pelo silenciamento M3 ou de ChAT foi testado a 48, 72 e 96 h após a transfecção. O resultado revelou que houve uma redução dependente do tempo do crescimento celular viabilidade por M3 = ovelhas ou ChAT-siRNA em células H1299 em comparação com o controlo negativo de siRNA (Fig. 6C). O efeito anti-proliferativo de silenciar M3 foi visualizado evidentemente início às 48 h após a transfecção (

P Art 0,01) e a inibição de 55,5% foi alcançada dentro de um prazo de 96 h (

P

0,001). Para chat-siRNA, o seu efeito anti-proliferativo foi apresentado em 72 h após a transfecção (

P Art 0,001), o que foi mais lento do que o M3 siRNA; e a inibição de 37,9% foi alcançada 96 h após a transfecção em comparação com o controlo negativo siRNA (Fig. 6C,

P Art 0,001).

Down-regulação do M3 e conversar proteína foi detectados por western blot 72 h após a transfecção de 200 nm siRNAs (A e B). As células foram incubadas na presença de 200 nM de ARNsi por 48, 72 e 96 h, após o que, a viabilidade crescimento celular foi determinado utilizando o ensaio de SRB e comparado com o controlo simulado.

**

P Art 0,01,

***

P Art 0,001, em comparação com as células siRNA controle negativo transfectadas ao mesmo ponto de tempo (C). Seguindo M3 ou transfecção siRNA negativo, as células foram tratadas com ou sem R2HBJJ (8 uM e 16 uM) durante 72 h e o efeito da combinação de M3 siRNA knockdown e tratamento R2HBJJ sobre o crescimento celular foi investigada utilizando o ensaio SRB.

#

P Art 0,05,

##

P Art 0,01, em comparação com as células transfectadas siRNA negativos tratados com solvente. (D). Cada ponto de dados representa a média ± DP de três experiências independentes.

Para melhor avaliar se o efeito anti-proliferativo de R2HBJJ receptor M3 era específica, as células H1299 foram tratadas com siRNA R2HBJJ após transfecção M3. O resultado mostrou que, em células tratadas siRNA negativos, R2HBJJ exibiram inibição significativa do crescimento celular, a viabilidade celular foram de 83,5% (

P

0,05) e 57,4% (

P

0,01) após R2HBJJ 8 uM e 16 uM de tratamento. No entanto, depois as células foram tratadas com siRNA M3, a viabilidade das células foi inibido a 54,4%; R2HBJJ (8 uM e 16 uM) não influenciar ainda mais o crescimento celular, o que sugere que o silenciamento do receptor M3 privado da sensibilidade celular à R2HBJJ acentuada e o papel de M3 no efeito de R2HBJJ (Fig. 6D).

R2HBJJ prendeu o ciclo celular em G0 /G1 fase

Para explorar os potenciais mecanismos de-induzir R2HBJJ morte celular nas células NSCLC, foram observados os efeitos da R2HBJJ na progressão do ciclo celular por meio da análise de citometria de fluxo. Os resultados a partir de células H1299 mostrou que a percentagem de fase G0 /G1 aumentou de 40,35% para 76,60%, e a de fase S diminuiu de 46,14% a 15,93%, após o tratamento com 20 uM R2HBJJ durante 72 h (Fig. 7A). Além disso, as células H1299 tratadas com uma gama de R2HBJJ (2,5-20? M) durante 48 h também exibiu prisão significativa na fase G0 /G1, com uma percentagem de aumento de 39,60% a 70,01% (Fig. 7B). Além disso, resultado similar foi obtido na linha de células H157, com um aumento percentual na fase G0 /G1 a partir de 55,04% para 65,46% em relação a concentração (Fig. 7C). Os resultados indicaram que R2HBJJ marcadamente suprimida a progressão de células mitóticas em modos dependente do tempo e dependente da concentração através de células de prender na fase G0 /G1 e diminuindo a síntese de ADN.

As células foram sincronizadas com 1% de FBS durante 24 h . Depois disso, as células foram libertadas em meio completo (10% FBS) contendo 20 uM R2HBJJ para 24, 48, 72 H (A, células H1299) ou várias concentrações de R2HBJJ (2,5-20? M) durante 48 h (B, H1299 células; C, as células H157). As células tratadas com o solvente (DMSO) foram usadas como controlo. a distribuição do ciclo celular foi determinada utilizando o ensaio de citometria de fluxo. Os histogramas exibidos aqui foram representativos de três experiências.

R2HBJJ regulada para baixo os níveis de proteínas reguladoras do ciclo celular e Rb fosforilação

transição de ciclo celular de G1 para S é ativado principalmente pela dois diferentes compostos de cinase: ciclina D1 /CDK4, 6, e a ciclina e, A /CDK2. Rb é o principal substrato de ciclina quinase dependente de D e desempenha um papel fundamental na rede de regulação do ciclo celular. Para investigar os mecanismos moleculares subjacentes de prisão G0 /G1 induzida por R2HBJJ, as alterações dependentes do tempo de várias moléculas reguladoras do ciclo celular relacionada foram avaliados após tratamento com 20 uM R2HBJJ em células H1299 utilizando análise de Western blot. Como mostrado na Fig. 8A, o tratamento com R2HBJJ induzida dramática diminuição da regulação da ciclina D1 proteínas, CDK4 e CDK6 tempo-dependente, enquanto que os níveis de ciclina E e CDK2 manteve-se praticamente inalterada durante o mesmo período. Além disso, a fosforilação de Rb (particularmente em Sor

807/811) foi diminuída tempo-dependente. A diminuição de Rb fosforilado na posição de Ser

807/811 ocorreu tão cedo quanto três horas depois do tratamento e antes da mudança aparente da viabilidade celular. Em contraste, a expressão de Rb basal mostrou um aumento persistente significativa e, em seguida, diminuiu rapidamente para um nível indetectável nas 48 horas após o tratamento, quando a supressão do crescimento celular foi induzido (dados não mostrados), o que pode sugerir um potencial adaptação celular para a redução de Rb fosforilado R2HBJJ após o tratamento. Além disso foi avaliada a resposta de fosforilação de Rb concentração reduzida após tratamento com R2HBJJ durante 48 h (Fig. 8B). O resultado mostrou que a diminuição de Rb fosforilado no Sor

807/811 por R2HBJJ era dependente da concentração e ocorreu na concentração mais baixa testada (1,25 uM). Consistentemente, foi observada a diminuição da regulação da ciclina D1, CDK4 e CDK6 proteínas nas células tratadas com concentrações crescentes de R2HBJJ. Do mesmo modo, a expressão de Rb basais apresentaram um aumento significativo em relação à concentração na primeira e depois diminuiu rapidamente ao nível basal. Juntos, estes resultados sugerem que a proteína Rb e o composto de quinase ciclina D1 /CDK4, 6 eram predominantemente envolvida na G0 celular prisão /G1 induzida por R2HBJJ.

H1299 células foram tratadas com 20? M para o R2HBJJ indicado 3-60 vezes (h, A) ou com várias concentrações de R2HBJJ (1,25-20 uM) durante 48 h (b). Os lisados ​​celulares foram então sujeitas a análise de Western blot. β-actina foi utilizada como controlo de carga.

Discussão

Muitos estudos têm demonstrado que a ACh e outros componentes da sinalização colinérgica, incluindo bate-papo, colinesterase, M e N receptores colinérgicos, estão presentes numa grande variedade de tecidos não neuronais, incluindo células de cancro mais comuns, tais como NSCLC, SCLC, do cólon, da glia, carcinomas da mama e do ovário. No ambiente local dos tumores, as concentrações de ACh nos receptores de superfície pode ser ainda maior devido a densidades celulares elevadas em massas sólidas, aumento da secreção de ACh proximidade da localização do receptor e diminuição dos níveis de colinesterase no NSCLC [26], o que implica que a sinalização colinérgica pode ser ainda aumentada. O sistema colinérgico não-neuronal e ACh, como uma sinalização de crescimento celular local, desempenha um papel no desenvolvimento e progressão do cancro e representa uma potencial nova via para atingir o crescimento do tumor. Portanto, os antagonistas colinérgicos interromper a sinalização autócrina-regulada pode proporcionar uma abordagem a montante direcionado ao bloqueio via proliferativa.

R2HBJJ, como um derivado do agente anticolinérgico R2-PHC, foi sintetizado pelo nosso instituto. No presente estudo, foi avaliada a seletividade de R2HBJJ para M1-M5 receptores muscarínicos e sua atividade anticolinérgica. Nós também determinado se a interrupção da colinérgicos endógena sinalizando com R2HBJJ tem potencial para inibir o crescimento NSCLC

in vitro

.

Nossos resultados demonstraram que R2HBJJ tinham significativamente maior afinidade para subtipos de receptores M1 e M3 do que M2 subtipo , o que sugeriu menos efeitos colaterais cardiovasculares associados ao receptor M2. O grau de afinidade do R2HBJJ por cinco mAChR diferentes foi M3 M1 M4 M5 M2. O resultado é consistente com a obtida no seu composto parental APS antes [27]. No estudo funcional, R2HBJJ inibiu as respostas contrácteis de traqueias de cobaio com o carbacol em uma maneira dependente da concentração. A actividade inibidora foi mais forte do que a de antagonista de mAChR, atropina.

canção

et ai relataram que SCLC sintetizar e segregar acetilcolina, que actua como um factor de crescimento autócrino através de ambos os mecanismos colinérgicos nicotínicos e muscarínicos [16]. Nosso estudo elucidado linhas de células NSCLC humanas, como SCLC, expressam tanto M e N AChRs, bem como bate-papo, o que implica que uma base funcional do circuito autócrino colinérgicos está presente em NSCLC. Por conseguinte, a actividade inibidora do crescimento de R2HBJJ em várias linhas celulares de NSCLC, incluindo H1299, H460 e H157 células, pode ser mediada por ambos os mecanismos de M e N colinérgicos. Mas quando as células H1299 foram tratados com antagonistas selectivos ou não selectivos em receptores conhecidos M- e N-

in vitro

, descobrimos que apenas M3 antagonista do receptor de darifenacina apresentou uma inibição significativa no crescimento celular. Enquanto isso, os nossos compostos R2HBJJ e R2-APS também inibiu marcadamente a viabilidade celular das células H1299, com efeito preferível que a darifenacina. No estudo da Canção

et al

, o tratamento de células SCLC com antagonistas do receptor M3 de 4-DAMP ou darifenacina crescimento celular inibido ambos

in vitro

e

in vivo

. Os nossos resultados sugerem que os antagonistas do receptor M3 tem actividade inibitória sobre a NSCLC bem. O efeito anti-proliferativo de R2HBJJ em NSCLC pode ser relacionado com a sua actividade antagonista selectivo do receptor M3. Russo P

et ai relataram que a inibição da α7-nAChR com um antagonista poderoso de elevada afinidade α-TCC induzida actividade anti-tumoral em NSCLC e mesotelioma pleural, desencadeando a apoptose [18] – [19]. No entanto, na nossa investigação, outro antagonista α7-nAChR α-BGT foi utilizado para tratar células H1299 e não foi observado o efeito sobre a viabilidade celular, o que sugere que a sinalização α7-nAChR podem não ser o mediador principal no crescimento celular H1299.

no presente estudo, não conseguimos observar o efeito proliferativo de ACh exógeno sobre células H1299, que pode implicar que ACh endógena forneceu efeito estimulante o suficiente sobre a proliferação celular. No entanto, para reabastecer exógena de ACh é necessária para antagonizar de forma competitiva a inibição da R2HBJJ em células H1299. O resultado salientado que o efeito de R2HBJJ no crescimento celular H1299 foi conseguida através de impacto na sinalização ACh endógena. No presente estudo, chat siRNA foi provado para inibir o crescimento de células, que apoiou ainda mais esta hipótese. Além disso, é de notar que o tratamento com o receptor M3 siRNA resultou numa inibição significativa do crescimento de células H1299 quando comparado com o controlo negativo de ARNip células tratadas. A potência de inibição foi de 50% ou mais dentro de um intervalo de tempo de 96 h. Quando o receptor M3 foi derrubado eficazmente em células H1299, as células lossed sua sensibilidade à R2HBJJ. Os resultados acentuada ainda mais o papel do M3 no efeito anti-proliferativo de R2HBJJ. Prisão

ciclo celular é um importante mecanismo de prevenção do crescimento do tumor. Os resultados de análise de citometria de fluxo mostrou que R2HBJJ marcadamente suprimida a progressão mitótica da célula através de células de prender na fase G0 /G1. Célula de transição ciclo de G1 para S controla a síntese de ADN e requer a hiperfosforilação de um supressor de tumor, Rb [28]. No processo de cura, a actividade catalítica de ciclina D1 associar com CDK4 /6 é em primeiro lugar que se manifesta por meio da G1, aumenta para um máximo na G1 /S de transição e contribui para a saída G1. Considerando que a ciclina E e ciclina A associa com CDK2 é activado na zona de transição G1 /S ou na fase inicial S, respectivamente. A fosforilação de Rb é inicialmente desencadeada por activas de ciclina D1-CDK4 /6 complexos e depois acelerado pela ciclina E-CDK2. Esta fosforilação permite a dissociação de factores de transcrição, tais como E2 fator de ligação promotor (E2F) e o proto-oncogene c-Abl sobre-expresso ou mutado numa série de tumores malignos, o que pode transactivar genes em fase S que codifica para proteínas que amplificam o interruptor e fase G1-S-a são necessárias para a replicação de ADN [29]. Das proteínas do ciclo celular analisados ​​no presente estudo, a expressão de proteínas ciclina D1, CDK4 e CDK6 foram regulados negativamente tempo-dependente, ao passo que os níveis de ciclina E e CDC2 não foram afectados de forma significativa. Além disso, a fosforilação de Rb na posição de Ser

807/811 foi inibida por R2HBJJ dependente do tempo, o que poderia suprimir a interacção entre c-Abl e Rb e retardar a activação de c-Abl e a progressão do ciclo celular [ ,,,0],30]. Em conjunto, os nossos dados sugerem que a proteína Rb e o composto de quinase ciclina D1 /CDK4, 6 eram predominantemente envolvida na detenção G0 /G1 celular induzida por R2HBJJ. Os resultados também sugerem que R2HBJJ exerceu o seu efeito de retardamento na fase precoce da fase G0 /G1.

De facto, as moléculas reguladoras que regulam a progressão do ciclo celular precoce tais como ciclina D1-CDK4 /6-Rb são alvos frequentes de alterações genéticas em taxas excepcionalmente altas dos cancros do pulmão [31]. Muitos estudos têm demonstrado que as estratégias para alvejar proteínas associadas com a progressão do ciclo celular precoce e o ponto de restrição G1 podem ser úteis na terapia anti-cancro [32] – [33]. A ciclina D1 foi também demonstrado ser um alvo a jusante de várias vias de transdução de sinal mediada por oncogenes tais como neu, Ras, e β-catenina. Um estudo recente apoia a promessa de abordagem co-targeting ciclina D1 como preditivo e personalizar para a prevenção e terapia [34] câncer de pulmão. Além disso, a ACh por intermédio mAChR foi mostrado para levar a proliferação celular através da activação de MAPK, ERK1 /2 e a regulação da progressão do ciclo celular [11], [16]. Nossos dados não publicados também mostrou que a apoptose cedo foi envolvido no efeito anti-proliferativo das R2HBJJ, mas os mecanismos subjacentes restava a ser mais explorado.

Em conclusão, o estudo revela que as células NSCLC expressar uma autócrina e parácrina sistema colinérgico que estimula o crescimento de células NSCLC. R2HBJJ, um novo antagonista muscarínico, pode bloquear o circuito colinérgico locais antagonizando predominantemente receptores M3 e inibir o crescimento de células NSCLC. O mecanismo de prisão G0 do ciclo celular induzida por R2HBJJ /G1 envolve a regulação negativa de ciclina D1-CDK4 /6-Rb. Os resultados sugerem que os antagonistas do receptor M3 possivelmente tornar-se um novo regime quimioterapêutico potente para NSCLC.

Materiais e Métodos

Materiais

Radiolabeled composto [

3H] N-metilescopolamina ([

3H] NMS), o receptor muscarínico humano (M1, M2, M3, M4 e M5) e proteínas BetaPlate Scint de membrana foram obtidos da Perkin Elmer Life and Analytical Sciences. R2-APS e R2HBJJ (estruturas químicas indicadas na Fig. 1) foram sintetizados pelo nosso instituto. As estruturas químicas foram confirmados por análise de espectro de ressonância magnética nuclear. A atropina, pirenzepina, mecamilamina, α-bungarotoxina (α-BGT), carbacol, e ACh foram adquiridos da Sigma. Di-hidro-β-eritroidina bromidrato (DhβE) e AF-DX116 foram adquiridos a partir de Tocris. A darifenacina foi comprado de Pequim Huafeng United Technology. Os anticorpos utilizados para western blot foram adquiridos de sinalização celular de proteína supressora de tumor retinoblastoma (Rb), fosfo-Rb (Ser

780 e Ser

807/811), ciclina D1, ciclina E, CDK2, CDK4, CDK6. M3-RACh foi obtido a partir de Santa Cruz. Bate-papo, β-actina, de cabra anti-coelho e cabra imunoglobulina anti-rato marcado com peroxidase de rábano foram adquiridos de Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology.

Radioligante Ensaio de Ligação

ligação de saturação foi realizada utilizando uma gama