Sumário

Fundo

O papilomavírus humano (HPV), especialmente HPV16 , está associada com o desenvolvimento de ambas as variantes do cancro do colo do útero e intratype tonsilares e na sequência de aminoácidos do HPV16 E6 oncoproteína demonstraram estar associadas a lesões e persistência do cancro virais. Por esta razão, a presença de HPV16 E6 variantes do carcinoma de células escamosas das amígdalas (TSCC) no câncer cervical (CC), bem como em amostras cervicais (CS), foram exploradas.

Métodos

HPV16 E6 foi sequenciado em amostras de 108 TSCC e 52 CC de pacientes diagnosticados 2000-2008 no Condado de Estocolmo, e em 51 CS de mulheres jovens que frequentam um centro de saúde da juventude em Estocolmo.

resultados

o rara variante E6 R10G foi relativamente frequente (19%) em TSCC, ausente em CC e pouco frequente (4%) em CS, enquanto a conhecida variante L83V era comum em TSCC (40%), CC (31%), e CS (29%). A diferença foi significativa para R10G entre TSCC e CC (p = 0,0003), bem como entre TSCC e CS (p = 0,009). O HPV16 linhagem filogenética Europeia e seus derivados dominaram em todas as amostras ( 90%).

Conclusão

A freqüência relativamente alta da variante R10G em TSCC, em relação ao que foi encontrado CC em ambos, no presente estudo, bem como em vários outros estudos em diferentes países, pode indicar uma diferença entre TSCC CC e no que respeita à indução e ao desenvolvimento do tumor. Alternativamente, pode haver diferenças no que respeita à prevalência oral e cervical desta variante que precisa ser mais explorada

Citation:. Du J, Nordfors C, Näsman A, Sobkowiak M, Romanitan M, Dalianis T, et ai. (2012) Papilomavírus Humano (HPV) 16 E6 Variantes em Câncer tonsilar em comparação com aquelas em Câncer do colo do útero em Estocolmo, Suécia. PLoS ONE 7 (4): e36239. doi: 10.1371 /journal.pone.0036239

editor: Rui Medeiros, IPO, Inst Porto Oncology, Portugal |

Recebido: 10 de fevereiro de 2012; Aceito: 29 de março de 2012; Publicação: 27 de abril de 2012

Direitos de autor: © 2012 Du et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O apoio financeiro foi fornecido pelo Instituto Sueco para Infectious Disease Control, a Fundação do Câncer Sueco (100.258), o Conselho de Pesquisa sueco (K2011-56X-15282-07-6), o Cancer Society Estocolmo (101.081), o Conselho da Cidade de Estocolmo (2.010.067) e do Instituto Karolinska. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Co-autor Torbjörn Ramqvist é membro do Conselho Editorial PLoS ONE. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas de dados e materiais de partilha ..

Introdução

A infecção de alto risco (HR) papilomavírus humano (HPV) tem desde o início da década de 1980 foi reconhecida por causar o desenvolvimento de cancro cervical e, mais recentemente, também cancro orofaríngea [1], [2]. Entre câncer de orofaringe, principalmente tonsilar e base de cancros da língua estão associados com HPV. Notavelmente, a incidência de câncer de orofaringe HPV positivo tem aumentado nas últimas décadas, tanto na Europa e os EUA [3] – [5]. De acordo com o Registro de Câncer Sueco, na Suécia, presentemente mais de 400 novos casos de cancro do colo do útero e cerca de 200 casos de câncer de tonsilar são diagnosticados a cada ano.

Todos os tipos de HPV conhecidos por estarem associados com câncer de orofaringe são também ligados a cervical câncer e HPV16 domina em ambos, causando 50-60% de todos os cânceres cervical positivo HPV e cerca de 90% de todos os cânceres tonsilar positivo HPV. Além disso, enquanto a maior parte do genoma do HPV é integrado no cancro do colo do útero, que é frequentemente epissomal no cancro tonsilar [6]. Isto indica que, embora existam muitas semelhanças entre estes dois tipos de tumor, poderia também haver diferenças, tanto no que diz respeito ao potencial de HPV16 para causar o desenvolvimento de tumores, e para o modo como os diferentes tipos de HPV causam tumores.

Variantes do genoma HPV16 em câncer cervical, em pré-estágios do câncer cervical, e em amostras cervicais de diferentes áreas geográficas têm sido estudados extensivamente e HPV tem sido classificada em linhagens filogenéticas como Europeia (e), da Ásia (as), asiático-americano (AA), Africano-1 e -2 (Af-1 e Af-2), e Norte American1 (NA1) [7] – [11].

A maior transformando proteínas do HPV16, E6 e E7 , alvo p53 e Rb, respectivamente, inibir a apoptose e de promover a proliferação e, portanto, a maioria dos estudos sobre variantes HPV16 têm-se centrado em E6 e E7 em adição aos estudos da região não codificadora de controlo (NCCR). As variantes foram mostrados para diferem frequentemente em E6 e NCCR, enquanto a proteína E7 é muitas vezes mais conservado [12], [13]. Além disso, para as linhagens principais variantes, variantes com alterações de um único nucleótido são frequentemente encontrado, especialmente em tumores. A mais frequente destas mutações é o t a transição G no nt 350 em E6, abreviado como E-T350G, causando uma alteração de aminoácidos de leucina para valanine no a.a. 83 (L83V). Vários estudos sobre a variante L83V demonstraram uma associação com persistência viral e progressão do câncer de carcinoma cervical, embora alguns estudos posteriores não confirmaram essa associação [14] – [17]. Outras variantes também têm sido associadas a propriedades importantes para o desenvolvimento do tumor, tais como, por exemplo, aqueles com a capacidade de inibir p53 transativação [18].

Enquanto muitos estudos sobre variantes HPV16 foram realizados em câncer cervical, muito poucos estudos desse tipo foram feitas no cancro do pescoço [19], [20 ]. O objetivo deste estudo foi, portanto, examinar se havia diferenças na ocorrência e frequência de HPV16 E6 variantes entre câncer tonsilar e câncer cervical. Por esta razão, a prevalência de sequências de HPV16 E6 foram comparados em amostras de câncer de colo do útero e tonsilar de pacientes diagnosticados durante o mesmo período de tempo no Condado de Estocolmo, Suécia. Além disso, a comparação dos dados obtidos a partir destes tumores com as frequências de variantes HPV16 em pessoas saudáveis, HPV16 E6 foi também analisado em amostras cervicais de mulheres jovens saudáveis ​​em uma clínica da juventude em Estocolmo.

Resultados

HPV16 E6 variantes no aminoácido R10G e L83V

Cinquenta e cinco HPV16 positiva TSSC, 52 CC e 51 CS foram analisados ​​em relação à sequência de HPV16 E6, Tabela S1. A diferença mais notável entre TSCC e CC foi encontrado no que diz respeito às frequências da variante E-A131G causando uma mudança de arginina para glicina no a.a. 10 (R10G). Esta mutação estava presente em 22% (12/55) dos TSCC, enquanto completamente desprovido de amostras CC e presente apenas em 4% (2/51) das amostras cervicais. Esta diferença foi significativa entre ambos TSCC e CC (p = 0,0003) bem como entre TSCC e CS (p = 0,009).

A variante E-T350G foi o mais comum entre todos os três grupos de amostras . Esta variante, causando uma mudança de leucina por valina em AA 83 (L83V), foi especialmente comum em TSCC (45%) seguido por CC (31%) e CS (29%), respectivamente.

Validação de R10G e frequências L83V em mais amostras TSCC

para validar ainda mais o aumento das frequências de mutações R10G e L83V em TSCC, 53 amostras adicionais TSCC, de pacientes diagnosticados no mesmo hospital durante o mesmo período, foram avaliados apenas para o R10G e mutações L83V. Entre estas 53 amostras de 17% (9/53) levou o R10G e 34% (18/53) a mutação L83V. Quando todas as 108 amostras foram resumidos 19% tinha R10G e 40% a mutação L83V. A maior parte (12/21) de E6 de TSCC abrigando R10G também continha L83V. Não foi observada diferença significativa entre o 55 TSCC originalmente selecionado e o grupo TCCS estendida no que diz respeito a estas duas mutações.

Frequência de outras variantes

As mutações em outros locais foram menos comuns para todos os tipos de amostras, e apenas 19/28 delas afectada a sequência de aminoácidos. Os mais comuns foram Q14H e H78Y, ambos presentes em 4% dos CC e CS, enquanto 7% dos TSCC teve Q14H e H78Y. Além disso, duas amostras de cancro do colo do útero tinha 27 repetições pb entre nt 528 e 554.

Distribuição de diferentes linhagens filogenéticas

Conforme detalhado na Tabela S1, o protótipo HPV16 E6 europeu foi encontrado em 38% de TSCC, 65% dos CC e 59% de CS. No entanto, quando as amostras com o tipo Europeu que contém diferenças de nucleótidos menores (incluindo R10G e L83V) foram incluídos, estes números aumentaram para 93, 94 e 96%, respectivamente. Como também mostrado na tabela S1 outros tipos, Africano-1 e 2, do Leste Asiático. Asian American e norte-americanos só foram encontrados em algumas amostras.

Correlação de HPV16 E6 variantes no câncer tonsilar com parâmetros clínicos

As amostras TSCC foram comparados em relação ao paciente e do tumor características fundadas na presença de R10G, L83V ou ausência dessas variantes, tal como apresentado na Tabela 1. Não foram, contudo, não houve diferenças significativas para qualquer um destes parâmetros, embora tenha havido uma tendência para tumores com R10G ter um estágio T inferior.

a presença do R10G ou L83V variantes no cancro tonsilar foi analisada em correlação com a sobrevivência livre de doença 3-ano (DSF) dos pacientes. No entanto, nenhuma correlação significativa foi encontrada quando DSF foi comparada entre doentes com presença ou na ausência da variante de R10G ou entre pacientes com presença ou na ausência da variante de L83V (dados não mostrados).

Discussão

no presente estudo, analisamos e compararam a frequência das diferentes variantes HPV16 E6 em TSCC, CC e CS, todos obtidos na área de Estocolmo, durante o mesmo período de tempo. Descobrimos que HPV16 R10G era relativamente comum em TSCC, ausente em CC e raro no CS. A linhagem Europeia HPV 16 foi dominando ea variante L83V foi muito comum em todas as três categorias de amostras.

O facto de a outra forma rara variante HPV16 E6 R10G foi observada em TSCC, mas não em CC em pacientes diagnosticados no o mesmo período de tempo a partir do mesmo hospital é impressionante. Esta variante tem a nosso conhecimento sempre foram raras, embora observados em CC em alguns outros estudos [11], [13], [18]. Embora o tempo de infecção pelo HPV para o desenvolvimento de cancro tonsilar é desconhecido é provável semelhante entre o cancro cervical e tonsilar, uma vez que a idade média dos pacientes é comparável. Assim, é razoável supor que os pacientes neste estudo com câncer cervical e tonsilar foram provavelmente infectados com HPV16 durante aproximadamente o mesmo período. A razão para a alta freqüência da variante R10G em TSCC de Estocolmo, em comparação com CC de ambos Estocolmo e outras áreas, é desconhecido. Uma possibilidade é que esta variante de HPV16 por alguma razão era /é mais comum na via oral, em comparação com a área genital. São necessários mais estudos sobre HPV16 obtidos a partir de amostras orais para explorar esta possibilidade. Outra possibilidade pode ser que esta variante HPV16 tem uma maior propensão para causar TSCC. Notavelmente, embora a maioria dos pacientes com TSCC eram homens, e apenas as mulheres têm CC, não houve diferenças relacionadas ao sexo nas frequências relativas de R10G em TSCC. Os dados recolhidos indicam que virtualmente todos os pacientes portadores da variante R10G teve a Suécia como o país de origem, no entanto não temos informações se eles se mudaram para Estocolmo a partir de outras partes da Suécia.

É bem estabelecido que HPV16 E6 em conjunto com E6AP (proteína E6-associado) forma um complexo que tem como alvo especificamente p53 e medeiam a degradação de p53, o que é essencial para a tumorigénese [21], [22]. Vários estudos têm sido realizados sobre a variante R10G em cancros cervicais. A mutação é R10G na extremidade N-terminal, importante para a ligação e a degradação de p53, e que também tem sido demonstrado para resultar numa modificação B /epítopo de célula T [13], [23], [24]. Tem sido demonstrado que tanto E6 com R10G e L83V reter a capacidade para anular a paragem do crescimento, e fortemente reduzir os níveis de estado estacionário de p53 [25]. No entanto, enquanto E6 com R10G tem uma diminuição da ligação a E6BP (proteína E6 de ligação) e reduzida capacidade de induzir a degradação Bax, E6 com L83V E6 tem uma ligação a E6BP aumentado e mantido capacidade de induzir a degradação Bax em comparação com o protótipo HPV16 E6 [18 ]. E6 tanto com o R10G e L83 alteração, que teve 9/12 TSCC neste estudo, comportou-se semelhante ao protótipo [18]. Além disso, o local R10G tem também sido relatada como sendo essencial para o sinal de localização nuclear [26]. Assim, várias características diferentes de site da R10G podem influenciar a progressão do câncer, embora não esteja claro até que ponto. No presente estudo não foi observada diferença significativa em relação à sobrevida livre de doença de 3 anos entre os pacientes com TSCC realização ou não realização variante HPV16 E6 R10G. Este argumenta contra a possibilidade de que esta variante causaria mais agressivamente crescente TSCC.

Outras variantes de HPV16 E6, especialmente L83V, diferem geograficamente e pode afetar o risco patológico [27]. Neste estudo, L83V foi a variante mais comum em todos os tipos de material, que está em linha com muitas outras observações, tanto no genital e cabeça e pescoço região [16], [19], [20], [28], [ ,,,0],29]. Aqui, uma maior prevalência de L83V foi encontrado em TSCC em comparação com CC e CS, enquanto a prevalência nas últimas categorias foram aproximadamente de acordo com relatórios anteriores [12], [14], [29] – [31]. No entanto, existem vários estudos que demonstram uma associação entre L83V e maior persistência do vírus e risco de neoplasia cervical e progressão do câncer [28], [32]. Além disso, os estudos sobre HPV16 E6 e variantes da resposta imune celular indicam alterações específicas, que a partir de um ponto de imunologia vírus-hospedeiro de vista pode explicar um potencial oncogénico modificadas [33] – [35]. Notável, não encontramos qualquer correlação significativa entre a presença ou ausência da variante L83V e doença de 3 anos de sobrevida livre dos pacientes.

É interessante notar que a variante HPV16 Europeia tem claramente sobre o mesmo muito alta frequência no CS de mulheres jovens, obtido 2009-2010, como em amostras de CC. Com o aumento em viajar durante as últimas décadas um aumento de variantes HPV16 de outras áreas geográficas não teria sido inesperado, mas nenhum tal aumento foi observado.

Uma limitação do presente estudo é o número de amostras analisadas. Não obstante, a 108 TSCC analisados ​​constituem aproximadamente 65% de todos os pacientes do Condado de Estocolmo com HPV16 TSCC positiva diagnosticados durante este período de tempo e onde biópsias estavam disponíveis [1], [36]. Outra limitação é que apenas a região E6 foi analisada. Assim, se houvesse quaisquer diferenças na NCCR, E7 ou E5 regiões entre as amostras TSCC e CC, estes teriam sido perdidas.

Neste estudo verificou-se diferença significativa na distribuição de variantes HPV16 entre TSCC e as amostras CC de pacientes internados no mesmo hospital durante o período de tempo específico. Mais especificamente, a variante rara R10G foi significativamente mais comum em TSCC que em CC, e era frequentemente em combinação com a variante L83V nos tumores ex. São necessários estudos adicionais para investigar se a variante R10G pode ser mais comum em via oral, em comparação com amostras cervicais. Além disso, houve concordância relativa entre a presença de variantes em CC e CS.

Materiais e Métodos

Ética declaração

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Karolinska Institutet, Estocolmo, Suécia, de acordo com as permissões éticas 2005 /431-31 /4, 2005 /1330-32, 2008 /870-31 /4, 2008 /813-31 /2 e 2009 /1278-1231 /4. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes no estudo.

Tumor e amostras cervicais de material

Pré-tratamento de parafina biópsias de tumores de pacientes do Condado de Estocolmo, diagnosticado 2000-2007, com carcinoma de células escamosas das amígdalas (TSCC) ou 2003-2008 com câncer do colo uterino (CC). Todas as amostras de tumor foram previamente analisados ​​para a presença e o tipo de HPV [1], [36] – [38]. Entre os 166 TSCC e 90 CC, que foram HPV16 positivo, 55 TSCC e 52 CC foram selecionados aleatoriamente. Na segunda parte do estudo, para validação, 53 adicionais, selecionados aleatoriamente, HPV16 TSCC positiva do mesmo período de tempo foram incluídos. Um fluxograma para as amostras TSCC é apresentado na Figura 1. Além disso, amostras de 51 HPV16 positivos cervical (CS), a partir de um estudo anterior, de 2009-2010 em um centro de saúde dos jovens em Estocolmo [39] foram selecionados e analisados ​​de forma aleatória. A idade média dos pacientes com câncer foram 59,7 y (mediana 59 y, gama 30-84 y) para pacientes TSCC e 50,3 y (mediana de 45 y, gama 25-88 y) para pacientes CC, enquanto a média de idade para as mulheres na clínica para jovens foi de 19,9 y (mediana de 20 y, y range16-22).

Sequencing

o DNA foi extraído e analisado para a presença de HPV e HPV tipo descrito em estudos anteriores [1], [37], [39]. Para a análise de HPV16 E6 a partir de tecidos de cancro dois pares de iniciadores, abrangendo toda a região E6 foi utilizado. 5′- CCGGTTAGTATAAAAGCAGACAT-3 ‘juntamente com 5′-TGCTGTTCTAATGTTGTTCC-3’ amplificando pb 57-375 e 5’GGAATCCATATGCTGTATGT-3 ‘juntamente com 5’TGCAATGTAGGTGTATCTCC-3′ amplificando bp 273-587. Para amostras cervicais um par de iniciadores abrangendo a totalidade do E6 foi utilizado; 5’-CCGGTTAGTATAAAAGCAGACAT-3 ‘e 5′-GTACCCTCTTCCCCATTGGT-3’ amplificar pb 57-902. O PCR foi realizado com a temperatura de recozimento a 49 ° C e os produtos foram purificados utilizando ExoSAP-IT (USB, VWR) de acordo com o protocolo do fabricante. Um PCR para sequenciação foi realizada sobre os produtos purificados com Big Dye terminator ™ (Applied Biosystems) e os produtos de amplificação foram analisadas num sequenciador Applied Biosystems 3130. Ambas as cadeias de DNA foram sequenciadas e a sequência de DNA e correspondente sequência de aminoácidos foi comparada com a sequência de referência Europeia HPV16 (código de referência: NC_001526.1) usando o software Sci Ed (Ciência e Educational Software, Durham, NC, EUA). Três investigadores (JD, CC e MS) foram envolvidas na análise das sequências. Para casos em que o resultado obtido foi claro, a sequência foi repetida.

A análise estatística

As diferenças de frequências de variantes para TSCC e CC ou CS foram avaliados por qui-quadrado eo teste exato de Fischer ( bicaudal) usando o software on-line análise estatística (GraphPad software). A idade média foi a idade com o primeiro diagnóstico.

livre de doença sobrevivência (DFS) foi definido como o tempo a partir da data do diagnóstico até a data da última ocasião conhecida em que o paciente estava livre da doença, ou a data de recorrência da doença (local, regional ou recorrência à distância). Morte sem recorrência documentada foi censurado na data da morte. sobrevida cumulativa foi calculado com o método de Kaplan-Meier e analisados ​​com o teste de log-rank. Análise de sobrevida foi realizada em SPSS (IBM SPSS Statistics, versão 20).

Informações de Apoio

Tabela S1.

As frequências de diferentes variantes HPV16E6 em câncer cervical (CC), carcinoma de célula escamosa tonsilar (TSCC) e amostras cervicais (CS)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0036239.s001

(DOC)

Reconhecimentos

os autores gostariam de agradecer as parteiras, Jenny Kugelberg, Ingrid Madarász, Anne Henriksson Klintberg, Kicki Bergström, Åsa Weitzberg, Kerstin Johansson na clínica jovens para obter ajuda com a coleta das amostras .