Abstract

Fundo

Os métodos convencionais para detecção de câncer de pulmão, incluindo tomografia computadorizada (TC) e broncoscopia são caros e invasivos. Assim, ainda há uma necessidade de uma técnica de detecção de câncer de pulmão ideal.

Métodos

O ar exalado de 50 pacientes com diagnóstico histológico de câncer de pulmão comprovada por amostras de biópsia broncoscopia (32 adenocarcinomas, 10 de células escamosas carcinomas, 8 pequenos carcinomas de células), foram analisados ​​por meio de espectrometria de mobilidade iônica (IMS) e comparados com 39 voluntários saudáveis. Como uma avaliação secundária, comparamos os pacientes de adenocarcinoma com e sem o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) mutação.

Resultados

Um algoritmo de árvore de decisão poderia separar os pacientes com carcinoma de células escamosas cancro do pulmão incluindo adenocarcinoma, e carcinoma de células pequenas. Um 100-15 separados de compostos orgânicos (VOC) picos voláteis foram analisados. Pico-2 anotada como n dodecano utilizando o banco de dados IMS foi capaz de separar os valores com uma sensibilidade de 70,0% e uma especificidade de 89,7%. A incorporação de um algoritmo de árvore de decisão de partida com n-dodecano, uma sensibilidade de 76% e uma especificidade de 100% foi alcançada. Comparando picos de COV entre adenocarcinoma e indivíduos saudáveis, n-Dodecane foi capaz de separar os valores com uma sensibilidade de 81,3% e uma especificidade de 89,7%. Quatorze pacientes positivos para a mutação EGFR exibido significativamente maior n-Dodecane do que para os 14 pacientes negativas para EGFR (p 0,01), com uma sensibilidade de 85,7% e uma especificidade de 78,6%

Conclusão

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neste estudo prospectivo, os padrões de pico de VOC usando um algoritmo de árvore de decisão foram úteis para a detecção de câncer de pulmão. Além disso, n-Dodecane análise de pacientes com adenocarcinoma pode ser útil para discriminar a mutação EGFR

Citation:. Handa H, Usuba A, Maddula S, Baumbach JI, Mineshita M, Miyazawa T (2014) exalado análise do hálito para Detecção de câncer de pulmão Usando Ion Mobility Espectrometria. PLoS ONE 9 (12): e114555. doi: 10.1371 /journal.pone.0114555

editor: Francisco Renán Aguayo, Universidade do Chile, Chile

Recebido: 11 de julho de 2014; Aceito: 11 de novembro de 2014; Publicação: 09 de dezembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Handa et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pela Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência e por Grants-in-Aid para a Investigação Científica (20410061, 24800068). Dr. Baumbach foi apoiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alemanha) dentro do Centro de Pesquisa Colaborativa (Sonderforschungsbereich) SFB 876 “Fornecer informações por Resource-Constrained Análise”, TB1 projeto “Resource-Constrained Análise de Espectrometria de dados”. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores têm os seguintes interesses concorrentes: Drs. Baumbach e Maddula eram empregados da B S Analytik GmbH até 2013 e Baumbach é acionista da B S Analytik GmbH. Não há conflitos de consultoria, patentes, produtos em desenvolvimento, ou produtos comercializados. Os autores confirmam que este emprego não altera a sua adesão em relação à PLOS ONE políticas sobre a partilha de dados e material.

Introdução

Recentemente, a equipe de triagem de teste National Lung relatou que a triagem com dose baixa calculado a tomografia (CT) reduziu a mortalidade de câncer de pulmão em cerca de 20%. CT dose baixa é um importante teste de triagem; no entanto, é caro e há riscos associados à exposição à radiação. Por outro lado, a análise da respiração é fácil de usar e livre de radiação. cromatografia em fase gasosa e espectrometria de massa (GC /MS) [1] – [2] e as matrizes de sensores químicos: quartzo microbalança [3], a superfície da onda acústica [4], matriz de carbono-polímero [5], sensor colorimétrico [6], nanotubos de carbono de parede simples [7] e nanopartículas de ouro [8], pode detectar compostos orgânicos voláteis (COV) em câncer de pulmão de respiração humana. Além disso, o cheiro canina centrou-se sobre o diagnóstico de câncer de pulmão [9] – [10].

Ion espectrometria de mobilidade (IMS) com coluna de multi-capilar (MCC), um dispositivo de análise da respiração, pode detectar específica VOCs em pacientes com câncer de pulmão [11]. IMS /MCC pode detectar uma concentração muito baixa de compostos orgânicos voláteis (normalmente na ppbv- para pptv-gama, pg /L para ng /L-gama) em menos de 8 minutos de tempo de análise total e é superior a GC /MS como pode ser aplicado para a cama local e amostragem direta pode ser tomada sem uma preparação [11] – [21]. Na Europa, 550 MBq fontes β-radiação são aceitáveis; no entanto, para o mercado japonês, regulamentos restringir fontes

63Ni β-radiação para menos de 100 MBq. Por conseguinte, no presente estudo, foi utilizada uma fonte de ionização SS-95 MBq. O objetivo inicial deste estudo é confirmar a reprodutibilidade dos resultados IMS /MCC (usando BioScout: B S Analytik, Dortmund, Alemanha). Para uma população japonesa

A quimioterapia de pacientes com câncer de pulmão depende status de desempenho, características histológicas, estadiamento do tumor, e as características moleculares. Anteriormente, 2 drogas combinação de quimioterapia incluindo platina foi realizada como tratamento de primeira linha para pacientes com câncer avançado de pulmão não pequenas células (NSCLC) considerados como uma única doença, apesar da sua histológica e heterogeneidade molecular. No entanto, recentemente, a descoberta de anormalidades moleculares, tais como o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), mutação, e novos agentes, tais como EGFR inibidor de tirosina cinase tratamento modificado de NSCLC. Estes tratamento de NSCLC levou à terapia personalizada. Diferenças de tipo histológico e alterações genéticas são os fatores mais importantes na decisão do tratamento atual câncer de pulmão. O segundo objetivo deste estudo é confirmar se os padrões de COV são capazes de detectar histologicamente confirmada cancros do pulmão, e mutações condutoras, tais como mutação EGFR.

Métodos

análise da respiração usando um espectrômetro de mobilidade iônica ( IMS) foi realizada de forma aleatória em voluntários saudáveis ​​e doentes com cancro do pulmão em St. Marianna University School of Medicine de 01 de setembro de 2011 a 14 de janeiro de 2013. em todos os doentes com cancro do pulmão, amostras de ar foram coletadas antes broncoscopia. A Comissão de Ética de São School University Marianna aprovou este estudo e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os sujeitos (No1820). Este estudo foi inscrita no Registro de Ensaios Clínicos University Hospital Medical Information Network (umin-CTR) (UMIN000006696, 000.008.328).

O ar exalado de 50 pacientes (31 homens, 19 mulheres), com câncer de pulmão confirmada histologicamente por biópsia broncoscopia foi comparado com 39 voluntários saudáveis ​​(25 homens, 14 mulheres). histórias fumadores de indivíduos foram medidos usando maços-anos

Ion espectrometria de mobilidade (IMS)

IMS (BioScout, B S Analytik, Dortmund, Alemanha). combinada com uma coluna multi-capilar ( MCC, tipo OV-5, Multichrom Ltd, Novosibirsk, Rússia) e acoplado a um espirómetro (Ganhorn Medizin, Electronic Niederlauer, Alemanha), como uma unidade de entrada de amostra controlado-CO2 foi utilizado. A Tabela 1 mostra as características do espectrômetro de mobilidade iônica

Os principais parâmetros de análise do hálito já foram resumidos [11] – [21]. E será discutido aqui em breve. IMS refere-se à detecção de iões formados a partir de análise à pressão ambiente dentro de um tubo de deriva. A espectrometria de mobilidade iônica termo refere-se ao método de caracterização de análise dos gases por sua mobilidade de iões em fase gasosa. Normalmente, o tempo de desvio de enxames de iões, formado usando fontes de ionização adequados, em seguida, passando por estores eléctricos, são medidos. mobilidade de iões para a análise podem proporcionar um meio para detectar e identificar vapores. A velocidade de deriva está relacionada com a intensidade do campo eléctrico pela mobilidade. Portanto, a mobilidade é proporcional ao inverso do tempo de deriva, que será medida num comprimento de desvio fixo. IMS combina alta sensibilidade e despesa relativamente baixa técnica com uma aquisição de dados de alta velocidade. O tempo para adquirir um espectro único está na gama de 10 ms a 100 ms. Assim, a IMS é um instrumento adequado para controlo do processo, mas, devido à ocorrência de reacções de iões e moléculas relativamente pobre resolução das espécies formadas, geralmente não é para a identificação de compostos desconhecidos. Em comparação com a espectrometria de massa, o percurso livre médio dos iões é muito menor que as dimensões do instrumento. Um íon formado tem um elevado número de colisões com moléculas de gás transportador no caminho tendência para a Faraday-plate. No entanto, por causa das condições de alto vácuo em espectrometria de massa, um ião formado ali terá normalmente nenhuma colisão com outras moléculas durante a deriva. No pequeno intervalo de tempo entre as colisões ião vai ganhar a energia do campo eléctrico externo e perder a energia pelo seguinte processo de colisão. Consequentemente, a velocidade de deriva bastante constante será alcançado. Portanto, um enxame de iões derivação sob tais condições experimenta um processo de separação que se baseia em diferentes velocidades de deriva de iões com diferentes massas ou estruturas geométricas. Colecção destes iões sobre uma placa de Faraday-fornece um sinal dependente do tempo que corresponde à mobilidade dos iões que chegam. Tal espectro de mobilidade iónica contém informações sobre a natureza dos diferentes compostos presentes na amostra de gás.

Em comparação com outros métodos de análise, a IMS tem uma grande densidade de informação significativamente com carga comparativa baixa no peso, tamanho e potência. Naturalmente, existem outras técnicas analíticas, que contêm muito maior densidade de informação como espectrometria de massa. Outras técnicas são menores e mais econômicos em energia, como sensores de ondas acústicas de superfície. IMS mostra a sua especificidade, dependendo do tamanho de iões, a química e a natureza da amostra. Pode ser muito elevada, por meio de uma combinação de tempo e desvio propriedades de ionização. Quando é sempre possível, com hífen GC-IMS são preferidos. Por si só IMS é superior ao MS e GC no que diz respeito aos serviços públicos, o consumo de gás, não há vácuo é necessária e requisitos de potência relativamente baixa.

Para espectrometria, a 95 MBq fonte

63Ni ß-radiação foi aplicado para a ionização do gás portador (ar sintético). Geralmente, o número total de iões formados é ligeiramente inferior em comparação com 95 MBq até 550 MBq. Como resultado, o número total de iões, com o pico de ião reagente em ar sintético irá diminuir o intervalo linear marginalmente. Para os casos de aplicação como a análise da respiração em sua maioria trabalhando em limites de detecção de análise, a ocorrência de análise desempenha um papel mais importante do que a gama linear. Como mostrado mais adiante neste documento, o poder de discriminação e a detecção das análises em ar exalado não são afetados pela diferença na atividade da fonte de ionização.

O espectrômetro foi conectado a um MCC polar que funcionava como uma unidade de pré-separação. Para MCC, as análises de ar exalado foram enviados através de 1000 capilares paralelos, cada um com um diâmetro interno de 40 um e uma espessura de filme de 200 nm. O diâmetro total da coluna de separação foi de 3 mm.

O ar exalado dos indivíduos foi feita diretamente através do espirômetro usando um bocal padrão contendo um sensor de ultra-som, sem registrar a 500 ml de volume morto na expiração. O conteúdo de uma ansa de amostragem de 10 ml foram adicionados à entrada do MCC e transportado para o IMS, que foi directamente ligado à região de ionização depois de pré-separação. O tubo de MCC e deriva foram mantidas a 40 ° C. A transportadora e deriva de gás utilizado foi ar sintético (Nippon Megacare, Tóquio, Japão)

A análise estatística

Os picos foram caracterizados usando Visual Agora 2.2 software (B S Analytik, Dortmund Alemanha). [14], [22] – [25]. Todos os picos encontrados foram caracterizados pela sua posição com o tempo de deriva (correspondendo 1 /K

0-valor) e tempo de retenção, e a sua concentração relacionada com a altura do pico (tabela 1). Os pormenores do processo de análise de dados foram realizados com base nos métodos descritos em detalhe previamente [15], [22] – [26] e aqui resumido [27] – [31].

para os diferentes grupos e cada dos picos, as parcelas da caixa de bigodes foram gerados. A soma classificação foi fornecido pelo teste de Wilcoxon-Mann-Whitney usando a correção de Bonferroni. Visual Agora 2.2 foi usado para classificar os picos com maior diferença entre os grupos

A relação entre os picos encontrados em BioScout ea análise foi realizada por comparação utilizando o banco de dados Visual agora Versão 110801 (B . S Analytik, Dortmund, Alemanha), obtido por meio de medições descritas anteriormente [11], [32] – [34]. No presente trabalho, os picos foram correlacionados com a análise mais próxima do banco de dados de referência e em comparação com a posição real do pico.

Resultados

Todos os cânceres de pulmão foram histologicamente comprovada por amostras de biópsia broncoscopia. Em 28 pacientes, a biópsia transbrônquica em lesões pulmonares periféricas utilizando tanto a ultrassonografia endobrônquica com guia-bainha e navegação broncoscopia virtual foi confirmada. Em 22 pacientes, lesões traqueobrônquicas localizados centralmente poderia ser directamente confirmada. Os tipos de câncer de pulmão foram: 32 adenocarcinomas, 10 carcinomas de células escamosas e 8 carcinoma de pequenas células. Dos 32 pacientes com adenocarcinoma, 14 foram considerados positivos para a mutação do EGFR, 14 foram negativos para a mutação do EGFR e 4 pacientes eram positivos para a fusão quinase de linfoma anaplásico (ALK). Lung TNM câncer de estadiamento mostrou: Estágio 1 = 13 pacientes, fase 2 = 6 pacientes, o estágio 3 = 8 pacientes e estágio 4 = 23 pacientes. Sete dos 39 voluntários saudáveis ​​e 33 de 50 pacientes com câncer de pulmão tinham histórias para fumantes (Tabela 2).

Um total de 115 picos diferentes foram comparados com relação ao poder de separação em pacientes com cancro do pulmão e voluntários saudáveis ​​(Fig. 1). Dez picos de VOC foram identificados com significância superior a 95% (p 0,01) em pacientes com câncer de pulmão. Destes, pico-2, que tem a mais forte pico de VOC, é anotada como n dodecano utilizando o banco de dados IMS e era capaz de separar os valores com uma sensibilidade de 70,0% e uma especificidade de 89,7%. Os outros 9 picos de COV também foram identificados utilizando a base de dados (tabela 3). Além disso, utilizando um algoritmo de árvore de decisão com n dodecano como ponto de partida, uma sensibilidade de 76%, especificidade de 100%, 100% de PPV e NPV de 76,4% foram registados (Fig. 2).

um 100-15 picos de VOC foram detectados com espectrometria de mobilidade iônica em pacientes com câncer de pulmão e em voluntários saudáveis.

Comparando picos de COV entre adenocarcinoma e indivíduos saudáveis, 11 picos de VOC foram encontrados ter significado maior do que 95% (p 0,01) e n dodecano (pico-2) era capaz de separar os valores com uma sensibilidade de 81,3% e uma especificidade de 89,7% (Fig. 3). Além disso, os pacientes de adenocarcinoma 14 pulmonares positivos para a mutação do EGFR exibida uma significativamente maior pico n dodecano COV do que para pacientes com adenocarcinoma 14 pulmonares negativos para a mutação do EGFR, sem 4 pacientes positivos para a fusão ALK (p 0,01), com uma sensibilidade de 85,7% . e uma especificidade de 78,6% (. Figs 4 e 5)

Peak 2 foi significativamente maior em pacientes com cancro do pulmão (p 0,001). A caixa representa os percentis 25 e 75, os bigodes representam o intervalo, ea caixa forrada representa a mediana, enquanto círculos representam a média. pacientes de adenocarcinoma de pulmão revelou um significativamente maior pico de n-Dodecane VOC de voluntários saudáveis ​​e o pico de n-Dodecane VOC poderia separar os valores com uma sensibilidade de 81,3% e uma especificidade de 89,7%.

Catorze pacientes com mutação EGFR exibido significativamente maior pico de n-Dodecane com uma sensibilidade de 85,7% e uma especificidade de 78,6% (p 0,01). do que nos 14 pacientes de adenocarcinoma sem a mutação EGFR

Comparando picos de COV entre carcinoma de células escamosas e o grupo saudável, 11 picos de COV foram encontrados a ter um significado mais elevado do que 95% e de pico-69 era capaz de separar o melhor valor, com uma sensibilidade de 97,4 e uma especificidade de 60,0% (p 0,001) . Comparando os picos de COV entre carcinoma de pequenas células e indivíduos saudáveis, pico-6 verificou-se ser significativamente mais elevada do que 95% (p 0,01) com uma sensibilidade de 97,4% e uma especificidade de 50,0%. Além disso, um algoritmo de árvore de decisão poderia separar tipos histológicos de câncer de pulmão e em voluntários saudáveis ​​(Fig. 6).

Discussão

Neste estudo prospectivo, os padrões máximos de COV utilizando uma decisão algoritmo de árvore foram úteis para a detecção de câncer de pulmão. Descobrimos que alguns picos de VOC exibido diferenças significativas entre pacientes com adenocarcinoma, o carcinoma de células escamosas, carcinoma de pequenas células e em voluntários saudáveis. Além disso, alguns picos VOC positivos para a mutação do EGFR exibida aumentos significativos, especialmente o pico n dodecano, que era a mais valiosa biomarcador. análise de VOC usando IMS é esperado para ser um teste de detecção importante para o câncer de pulmão. Para o nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a mostrar que a análise n-Dodecane de pacientes de adenocarcinoma pode ser útil para discriminar para a mutação EGFR.

análise de VOC de câncer de pulmão usando GC /MS tem sido amplamente utilizado desde 1985 . Em GC /MS, alguns modelos de COV foram usadas para analisar significado, com uma sensibilidade e especificidade de 54 a 100% e 67 a 100%, respectivamente [35]. Westhoff et ai. foi o primeiro a relatar análise de VOC para câncer de pulmão usando IMS. Ele relatou que 23 picos de COV do ar exalado pode separar o cancro do pulmão e um controle saudável, não afetado pela história de tabagismo [11]. No entanto, as tecnologias de espectrometria por amostragem respiração foram afetados pelas condições ambientais, odor bucal e nutrição. amostragem das vias aéreas direto de acordo com a broncoscopia foi insignificante para o odor oral e alguns picos de VOC exibido diferenças significativas entre o local do tumor do pulmão e do site normal. Além disso, alguns picos de VOC, 2-butanol, 2-metilfurano e n-Nonanal, provaram ser úteis para o adenocarcinoma separada e carcinoma de células escamosas [36] – [37]. Para adenocarcinoma de pulmão, n-Dodecane foi encontrado para ser um importante pico de VOC, tanto para a análise da respiração e amostragem broncoscopia e foi relatado para ser associado a pacientes com câncer de pulmão [36] – [37].

É conhecida que os pacientes do Leste asiático NSCLC ter instâncias mais elevadas de mutação EGFR [38] – [40]. mutações motorista, incluindo EGFR, têm-se centrado sobre o câncer de pulmão e outros tumores malignos [41] – [43]. A mutação do EGFR tem um exemplo maior do que outras mutações condutoras no cancro do pulmão e é sensível ao inibidor da tirosina-cinase EGFR. Os resultados deste estudo mostram que o adenocarcinoma do pulmão positivo para a mutação do EGFR tende a aumentar a intensidade de alguns picos de VOC utilizando IMS. EGFR pode ter um metabolismo específico que podem produzir vários compostos orgânicos voláteis. A detecção da mutação EGFR precisa peça cirúrgica, broncoscopia ou de tecidos agulha de biópsia guiada por tomografia computadorizada, fluido de lavagem brônquica e derrame pleural com célula de tumor. Um condensado do ar exalado estudo anterior relatou poderia avaliar mutação EGFR. No entanto, ainda era difícil de detectar mutações EGFR em condensado do ar exalado, porque componentes celulares apresentados no condensado do ar exalado não são representativos do tumor [44] – [45]. A análise dos padrões de COV, incluindo um algoritmo de árvore de decisão pode ser útil para detectar a mutação EGFR emitida a partir de linhas celulares de cancro de pulmão no futuro.

Este estudo teve algumas limitações. Em primeiro lugar, o tamanho da amostra era pequena e estudos de amostras maiores são necessários. Embora mais amostras de respiração do paciente são necessárias para superar possíveis problemas com pesquisas estatísticas, em tamanhos de amostra literatura anteriores para análise da respiração tivesse sido menor quando comparado com o presente estudo [36] – [37]. Ao lado do grande questão a ter mais amostras de respiração de pacientes do que picos para superar possíveis problemas com pesquisas estatísticas em geral, aqui 89 amostras foram investigados e 115 picos foram encontrados. Em segundo lugar, VOCs em pacientes com câncer de pulmão pode ser afectada pelo fumo história. Deve notar-se, se as diferenças não foram relacionados ao fumo do tabaco em pacientes com câncer de pulmão, que foi considerado em detalhe por Westhoff et al. [11] mostrando, que em ambos os grupos, incluindo um maior número de fumantes e não-fumantes a diferenciação por espectrometria de mobilidade iônica foi bem sucedida. Para as moléculas investigadas pela IMS no presente estudo, as diferenças eram independentes de tabagismo e significativo para ambos os grupos. No estudo de Westhoff et ai. [11]. não havia nenhuma base de dados disponíveis para identificar a análise. Recentemente, Darwiche et ai. [36] mostrou por comparação das medidas a recolha de amostras de ar a partir do mesmo paciente no local de cancro e de não-cancro local durante broncoscopia, diferenças encontradas estavam relacionados com o local da amostra foi feita, directamente sobre as células cancerosas ou de outro local de pulmão . Em terceiro lugar, de acordo com as normas japonesas, as restrições de fontes de

63Ni β-radiação de menos de 100 MBq foram definidas para este estudo piloto japonês, que é menor do que as restrições europeias. No entanto, os resultados do estudo atual mostram que IMS com uma fonte de β-radiação 95 MBq poderia discriminar entre os voluntários saudáveis ​​e pacientes com câncer de pulmão com êxito. Por conseguinte, a criação de uma base de dados para a população Asiática, em relação aos picos de VOC e de substâncias pode ser necessária. Em estudos futuros, os ensaios multicêntricos usando IMS são necessários para analisar o cancro do pulmão.

Reconhecimentos

Os autores gostariam de agradecer ao Sr. Jason Tonge para preparação do manuscrito.