Abstract

Fundo

células cancerosas resistentes

multidrogas são difíceis de erradicar para a ineficácia da medicamentos anticancro convencionais. Além escapar os efeitos citotóxicos da quimioterapia, eles também ultrapassar os efeitos pró-imunogénicas induzidas por fármacos anti-cancerígenos: de facto eles não são bem reconhecidos por células dendriticas do hospedeiro e não induzir uma imunidade anti-tumoral durável. Ainda não foi investigado se as células resistentes a múltiplas drogas têm uma capacidade diferente para induzir imunossupressão do que os quimiossensíveis. Nós abordado esta questão em células quimiossensíveis e cancerosas resistentes a múltiplas drogas humanas e de murino.

Resultados

Nós descobrimos que a atividade e expressão de indoleamine 2,3-dioxigenase 1 (IDO1), que catalisa a conversão do triptofano para a quinurenina metabolito imunossupressora, foi mais elevada em todas as células que apresentam resistência cruzada analisados ​​e que a inibição IDO1 reduziu o crescimento de tumores resistentes aos medicamentos em animais imunocompetentes. Em células quimiorresistentes a actividade basal de JAK1 /STAT1 e sinalização JAK1 /STAT3 foi maior, o inibidor de STAT3 PIAS3 foi regulada para baixo, e a produção autócrina de STAT3-alvo e IDO1 indutores de citocinas IL-6, IL-4, IL- 1β, IL-13, TNF-α e CD40L, foi aumentada. A interrupção da sinalização JAK /STAT reduzido a atividade IDO1 e reverteu os efeitos pró-imunossupressores induzida por quinurenina, como revelado pela proliferação restaurado de linfócitos T em células quimiorresistentes silenciou-STAT.

Conclusões

o nosso trabalho demonstra que as células que apresentam resistência cruzada ter uma atitude imunossupressor mais forte do que as células quimiossensíveis, devido à activação constitutiva do eixo de JAK /STAT /IDO1, resultando, assim, quimioterapia e imuno-evasivo. A interrupção deste eixo podem melhorar significativamente a eficácia dos protocolos de quimio-imunoterapia contra tumores resistentes

citação:. Campia I, Buondonno I, Castella B, B Rolando, Kopecka J, Gazzano E, et al. (2015) Um Autócrino citocinas /JAK /STAT-Signaling Induz Cinurenina Síntese em multirresistente células cancerosas humanas. PLoS ONE 10 (5): e0126159. doi: 10.1371 /journal.pone.0126159

Editor do Academic: Michael Platten, Hospital Universitário de Heidelberg, Alemanha |

Recebido: 27 de outubro de 2014; Aceito: 29 de março de 2015; Publicado em: 08 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 Campia et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado por doações da Associação italiana de Investigação do Cancro (AIRC; conceder MFAG 11475; www.airc.it), o Ministério da Universidade Italiano e Pesquisa ( “Future no programa de investigação” FIRB 2012, conceder RBFR12SOQ1; www.istruzione.it). JK é bolseiro da Fundação italiano para Cancer Research (FIRC; www.fondazionefirc.it). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Conseguir uma boa eficácia da quimioterapia e induzir uma resposta imune anti-tumoral duráveis ​​são os principais desafios da Quimioimunoterapia. Quimiorresistência, em particular, a resistência simultânea a diferentes agentes quimioterapêuticos conhecidos como resistência a múltiplas drogas (MDR), é um dos maiores problemas encontrados pela quimioterapia [1]. MDR pode estar presente no diagnóstico ou induzida pela pressão selectiva de quimioterapia; que assenta sobre a superexpressão de ligação de ATP da cassete (ABC) transportadores responsáveis ​​pelo efluxo de drogas anti-cancro, tais como a P-glicoproteína (PGP), proteínas relacionadas MDR (PRM) e proteína de resistência do cancro da mama (BCRP). Juntos, eles efluxo ambos os agentes clássicos quimioterapêuticos (por exemplo antraciclinas, taxanos, alcalóides Vinca, epipodofilotoxinas, topotecano, metotrexato) e novas drogas específicas (por exemplo, imatinib, dasatinib, lapatinib, gefitinib, sorafenib, erlotinibe), limitando os seus efeitos citotóxicos [2].

agentes quimioterapêuticos específicos, tais como antraciclinas e oxaliplatina, induzem também efeitos pró-imunogénicas, por induzir a translocação na membrana plasmática da específico “coma-me” sinais, como o calreticulina acompanhante, o que desencadeia a fagocitose de células tumorais ea subsequente activação de antitumor CD8

+ linfócitos T [3]. Este mecanismo não funciona em células que sobre-expressam Pgp [4-6], o que resulta, ao mesmo tempo e resistente à quimioterapia-imune.

Além disso, as células tumorais podem escapar à vigilância imunológica hospedeiro através da supressão da actividade do hospedeiro sistema imunológico. Uma multiplicidade de mecanismos de mediar a imunossupressão induzida pelo tumor, incluindo: alterações nos antigénios da superfície do tumor; libertação de citocinas imunossupressoras no microambiente do tumor; expansão de T-helper 2 linfócitos, células T reguladoras (Treg), mielóide células supressoras derivadas e tipo 2-tumorais macrófagos associados, que favorecem o crescimento do tumor e diminuir a actividade das populações de anti-tumorais, tais como 1 linfócitos T auxiliares , CD8

+ linfócitos T, tipo 1-tumorais associadas macrófagos, células assassinas naturais [7].

Um dos mais fortes mediadores da imunossupressão induzida pelo tumor é quinurenina, o produto do catabolismo do triptofano através dioxigenase de triptofano (TDO) [8] e indolaminas enzimas 2,3-dioxigenase (IDO1 e IDO2) [9], que são induzidos por γ interferão (IFN-γ) [10, 11], o óxido nítrico (NO) [12 ] e ferro [13]. O triptofano é um aminoácido essencial para a proliferação e sobrevivência de células T CD8

+ e CD4

+ linfócitos T; Além disso, o aumento da relação de quinurenina /triptofano compromete severamente a eficiência da imunidade celular do hospedeiro, porque quinurenina inibe a activação de linfócitos-T [7, 14]. IDO1 é expresso em células dendríticas que se infiltram no tumor [15] e em células do estroma tumoral [16], e que foi encontrado expresso constitutivamente ou sobre-regulada em várias células tumorais [14, 17]. Uma relação quinurenina soro /triptofano aumento tem sido correlacionada a uma progressão mais rápida de câncer de pulmão [18] e a positividade IDO em amostras de tumor é geralmente associada com um prognóstico clínico pobre [19-21]. IDO1 sobre-expressão suporta o crescimento tumoral e progressão dos cancros do pulmão [22], o que leva à hipótese de que quinurenina, além de seus efeitos imunossupressores, pode aumentar diretamente o desenvolvimento do tumor.

Nós já demonstraram que as células resistentes a múltiplas drogas são resistentes a fagocitose a morte imunogénica operado por células dendriticas mediada [4-6]. Não foi investigado se as células resistentes a multidrogas diferem dos quimiossensíveis também para a capacidade de induzir a imunossupressão: verificou-se que a múltiplos fármacos de células resistentes apresentaram um basalmente maior produção da quinurenina metabolito imunossupressora do que as células quimiossensíveis e investigou-se a base molecular deste fenótipo.

Materiais e Métodos

Chemicals

O plasticware para culturas de células foi de Falcon (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Os reagentes de electroforese foram obtidos a partir de Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). O IFN-γ recombinante humana foi obtida a partir de R D Systems (Minneapolis, MN). 5-Br-brassinin era de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). O conteúdo de proteína dos lisados ​​celulares foi avaliada com o kit BCA de Sigma Chemicals Co (St. Louis, MO). Quando não especificado de outro modo, todos os outros reagentes foram adquiridos a partir de soluções de estoque Sigma Chemicals Co. de 3 mmol /L férrico nitrilotriacetato (FeNTA) foram preparadas por mistura de um volume de /L de ácido nitrilotriacético 6 mmol em 1 eq /L de NaOH, e uma volume de 6 mmol /L FeCl

3 em 1 eq /L de HCl; o pH foi ajustado até à neutralidade com NaOH.

Células

As células não quimiossensíveis humanos do pulmão de células pequenas do cancro A549 foram adquiridos a Istituto Zooprofilatico Sperimentale “de Bruno Umbertini” (Brescia, Italy). As células humanas quimiossensíveis HT29 cancro do cólon, as células crônicas quimiossensíveis humanos leucemia mielóide K562, as células mesoteliais Met5A quimiossensíveis humanos eo murino células JC mamárias constitutivamente quimiorresistentes eram de ATCC (Manassas, VA) O sublinhas resistentes A549 /dx, HT29 /dx, K562 /DX foram gerados no nosso laboratório por cultura das células parentais mencionados acima num meio contendo concentrações crescentes de doxorrubicina, utilizados como um indutor de MDR, como relatado anteriormente [4]. O ser humano células constitutivamente quimiorresistentes mesotelioma maligno (HMM) foram coletadas, após consentimento informado escrito dos pacientes, pelo Banco Biologic de mesotelioma maligno (S. S. Antonio e Biagio Hospital, Alessandria, Itália), onde a caracterização histológica foi realizada [23]. O protocolo experimental (código: Task3) foi aprovado em 09/11/2011 pela Comissão de Bioética ( “Comitato Ético Interaziendale”) do S. S. Antonio e Biagio Hospital, Alessandria, Itália. As células foram cultivadas no respectivo meio de cultura suplementado com 10% v /v de soro fetal de bovino (FBS), 1% v /v de penicilina-estreptomicina, 1% v /v de L-glutamina e foram mantidas numa atmosfera humidificada a 37 ° C e 5% de CO

2

medição quinurenina

a actividade da IDO foi determinada de acordo com [24], com pequenas modificações:. 200 ul de sobrenadantes de cultura de células foram adicionados a 100 ul de 30% w /v de ácido tricloroacético (TCA) e incubadas durante 30 min a 50 ° C para hidrolisar n’-formil-quinurenina a quinurenina. Após centrifugação a 10000 xg durante 10 minutos, 100 ul do sobrenadante foram transferidos para uma placa de 96 poços, misturou-se com 100 ul de 2% w /v benzaldeido p-dimetilaminopiridina em 99,8% v /ácido acético v, e incubou-se durante 10 min à temperatura ambiente. Quinurenina foi detectada medindo a absorvância a 490 nm, utilizando um Synergy HT multi-Detecção leitor de microplacas (Biotek, Winooski, VT). A absorvância do meio de cultura por si só foi considerada como um branco e subtraiu-se os valores obtidos na presença das células. Os resultados foram expressos como proteínas /mg de células quinurenina nmol, de acordo com uma curva de titulação anteriormente definido. níveis quinurenina nos sobrenadantes de cultura celular foram medidos em paralelo por alta pressão de cromatografia líquida (HPLC), como relatado em [25], com pequenas modificações: 400 ul dos sobrenadantes de cultura de células foram adicionados a 100 ul de 30% w /v de TCA , incubadas durante 30 min a 50 ° C e centrifugado a 15000 xg durante 10 min. O sobrenadante límpido foi filtrada através de 0,45 mm filtros de PTFE (Alltech, Nicholasvill, KY) e analisadas por um sistema Agilent LC (Palo Alto, CA), equipada com desgaseificador vácuo (G1322A), bomba quaternária (G1311A), manual do injector (Rheodyne , Cotati, CA) e um detector de comprimento de onda múltiplo (G1365A) integrado no sistema HP1200. Os dados foram obtidos e processados ​​com o software Agilent ChemStation. O volume de injecção foi de 20 ul. Uma coluna Agilent Eclipse XDB-C18 (125 mm x 4,0 mm, 5 um) foi utilizado para a análise a 30 ° C. A separação cromatográfica foi realizada utilizando a fase móvel consistindo de tampão de 15 mmol /L-acetato (pH 4,0) e acetonitrilo (90:10, v /v) a um caudal de 0,8 mL /min. O eluato foi monitorizado a 365 nm, referenciada contra um comprimento de onda de 700 nm. As amostras de calibração foram preparadas por adição de padrões quinurenina (Sigma Chemical Co.) na gama de concentrações de 0,50-50 mol /L ao meio de cultura. Os resultados foram expressos como nmol quinurenina /mg proteínas da célula.

matrizes de qRT-PCR e PCR

O ARN total foi extraído e reversamente transcrito utilizando o kit de síntese de ADNc iScript (Bio-Rad Laboratories ). O qRT-PCR foi realizada com o iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories). A mesma preparação de cDNA foi usada para quantificar o gene de interesse e o gene de manutenção

β-actina

. As sequências dos iniciadores, projetadas com o software qPrimerDepot (https://primerdepot.nci.nih.gov/), foram: para

IDO1

: 5’CAGGCAGATGTTTAGCAATGA -3 ‘; 5’-GATGAAGAAGTGGGCTTTGC -3 ‘; para

β-actina

: 5’GCTATCCAGGCTGTGCTATC-3 ‘; 5’-TGTCACGCACGATTTCC-3 ‘. A quantidade de

IDO1

mRNA foi normalizada versus a quantidade de

mRNA β-actina, escolhido como gene de manutenção, e foi expressa como

IDO1

/

β- actina

razão, utilizando o Bio-Rad Gene Expression Software quantificação (Bio-Rad Laboratories). As matrizes de PCR foram realizadas em 1 ug de cDNA, usando a matriz humano JAK /STAT via de sinalização RT² Profiler PCR e a IL-6 humana /STAT3 via de sinalização Além disso RT² Profiler PCR Array (Qiagen, Hilden, Alemanha), seguindo as instruções do fabricante. A análise dos dados foi realizada com a matriz de RT² Profiler PCR Análise de Dados (Qiagen)

Western blotting

As células foram lavadas com o tampão de lise (125 mmol /L de Tris-HCl, 750. mmol /L de NaCl, 1% v /v de NP40, a 10% v /v de glicerol, 50 mmol /L de MgCl

2, 5 mmol /L de EDTA, 25 mmol /L, NaF, 1 mmol /L NAVO

4 , 10 ug /mL de leupeptina, 10 ug /mL de pepstatina, 10 ug /mL de aprotinina, 1 mmol /L de fluoreto de fenilmetilsulfonilo; pH 7,5), sonicadas e centrifugadas a 13000 xg durante 10 min a 4 ° C. 20 ug de proteínas a partir de lisados ​​celulares foram sujeitos a Western blotting e sondados com os seguintes anticorpos contra: (IDO1 policlonal de coelho, diluído a 1: 2000, AG-25A-0029, Adipogen, San Diego, CA); IDO2 (monoclonal de ratinho, diluídos a 1: 500, SAB3701447, Sigma Chemical Co.); TDO (policlonal de coelho, diluído a 1: 1000, SAB2102400, Sigma Chemical Co.); fosfo (Tyr 1022/1023) -JAK1 (policlonal de coelho, diluído a 1: 1000, # 3331, Cell Signaling Technology, Danvers, MA); JAK1 (policlonal de coelho, diluído a 1: 1000, # 3344, Cell Signaling Technology); fosfo (Tyr701) -STAT1 (policlonal de coelho, diluído a 1: 1000, # 9167, Cell Signaling Technology); STAT1 (monoclonal de ratinho, diluído a 1: 1000, clone 15H3, Thermo Scientific, Rockford, IL); fosfo (Tyr705) -STAT3 (policlonal de coelho, diluído a 1: 2000, # 9145, Cell Signaling Technology); STAT3 (monoclonal rato, diluído 1: 5.000, clone 9D8, Thermo Scientific); Pgp (policlonal de coelho, diluído a 1: 250, SC-8313, Santa Cruz Biotechnology Inc.); MRP1 (monoclonal de ratinho, diluídos a 1: 100, ab32574, Abcam, Cambridge, Reino Unido); MRP2 (monoclonal de ratinho, diluídos a 1: 100, ab3373, Abcam); MRP3 (anticorpo policlonal de cabra, diluída a 1: 250, SC-5776, Santa Cruz Biotechnology Inc.); MRP4 (anticorpo policlonal de cabra, diluída a 1: 250, ab77184, Abcam); MRP5 (anticorpo policlonal de cabra, diluída a 1: 250, SC-5781, Santa Cruz Biotechnology Inc.); BCRP (policlonal de coelho, diluído a 1: 500, SC-25882, Santa Cruz Biotechnology Inc.); β-tubulina (anticorpo monoclonal de ratinho, diluídos a 1: 500, SC-5274, Santa Cruz Biotechnology Inc.), seguido por um anticorpo secundário conjugado com peroxidase (Bio-Rad Laboratories). As proteínas foram detectadas por quimioluminescência aumentada (Bio-Rad Laboratories). Os extractos nucleares foram preparados com o Kit de extracto nuclear (Activo motivo, Rixensart, Bélgica); 10 ug de proteínas nucleares foram resolvidas por SDS-PAGE e sondadas com anticorpos contra os seguintes: PIAS1 (monoclonal de coelho, diluído a 1: 1000, ab109388, Abcam); PIAS3 (policlonal de coelho, diluído a 1: 1000, ab22856, Abcam); fosfo (Tyr701) -STAT1; STAT1; fosfo (Tyr705) -STAT3; STAT3; proteína de ligação tata (TBP; policlonal de coelho, diluído 1.500, SC-273, Santa Cruz Biotechnology Inc.). Para excluir qualquer contaminação citosólica de extratos nucleares, verificou-se que β-tubulina foi detectada em amostras nucleares (não mostrado).

Em Tumor Crescimento Vivo

1 x 10

5 humano A549, A549 /dx, HT29, HT29 /dx células em 20 ul de meio de cultura, misturou-se com 20 mL de BME Cultrex (Trevigen, Gaithersburg, MD), foram implantadas subcutaneamente no flanco direito de 8/6 semanas nus ratos velhos do sexo feminino BALB /c, alojados sob 12 h ciclo claro /escuro, com comida e bebida fornecidos

ad libitum

. 1 x 10

5 células JC murino quimiorresistentes, singeneicos com ratinhos BALB /c [26], foram implantados em animais imunocompetentes. Em um segundo conjunto experimental, quando A549 dx, HT29 /dx e JC tumores /atingido o volume de 100 mm

3, os animais foram divididos aleatoriamente em dois grupos: grupo “Control” (tratado com 100 mL de solução salina

per os

, 5 dias /semana durante três semanas); grupo “Brassinin” (tratadas com 400 mg /kg do inibidor IDO1 5-Br-brassinin

per os

, 5 dias /semana, durante três semanas), como descrito em [27]. Em ambos os conjuntos experimentais, o crescimento do tumor foi medida diariamente com um compasso e foi calculada de acordo com a equação (LxW

2) /2, onde L = comprimento do tumor e W = largura do tumor. Os ratos foram sacrificados no dia 21. Os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Bioética ( “Comitato di Ético Ateneo”), da Universidade de Torino, Itália.

produção de citocinas

A produção de citocinas foi medida no sobrenadante da cultura de células utilizando os seguintes estojos comerciais: Ser humano da interleucina-6 (IL-6) Duo Set Development Kit (R D Systems), interleucina-4 (IL-4) DuoSet Development Kit (R D Systems ), Humana IL-1-beta (IL-1β) platina kit de ELISA (eBioscience, San Diego, CA), interleucina-13 (IL-13) ELISA Development kit (Peprotech, Londres, Reino Unido), humana solúvel CD40 Ligand (sCD40L) ELISA Development Kit (Peprotech), necrose de tumor humano α (TNF-α) DuoSet Development Kit (R D Systems), IFN-γ DuoSet Development Kit (R D Systems). Os resultados foram expressos como proteínas /mg ng de células ou proteínas celulares pg /mg, de acordo com a curva de calibração de cada kit.

celular silenciamento

200.000 células foram transfectadas com 400 nmol /L de 19 -25 nucleótido não segmentação mexidos siRNAs (ARNsi de controlo-a, Santa Cruz Biotechnology Inc.), com uma STAT1- ou ARNsi piscina específica do STAT3 (Santa Cruz Biotechnology Inc.), de acordo com as instruções do fabricante. Para verificar a eficácia de silenciamento, as células foram lisadas e verificado para a expressão de STAT1 e STAT3 por transferência de Western, como descrito acima.

ensaios imunológicos

1 x 10

6 /mL de células mononucleares de sangue periférico (PBMC), isoladas a partir de crostas inflamatórias de dadores saudáveis ​​(banco de sangue, AOU Città della Salute e della Scienza di Torino Hospital, Torino, Itália) por centrifugação em gradiente de densidade Ficoll-Hypaque, foram tratados com anti- CD3 (OKT3, BioLegend, San Diego, CA) e anticorpos anti-CD28 (BioLegend), para induzir a proliferação específica de linfócitos T, e co-cultivados com células alvo (previamente irradiados com 30 Gy, em 15 min) durante 72 h a uma razão efector /alvo de 10: 1. A expansão dos linfócitos T, a única população de PBMC capazes de proliferar nas presentes condições experimentais, foi avaliada por meio da adição de 1 uCi de [

3H] timidina (PerkinElmer, Waltham, MA) 18 horas antes do final das co-culturas , em seguida, a colheita das placas e contagem da radioactividade. Para analisar o fenótipo dos linfócitos após a incubação com células tumorais, as células foram colhidas, lavadas e re-suspensas em solução salina de tampão fosfato (PBS) contendo 5% v /v de FBS. Uma 3- e 4-cor citometria de fluxo foi realizada com as combinações apropriadas de isothiocyanate- fluoresceína, r-phycoerythrin-, tricolor-, proteína peridinina clorofila-complexo ou aloficocianina conjugados com anticorpos para CD3, CD4, CD8, CD25 (todos provenientes Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemanha), e CD127 (BioLegend). controlos do isotipo foram realizadas para cada amostra. As amostras foram lidas com um fluxo FACS Calibur citómetro equipado com um software de CELLQuestPro (Becton Dickinson). O uso de PBMC de dadores saudáveis ​​e os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Bioética ( “Comitato Ético Interaziendale”) da A.O.U. Città della Salute e della Scienza di Torino Hospital, Torino, Itália.

A viabilidade celular ensaio

A coloração vermelho neutro foi realizada para medir a viabilidade celular, como anteriormente descrito [28]. A absorvância a 540 nm foi lida utilizando um Synergy HT multi-Detecção leitor de microplacas. A absorvância de células não tratadas foi considerado como 100% de viabilidade; os resultados foram expressos como percentagem de células viáveis ​​em comparação com células não tratadas.

medição Nitrito

O nível de nitrito, um derivado estável do NO, nos sobrenadantes de cultura de células foi medido pelo método de Griess [ ,,,0],29]. Os resultados foram expressos em nmoles de nitrito /mg proteínas da célula.

Ferro medição

100 x 10

6 as células foram lavadas com PBS, individual com tripsina /EDTA, centrifugou-se a 12000 xg durante 2 min, re-suspenso em 1 mL PBS e ultra-sons. O ferro intracelular foi medido utilizando um AAnalyst 200 espectrômetro de absorção atômica (PerkinElmer). Os resultados foram expressos como ng suspensão de células de ferro /ml.

A análise estatística

Todos os dados em texto e números são fornecidos como média ± SD. Os resultados foram analisados ​​por uma análise de uma via da variância (ANOVA). A

p Art 0,05 foi considerado significativo.

Resultados

quinurenina síntese é mais elevada em células multirresistentes e é modulado por 5-Br-brassinin, metil-DL-triptofano e interferão-γ

em primeiro lugar, analisamos a produção quinurenina em um painel de células cancerosas resistentes quimiossensíveis e multidrogas, mostrando um padrão diferente de transportadores ABC (S1 FIG): HT29, A549, K562, Met5A eram células quimiossensíveis humanos; HT29 /DX, A549 /dx e K562 /DX eram modelos de MDR adquirida; HMM e JC foram células constitutivamente quimiorresistentes humano e murino, respectivamente. As linhas celulares resistentes a múltiplas drogas tinham níveis mais elevados detectados-quinurenina por HPLC (Fig S2) e ensaio espectrofotométrico (Fig 1A) -e aumento dos níveis de proteína IDO1 comparação com células quimiossensíveis (Fig 1B). IDO2 foi detectada em quantidades variáveis ​​em células quimiossensíveis e quimiorresistentes; TDO foi detectado em todas as linhas celulares analisadas, excepto em células A549 /dx (Fig 1B).

IDO1

mRNA resultou também maior em multidroga células resistentes do que nas quimiossensíveis (Fig 1C).

As células humanas quimiossensíveis A549 câncer de pulmão e células A549 /dx quimiorresistentes, células de cancro do cólon HT29 quimiossensíveis humanos e quimiorresistentes HT29 /dx, células K562 humanos quimiossensíveis leucemia mielóide crônica e K562 resistente à quimioterapia /células dx, as células mesoteliais Met5A quimiossensíveis humanos e células mesotelioma HMM malignas quimiorresistentes humanos, as células mamárias JC quimiorresistentes murino foram submetidos às seguintes investigações. A. Os níveis quinurenina nos sobrenadantes de cultura de células foram medidos espectrofotometricamente. Os dados estão apresentados como médias ± DP (n = 4). * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001: células quimiorresistentes (MDR-positivo) contra as células correspondentes quimiossensíveis (MDR-negativas). análise de mancha B. ocidental de IDO1, IDO2 e expressão TDO. A expressão β-tubulina foi utilizada como controlo de carga de proteína igual. A figura é representativa de 3 experiências com resultados semelhantes. C. O nível de

IDO1

ARNm foi medido por qRT-PCR expressão. Os dados estão apresentados como médias ± DP (n = 4). * P 0,01, ** p 0.002:. Células quimiorresistentes (MDR-positivo) versus as células correspondentes quimiossensíveis (MDR-negativas)

A549 resistente à quimioterapia Humano /células dx e HT29 /dx células cresceu mais rapidamente do que as células A549 e HT29 quimiossensíveis implantado em ratinhos BALB /c nus (Fig 2A). As células JC quimiorresistentes murino teve a maior taxa de crescimento (Fig 2A). Curiosamente, o IDO1 inibidor de 5-Br-brassinin [27], não inibiu o crescimento de A549 /dx e HT29 /dx tumores, implantadas em ratinhos imunodeficientes, mas reduziu significativamente a progressão de tumores JC, implantados em animais imunocompetentes (Fig 2B ). Estes dados sugerem que a actividade IDO pode suportar o crescimento rápido dos tumores quimiorresistentes em hospedeiros imunocompetentes.

A. 1 x 10 células

5 humano A549, A549 /DX, HT29, HT29 /dx foram implantadas subcutaneamente em murganhos BALB /c nus fêmeas de 6-8 semanas de idade, 1 x 10

JC células 5 de murideo foram implantados em imunocompetente ratinhos BALB /c. O crescimento tumoral foi monitorizado diariamente por medição de compasso de calibre. Os dados estão apresentados como médias ± DP de 10 ratinhos /grupo. * P 0,02, ** p 0,005, *** p 0,001: A549 /DX ou células HT29 /DX em comparação com células A549 ou HT29, nos pontos de tempo correspondentes. B. Os animais portadores de A549 /DX, HT29 /DX, JC-tumores foram randomizados em dois grupos, quando os tumores atingiram o volume de 100 mm

3: grupo “Control” (tratado com 100 mL de solução salina

per os

, 5 dias /semana durante três semanas; CTRL); grupo “Brassinin” (tratados com 400 mg /kg do IDO1 inibidor da 5-Br-brassinin

per os

, 5 dias /semana durante três semanas; BRA). O crescimento tumoral foi monitorizado diariamente por medição de compasso de calibre. Os dados estão apresentados como médias ± DP de 6 ratos /grupo. ** P 0.005:. BRA-grupo contra CTRL-grupo, nos momentos correspondentes

A seguir, investigou a razão da diferença na produção quinurenina entre as células quimiossensíveis e quimiorresistentes. Por razões de simplicidade, nós nos concentramos sobre o A549 e A549 /dx células como modelos de células resistentes quimiossensíveis e multidrogas, respectivamente, uma vez que estas células a diferença nos níveis quinurenina e expressão IDO1 era muito evidente. Uma vez que a medida de HPLC e o ensaio espectrofotométrico deu resultados sobreponíveis para A549 e células A549 /dx (S2 Fig e Fig 1A), utilizou-se o último ensaio como um método fiável para avaliar as diferenças entre os níveis de quinurenina entre estas duas linhas celulares.

Foram analisados ​​se os níveis quinurenina variou de forma diferente em resposta a drogas de quimioterapia que as células resistentes a múltiplas drogas são insensitive-, para IDO1 ativadores, como o nO, ferro e IFN-γ, e IDO1 inibidores, tais como 5- Br-brassinin e metil-DL-triptofano [30].

doxorrubicina, cisplatina, gemcitabina e mitoxantrona, usado em concentrações que reduziram para 50% da viabilidade de células A549 sensíveis, sem afectar a viabilidade de A549 resistentes /DX células S3A (FIG), não alterou os níveis de quinurenina, que permaneceram significativamente mais elevada em células A549 /dx do que em células A549, quer na ausência ou na presença dos agentes quimioterapêuticos (S3B FIG). Da mesma forma, a nenhum doador S-nitrosoglutationa e S-nitroso-N-acetylpenicillamine, o que aumentou os níveis de NO em células resistentes quimiossensíveis e multidrogas (S4A FIG), não se modificar a síntese quinurenina em comparação com células não tratadas em ambas as populações de células (S4B FIG). Para modular a ferro intracelular, que trataram células A549 e A549 /dx com o permeável composto libertador de ferro célula FeNTA e com o desferroxamine quelante de ferro, que, respectivamente, o aumento e diminuição da quantidade de ferro célula (S5A figura): novamente, nem FeNTA nem desferroxamine variar a produção quinurenina (Fig S5B).

IFN-γ aumentou os níveis de quinurenina em ambas as células resistentes a múltiplas drogas e quimiossensíveis, mas a extensão de tal aumento era maior em células A549 /dx (Fig 3A). O efeito de IFN-γ, que foi reduzido por os inibidores de metil-DL-triptofano e 5-Br-brassinin (Fig 3A), foi associada com o aumento de

IDO1

ARNm (Figura 3B) e proteína ( Fig 3C). Também neste caso, o aumento induzida por IFN-γ foi mais pronunciado em A549 /DX do que em células A549 (Fig 3B e 3C), o que sugere que as células que apresentam resistência cruzada foram mais sensíveis à citocina. Efeitos semelhantes de IFN-γ, metil-DL-triptofano e 5-Br-brassinin foram detectados em HT29 e HT29 /DX, as células K562 e /dx K562, Met5A e células HMM (dados não mostrados).

células A549 e A549 /dx foram incubadas durante 48 horas em meio fresco (Ctrl) ou em meio contendo o IDO1 inibidores de metil-DL-triptofano (1 mmol /L, por PGM) ou 5-Br-brassinin (100 umol /L, BRA), e o IDO1 indutor de IFN-γ (100 ng /mL, IFN-y), isoladamente ou em combinação. A. Os níveis quinurenina nos sobrenadantes de cultura de células foram medidos espectrofotometricamente. Os dados estão apresentados como médias ± DP (n = 4). * P 0,01: contra células CTRL A549; °°° p 0,001: contra A549 /dx CTRL;

◊◊ p 0,005: IFN-γ + PGM-tratada, IFN-y +-tratados BRA células A549 e A549 /DX em comparação com as células correspondentes tratados com IFN-γ sozinho. B. O nível de

IDO1

ARNm foi medido por qRT-PCR expressão. Os dados estão apresentados como médias ± DP (n = 4). *** P 0,001: CTRL contra células A549; °°° p 0,001: contra células CTRL A549 /dx. análise de mancha C. ocidental de expressão IDO1. A expressão β-tubulina foi utilizada como controlo de carga de proteína igual. A figura é representativa de 3 experimentos com resultados semelhantes.

células resistentes a múltiplas drogas têm uma maior atividade da JAK de sinalização /STAT e um aumento da produção autócrina de citocinas dependente de STAT3 do que as células quimiossensíveis

Desde IFN-γ ativa o JAK /STAT1-3 sinalização [31], e STAT1 e STAT3 são potentes activadores da transcrição da

IDO1

gene na maioria das células de mamíferos [32, 33], foram analisados ​​os níveis de expressão de genes-chave da via de JAK /STAT por um rastreio por PCR de alta produtividade. Tal como mostrado na Tabela S1 e a Fig 4A, células A549 /dx não diferem das células A549 para a expressão de

JAK1-2-3

, mas exibiu maior expressão de

STAT1 e

STAT3

. De acordo com esta tendência, STAT1- clássica e genes STAT3-alvo (

A2M

,

BCL2L1

,

CDKN1A

,

CRP

,

CXCL9

,

FAS

,

IRF1

,

JUNB

,

MMP3

,

MYC

,

NOS2

,

SOCS1

) foram regulados positivamente nas células resistentes a múltiplas drogas (S1 tabela). Na validação transferência de Western, verificou-se níveis semelhantes de proteína total de JAK1 em lisados ​​de células inteiras de A549 e A549 /dx células, mas a níveis mais elevados de JAK1 fosforilada de tirosina-activa nas células que apresentam resistência cruzada (Fig 4B). As quantidades de STAT1, fosfo (Tyr701) -STAT1, STAT3, fosfo (Tyr705) -STAT3 também foram maiores nas células quimiorresistentes (Fig 4b). O nível de ARNm do inibidor de STAT1 PIAS1 não foi significativamente diferente entre A549 e A549 /células dx (S1 Tabela e Figura 4A), e o nível de proteína PIAS1 foi o mesmo nos extractos nucleares (Figura 4C). Por outro lado, a quantidade nuclear do PIAS3 inibidor STAT3 foi mais baixa em células A549 /dx (Fig 4C); este foi em linha com o nível mais baixo de

PIAS3

mRNA (S2 Tabela). Curiosamente, STAT1, fosfo (Tyr701) -STAT1, STAT3, fosfo (Tyr705) -STAT3 foram todas mais translocado para o núcleo das células que apresentam resistência cruzada (Fig 4C). Este padrão, que é provavelmente devido à maior quantidade e fosforilação de STAT1 /STAT3 e à menor expressão de PIAS3, levou-nos a hipótese de que STAT1- e, em particular, os genes STAT3-alvo deve ser regulada para cima no multirresistente células.

a. O cDNA a partir de células A549 A549 e /dx foi analisado por uma variedade de PCR específicos para a sinalização de JAK /STAT, como relatado em Materiais e Métodos. O regulamento dobra dos 83 genes analisados, expressos em escala logarítmica, é representado em uma escala colorimétrica. A figura representa a média de 4 experiências. B. As células foram lisadas e sujeitas a análise de Western blot para fosfo (Tyr 1022/1023) -JAK1, JAK1, fosfo (Tyr701) -STAT1, STAT1, fosfo (Tyr705) -STAT3, STAT3. * P * P * P * P * P 0,05, ** p * P * P