Abstract

quinases timidina (TKS) foram considerados um dos potenciais alvos para terapêutica anti-cancro devido às suas expressões elevados em células cancerosas. No entanto, os análogos de nucleobases segmentação TKs têm demonstrado fraca citotoxicidade selectiva em células de câncer, apesar de a atividade antiviral eficaz. 3′-desoxitimidina phenylquinoxaline conjugado (dT-QX) foi concebido como um romance analógico nucleobase alvo TKs em células cancerosas e replicação celular bloco via porção quinoxalina intercalante de ADN conjugado. In vitro de rastreio de células mostraram que a DT-QX mata selectivamente uma variedade de células cancerígenas, incluindo carcinoma de fígado, células de adenocarcinoma da mama e glioma cerebral; Considerando que tinha uma citotoxicidade baixa em células normais, tais como células de fígado humano normal. A actividade anti-cancro de dT-QX foi atribuída à sua inibição selectiva da síntese de ADN, resultando em extensa estresse superóxido mitocondrial em células de cancro. Nós demonstramos que a ligação covalente com 3′-desoxitimidina porção citotóxica dirigida exclusivamente para phenylquinoxaline mais células cancerosas do que células normais. Estudo preliminar do rato com o modelo de tumor do fígado subcutânea mostrou que a DT-QX efetivamente inibiu o crescimento de tumores. dT-QX é a primeira molécula de seu tipo com componentes altamente modificável que exibe este citotoxicidade selectiva em células cancerosas

Citation:. Wei Q, Zhang D, Yao A, Mai L, Zhang Z, Zhou Q (2012 ) desenho, Synthesis, e in vitro e in vivo Estudos biológicos de um conjugado 3′-desoxitimidina que, potencialmente, mata as células cancerosas selectivamente. PLoS ONE 7 (12): e52199. doi: 10.1371 /journal.pone.0052199

editor: Kamyar Afarinkia, Univ of Bradford, Reino Unido

Recebido: 02 de agosto de 2012; Aceito: 12 de novembro de 2012; Publicação: 26 de dezembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 ZHOU et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho é suportado pelo Programa Nacional de Pesquisa básica da China (2011CB933100), os Fundos investigação fundamental para as universidades Central (HUST: 2010ZD023), eo Importante Science Tecnologia Projetos Específicos (2009ZX09301-014). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Com cânceres sendo a principal causa de morte a nível mundial, o desenvolvimento de agentes anticâncer seguros e eficazes permanece na necessidade urgente. terapia orientada molecularmente tem sido o foco para o desenvolvimento recente de drogas anti-cancro, como pode ser visto no exemplo de sorafenib [1], [2]. Sorafenib é um inibidor da quinase de multi-tirosina que podem potencialmente minimizar os efeitos adversos, tais como hepatotoxicidade provocada por outras fármacos anti-cancerígenos, incluindo 5-fluorouracilo e doxorrubicina [3], [4]. Semelhante a tirosina quinases, quinases da timidina (TK) foram considerados outro alvo potencial anticanceroso [5] – [8]. TK são os primeiros enzimas na via de fosforilação de salvamento timidina timidina conversão à sua forma 5′-fosfato para a síntese de ADN. Em células de mamífero normais, a TKS citosólica só estão presentes a um nível baixo na fase S de células; Considerando que o nível elevado de TK foram observadas em células infectadas por vírus e que proliferam rapidamente células cancerosas [5] -. [8], por exemplo, tumores do pulmão e tecidos de cancro da mama [9], [10]

nucleot�icas análogos segmentação TK, tais como o AZT e aciclovir tem sido demonstrado actividade antiviral eficaz [11], [12]. No entanto, os efeitos do cancro selectividade e forte pobres colaterais foram associados com análogos de nucleobases incluindo agente de captura de neutrões conjugado 5-timidina boro e desoxiuridina iodado radioisotópica [13], [14]. Recentemente, uma terapia de combinação utilizando quinase timidina predelivered seguido por análogos de nucleobases foi investigada em pacientes com câncer de fígado com efeitos limitados alcançado [15]. Isto é provavelmente devido a que os análogos de nucleobases orientada TKS, tais como o AZT são rapidamente removidos por processos de reparação de nucleobases depois de serem incorporadas na síntese do ADN das células cancerosas através da via de salvamento timidina [16] – [18]. 5-Fluorouracilo, outro análogo timina, é um inibidor de redutase dihyrofolate e provoca directamente citotoxicidade em hepatócitos normais [3], [19]. Portanto, é necessário projeto alternativo de análogos de nucleobases mais eficazes que visem TKs.

Nós relatamos aqui um romance 3′-desoxitimidina phenylquinoxaline conjugado (dT-QX, Figura 1) que mata seletivamente uma variedade de células cancerosas, mas não hepatócitos normais. Estruturalmente, a DT-QX é um 3′-triazol-3′-desoxitimidina ligada a uma porção quinoxalina intercalante de ADN. dT-QX foi concebido para orientar a via de salvamento timidina com base no facto de os derivados de triazol da timidina 3′-quinases são reconhecidos por timina humanos [20], [21]. O objectivo da adição da porção quinoxalina em estrutura dT-QX foi para bloquear a remoção celular de análogos de timidina [16] – [18] por meio de intercalação de ADN na síntese de ADN de células de cancro, porque porção quinoxalina é um intercalador de ADN conhecido [22]. Além disso, a estrutura quinoxalina podem ser convenientemente sintetizados por um passo de condensação de um composto dicetona 1 [23] e uma orto-fenilenodiamina (Figura 1). Mais importante ainda, a estrutura quinoxalina é altamente susceptível de modificação para modificações químicas com uma variedade de substituintes para o estudo estrutura-actividade avançado para optimizar a actividade biológica potencial. A actividade anti-cancro de dT-QX, em seguida, foi avaliada utilizando um painel de células cancerígenas. Os efeitos de dT-QX em inibir a síntese de ADN e indutoras de stress oxidativo celular também foram investigados. Finalmente, a inibição do crescimento do tumor por dT-QX foi avaliado em ratinhos portadores de tumores subcutâneos do fígado.

Materiais e Métodos

síntese |

Todos os produtos químicos foram adquiridos a partir de Sigma-Aldrich (WI, EUA), J K Scientific Ltd. (Pequim, China), ou Sinopharm Reagente Chemical Co., Ltd. (Xangai, China) e utilizado sem purificação adicional. Os espectros de RMN foram registados com Bruker Avance-400 espectrómetro de RMN (Madison, WI, EUA). As abreviaturas utilizadas para os padrões de separação de sinais de protão de RMN são: singleto (s), dupleto (d), tripleto (t), quarteto (q), quinteto (Qui), multipleto (m) e sinal largo (br). espectroscopia de massa por ionização por electropulverização análise (ESI-MS) foi realizada com um espectrómetro de massa Thermo Fisher TSQ Quantum Max Triplo Quadrupolo Fase (MA, EUA). O Composto 1 foi obtido como descrito anteriormente [23]

6-Bromo

N

-.. (Prop-2-inil) hexanamida (2)

A uma solução de de 6-bromo-hexanóico ácido (694 mg, 3,56 mmol) em CH seco

2Cl

2 cloridrato de propargilamina (50 mL) foram adicionados (300 mg, 3,28 mmol), trietilamina (332 mg, 3,28 mmol) e 1- (3-dimetilaminopropil) -3-etilcarbodiimida (630 mg, 3.28mmol). A mistura de reacção foi agitada sob N

2 durante 16 h à temperatura ambiente. A solução resultante foi extraída com CH

2Cl

2 (150 mL x 3). As camadas orgânicas foram recolhidas, lavadas com salmoura (250 mL), secou-se com MgSO

4 e concentrou-se. A separação cromatográf ica de flash (0-40% de EtOAc em hexano) proporcionou 2 como 1:01 syn /anti mistura-amida como um óleo incolor (390 mg, 1,68 mmol) com um rendimento de 51%.

1 H-NMR (CDCl

3, 400 MHz, 01:01 sin /anti):

δ

= 5,71 (br s, 1H; NH), 4,05 (dd,

3J

(H, H) = 5,2 Hz,

4J

(H, H) = 2,5 Hz, 2H; CH

2), 3,53 (t,

3

J

(H, H) = 6,6 Hz, 1H; 0.5CH

2), 3,40 (t,

3

J

(H, H) = 6,7 Hz, 1H; 0.5CH

2), 2,24-2,19 (m, 3H; CH, CH

2), 1,87 (qui,

3J

(H, H) = 7,2 Hz, 1H; 0.5CH

2), 1,79 (qui,

3J

(H, H) = 7,0 Hz, 1H; 0.5CH

2), 1,67 (qui,

3J

(H, H) = 7,52 Hz, 2H; CH

2), 1,50-1,41 ppm (m, 2H; CH

2);

13 C RMN (CDCl

3, 100,6 MHz, 01:01 syn /anti):

δ

= 172,3, 172,2, 79,5, 71,6, 44,8, 36,1, 36,1, 33,5, 32,4, 32,2 , 29,1, 27,7, 26,4, 24,7, 24,5 ppm (Figura S1); HRMS calculado para C

9H

15BrNO [M + H]

232,0337 e [M + 2 + H]

234,0316, encontrado 232,0324 e 234.0413.

N

-(Prop-2-ynyl)-6-(4b,8,8-trimethyl-9,10-dioxo-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octahydrophenanthren-2-yloxy)hexanamide (3).

A uma solução de 2 (390 mg, 1,68 mmol) em DMF seco (50 mL) foram adicionados 1 (355 mg, 1,30 mmol) e carbonato de potássio (1,8 g, 13,0 mmol). A mistura de reacção foi agitada sob N

2 durante 16 h à temperatura ambiente e depois acidificada para pH 5 com HCl a 5N. A solução resultante foi extraída com CH

2Cl

2 (150 mL x 3). As camadas orgânicas foram recolhidas, lavadas com salmoura (250 mL), secou-se com MgSO

4 e concentrou-se. A separação cromatográf ica de flash (0-40% de EtOAc em hexano) obteve-se 3 como um óleo amarelo (320 mg, 0,76 mmol) com um rendimento de 58%.

1H NMR (CDCl

3, 400 MHz):

δ

= 7,53 (d,

4J

(H, H) = 2,9 Hz, 1H; CH ), 7,35 (d,

3J

(H, H) = 8,8 Hz, 1H; CH), 7,21 (dd,

3J

(H, H) = 8,7 Hz,

4J

(H, H) = 2,7 Hz, 1H; CH), 5,94 (br s, 1H; NH), 4,04 (dd,

3J

(H, H) = 5,3 Hz,

4J

(H, H) = 2,6 Hz, 2H; CH

2), 4,00 (t,

3J

(H, H) = 6,4 Hz, 2H; CH

2), 2,65 (s, 1H; CH), 2,53 (d,

3J

(H, H) = 14,3 Hz, 1H, CH), 2,24 (t,

3J

(H, H) = 7,6 Hz, 2H; CH

2), 2,21 (d,

4J

(H, H) = 2,5 Hz, 1H; CH), 1,82-1,70 (m, 4H; 2CH

2), 1,56-1,31 (m, 7H; 3CH

2, CH), 1,18 (s, 3H; CH

3), 0,95 (s, 3H; CH

3), 0,38 ppm (s, 3H; CH

3);

13 C RMN (CDCl

3, 100,6 MHz):

δ

= 199,0, 181,3, 172,4, 158,1, 142,6, 134,6, 126,1, 124,2, 112,6, 71,7, 68,9, 68,1, 41,9, 39,2, 39,0, 36,3, 36,3, 35,5, 31,4, 29,7, 29,2, 28,9, 25,7, 25,2, 24,3, 18,8 ppm (Figura S2); HRMS calculado para C

26H

34NO

4 [M + H]

424,2488, encontrado 424.2487.

N

-(Prop-2-ynyl)-6-(4b,8,8-trimethyl-4b,5,6,7,8,8a-hexahydrodibenzo[a,c]phenazin-2-yloxy)-hexanamide (4).

A uma solução de 3 (320 mg, 0,76 mmol) em tolueno (25 mL) foram adicionados

O

-fenilenodiamina (103 mg, 0,95 mmol) e gel de sílica ( 300 mg). A mistura de reacção foi submetida a refluxo sob N

2 durante 18 h e depois concentrou-se. A separação cromatográf ica de flash (0-40% de EtOAc em hexano) deu origem a 5 como um sólido amarelo (230 mg, 0,46 mmol) com um rendimento de 61%.

1 H-NMR (CDCl

3, 400 MHz):

δ

= 8,09-8,07 (m, 3H; 3CH), 7,73-7,67 (m, 2H; 2CH), 7,30 (d,

3J

(H, H) = 8,8 Hz, 1H; CH), 7,02 (dd,

3J

(H, H) = 8,4 Hz,

4J

(H, H) = 2,8 Hz, 1H; CH), 5,71 (br s, 1H; NH), 4,14-4,06 (m, 4H; 2CH

2), 2,88 (s, 1H; CH), 2,56 (d largo,

3J

(H, H) = 14 Hz, 1H, CH), 2,28-2,23 (m, 3H; CH

2, CH) , 1,89-1,73 (m, 4H; 2CH

2), 1,59-1,47 (m, 7H; 3CH

2, CH), 1,02 (s, 3H; CH

3), 0,99 (s, 3H; CH

3), 0,16 ppm (s, 3H; CH

3);

13 C RMN (CDCl

3, 100,6 MHz):

δ

= 172,4, 158,0, 154,8, 148,4, 141,9, 141,3, 137,6, 134,8, 129,2, 129,1, 129,0, 128,6, 125,0, 118,1, 111,2, 79,6, 71,6, 67,7, 59,7, 42,0, 37,3, 36,3, 36,1, 36,0, 34,8, 31,5, 29,2, 29,1, 25,8, 25,3, 22,1, 19,0 ppm (Figura S3); HRMS calculado para C

32H

38N

3O

2 [M + H]

496,2964, encontrado 496.2964.

N

-((1-(2-(Hydroxymethyl)-5-(5-methyl-2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimidin-1(2H)-yl)-tetrahydrofuran-3-yl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl)-6-(4b,8,8-trimethyl-4b,5,6,7,8,8a-hexahydrodibenzo[a,c]phenazin-2-yloxy)hexanamide (DT-QX).

A uma solução de 4 (100 mg, 0,2 mmol) em 5 mL de DMF e 10 mL de CH

2Cl

2 foram adicionados a 3′-azido-3′- desoxitimidina (54 mg, 0,20 mmol) e uma solução aquosa de ascorbato de sódio (40 mM, 15 ml). A mistura reaccional foi purgada com N

2 durante 10 min, e CuSO

4 · 5H

foi adicionado 2O (8 mg, 0,03 mmol). A mistura de reacção foi então agitada sob atmosfera de N

2, à temperatura ambiente durante 12 h. A solução resultante foi extraída com CH

2Cl

2 (150 mL x 3). As camadas orgânicas foram recolhidas, lavadas com salmoura (200 mL), secou-se com MgSO

4 e concentrou-se. A separação cromatográf ica de flash (0-7% de MeOH em CH

2Cl

2) proporcionou dT-QX como um sólido branco (114 mg, 0,15 mmol) com um rendimento de 75%.

1H NMR (DMSO

d

6

, 400 MHz):

δ

= 11,35 (s, 1H, OH), 8,34 (t,

3

J

(H, H) = 5,5 Hz, 1H; CH), 8,14-8,11 (m, 2H; 2CH), 8,06-8,04 (m, 1H; CH), 7,96 (d,

4

J

(H, H) = 2,8 Hz, 1H; CH), 7,79 (m, 3H; 2CH, NH), 7,39 (d,

3

J

(H, H) = 8,7 Hz, 1H; CH), 7,11 (dd,

3

J

(H, H) = 8,5 Hz,

4

J

(H, H ) = 2,8 Hz, 1H; CH), 6,40 (t,

3

J

(H, H) = 6,6 Hz, 1H; CH), 5,36-5,33 (m, 1H; CH), 5,28 (t,

3

J

(H, H) = 5,2 Hz, 1H; NH), 4,31 (d,

3

J

(H, H) = 5,5 Hz, 2H; CH

2), 4,18 (m, 1H; CH), 4,06 (t,

3

J

(H, H) = 6,4 Hz, 2H; CH

2), 3,67-3,60 (m, 2H; CH

2), 2,85 (s, 1H; CH), 2,67-2,57 (m, 2H; CH

2), 2,16 (t,

3

J

(H, H) = 7,4 Hz, 2H; CH

2), 1,79-1,62 (m, 5H; CH

3, CH

2), 1,56-1,43 (m, 10H; 5CH

2), 0,93 (s, 3H; CH

3), 0,91 (s, 3H; CH

3), 0,07 ppm (s, 3H; CH

3 );

13 C RMN (DMSO

d

6

, 100,6 MHz):

δ

= 172,0, 163,6, 157,4, 154,2, 150,4, 147,5, 145,2, 141,1, 140,9, 137,1, 136,1, 134,1, 129,5, 129,4, 128,9, 128,4, 125,3, 122,4, 117,7, 110,8, 109,5, 84,4, 83,8, 67,4, 60,6, 59,0, 58,5, 41,2, 37,0, 36,8, 35,5, 35,1, 34,9, 34,4, 34,0, 31,3, 28,5, 25,2, 24,9, 21,6, 18,5, 12,2 ppm; HRMS calculado para C

42H

51N

😯

6 [M + H]

763,3932, encontrado 763.3959 (Figuras S4 e S5).

4b, 8, 8-trimetil-9,10-dioxo-4b, 5,6,7,8,8a, 9,10-octahydrophenanthren-2-il 4-metil-piperazina-1-carboxilato de (5).

a uma solução de 1 (650 mg, 2,39 mmol) em DMF (30 mL) foram adicionados cloridrato de 4-metil-1-piperazinacarbonilo cloreto (630 mg, 3,16 mmol) e carbonato de potássio (3,4 g, 24 mmol). A mistura de reacção foi agitada sob N

2 durante 18 h e, em seguida, acidificou-se para pH 5 com HCl a 5N. A solução resultante foi extraída com CH

2Cl

2 (150 mL x 3). As camadas orgânicas foram recolhidas, lavadas com salmoura (250 mL), secou-se com MgSO

4 e concentrou-se. A separação cromatográf ica de flash (0-25% de EtOAc em hexano) deu origem a 5 como um óleo amarelo (730 mg, 1,83 mmol) com um rendimento de 77%.

1 H-NMR (CDCl

3, 400 MHz):

δ =

7,86 (s, 1H; CH), 7,49 (s, 2H; 2CH), 3,71 (s largo, 2H; CH

2), 3,61 (s largo, 2H; CH

2), 2,69 (s, 1H; CH), 2,58 (d,

3

J

(H, H) = 13,3 Hz, 1H; CH), 2,49 (s largo, 4H; 2CH

2), 2,37 (s, 3H; CH

3), 1,47-1,42 (m, 5H; 2CH

2, CH ), 1,23 (s, 3H; CH

3), 0,98 (s, 3H; CH

3), 0,41 ppm (s, 3H; CH

3);

13 C RMN (CDCl

3, 100,6 MHz): δ 198,2, 180,6, 152,5, 149,8, 147,4, 134,6, 129,4, 126,3, 122,5, 68,7, 53,7, 53,6, 41,7, 39,5, 38,7, 36,2, 36,1 , 35,5, 31,2, 26,9, 24,2, 24,2, 18,7 ppm (Figura S6); HRMS calculado para C

23H

31N

2O

4 [M + H]

299,2284, encontrado 299,2294.

4b, 8,8-Trimetil-4b, 5,6,7,8,8a-hexa-hidrobenzo [a, c] fenazin-2-il 4-metilpiperazina-1-carboxilato de etilo (Pip-QX).

a uma solução de 5 (330 mg, 0,83 mmol) em tolueno (25 mL) foram adicionados

O

-fenilenodiamina (100 mg, 0,92 mmol) e gel de sílica (300 mg). A mistura de reacção foi submetida a refluxo sob N

2 durante 18 h e depois concentrou-se. A separação cromatográf ica de flash (0-3% de MeOH em CH

2Cl

2) proporcionou Pip-QX como um óleo amarelo (310 mg, 0,66 mmol) com um rendimento de 79%.

1H NMR (DMSO

d

6

, 400 MHz):

δ

= 8,14-8,05 (m, 3H; 3CH), 7,81-7,79 (m, 2H ; 2CH), 7,49 (d,

3

J

(H, H) = 8,4 Hz, 1H; CH), 7,29 (dd,

3

J

(H , H) = 8,4 Hz,

4

J

(H, H) = 2,4 Hz, 1H; CH), 3,63 (s largo, 2H; CH

2), 3,46 (s largo , 2H; CH

2), 2,88 (s, 1H; CH), 2,58 (m, 1H; CH

2), 2,38 (s largo, 4H; 2CH

2), 2,16 (s, 3H; CH

3), 1,51-1,38 (m, 5H; 2CH

2, CH), 0,96 (s, 3H; CH

3), 0,90 (s, 3H; CH

3 ), 0,06 ppm (s, 3H; CH

3);

13 C RMN (DMSO

d

6

, 100,6 MHz):

δ

= 154,4, 153,3, 150,5, 147,5, 142,3, 141,6, 134,7, 130,2, 130,2, 129,4, 129,0, 125,7, 125,2, 119,3, 58,9, 54,7, 54,6, 46,2, 44,6, 44,0, 41,6, 37,7, 36,1, 35,4, 34,7, 31,8, 22,2, 19,0 ppm (Figura S7); HRMS calculado para C

29H

35N

4O

2 [M + H]

471,2760, encontrado 471,2767.

Estudos Biológicos

O animal protocolo foi aprovado pela Comissão de Revisão da faculdade de Ciência e Tecnologia vida na Universidade Huazhong da Ciência e Tecnologia. linhas celulares de cancro HepG2, Hep3B, MCF-7 e C6 foram obtidas de ATCC (VA, EUA). células células hepáticas humanas HL-7702 e câncer de fígado murino H22 eram de Shanghai Institute of Cell Science Vida Culture Center (Xangai, China). As células foram mantidas em DMEM de alto teor de glucose ou meio RPMI-1640 (Invitrogen, CA, EUA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (FBS), 25 mM de HEPES, 2 mM de L-glutamina, MM aminoácidos não essenciais 0,1, 1,0 piruvato de sódio mM, 50 U /mL de penicilina, e 50 ug /ml de estreptomicina a 37 ° C e 5% de CO

2. As soluções de reserva de dT-QX, Pip-QX ou AZT foram preparadas em DMSO, e o sal cloridrato de doxorrubicina foi directamente dissolvido em água. Todos os produtos químicos biológicos foram obtidos a partir de Sigma Aldrich (WI, EUA), a menos que especificado de outra forma. Todas as experiências foram repetidas, independentemente, pelo menos, três vezes.

ensaio MTT de viabilidade celular.

As células (5000 por poço) foram semeadas em placas de 96 poços em meio de crescimento durante a noite antes de cada tratamento em triplicados. dT-QX, Pip-QX ou AZT estava a uma concentração final de 0, 0,1, 1, 10, 20, 50, 100, ou 200 ^ M com DMSO total de menos do que 0,2%. A doxorubicina foi usada como comparação, a uma concentração final de 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 ou 2,0 uM. Após 72 h, o ensaio de MTT foi realizado como descrito [23]. A viabilidade das células de cada tratamento Representou-se graficamente com o programa GraphPad Prism, e IC

50 valores foram obtidos utilizando análise de dose-resposta sigmoidal fornecida pelo software (versão 4.00, GraphPad Software, CA, EUA).

anti-BrdU ensaio de fluorescência.

Hep3B, HepG2 ou células HL-7702 (50.000 por poço) foram semeadas em meio de crescimento durante a noite em placas de 48 poços e tratadas com 0, 10 ou 50 uM dT-QX para 5 h. Ensaio de Anti-BrdU foi realizada de acordo com a recomendação do fabricante (BD Biosciences, NJ, EUA). Resumidamente, a solução de BrdU (0,1 mg /mL) foi adicionada a cada poço, e as células foram incubadas a 37 ° C durante 3 h. meio celular foi removido e as células foram fixadas com formaldeído a 3,7% em PBS. As células foram permeabilizadas com 0,1% de Triton-100 em PBS e bloqueadas com 3% de FBS em solução de PBS. O ADN celular foi desnaturado por ADNasel (0,3 mg /ml) em solução de PBS. O BrdU incorporada foi corado com anticorpo monoclonal anti-Alexa Fluor®488 BrdU (BD Biosciences, NJ, EUA). Os núcleos foram contra-corados com Hoechst 33342 solução. imagens de células de cada tratamento foram capturados com a Olympus IX71 microscópio invertido equipado com uma câmera digital sob luzes apropriadas. Os impactos de Pip-QX e AZT na síntese de ADN em Hep3B foram avaliados de modo semelhante ao descrito acima.

Estudo de fluorescência da produção de superóxido mitocondrial.

Hep3B ou HL-7702 (50.000 células por poço ) foram semeadas no meio de crescimento durante a noite em placas de 48 poços. As células foram tratadas com 0 ou 50 uM dT-QX durante 8 h e, em seguida, o meio foi removido. Adicionou-se uma solução de MitoSOX indicador vermelho superóxido mitocondrial (Invitrogen, CA, EUA) em PBS e incubou-se a 37 ° C durante 20 min. As células foram então lavadas uma vez com PBS e contra-coradas com Hoechst 33342 solução. imagens fluorescentes foram capturadas com Olympus IX71 microscópio invertido sob luzes apropriadas. O estudo com 100? M de Mn (III) de tetraquis (1-metil-4-piridil) porfirina hidróxido tetratosylate (MnTmPyP, EMD Chemicals, Inc., EUA) como um controlo positivo em células Hep3B foi realizada de forma semelhante.

estudo de tumores em ratinhos fígado subcutânea.

células de cancro do fígado de murino H22 foram inicialmente mantidos no meio de crescimento RPMI-1640 e, em seguida, crescem nos ratinhos BALB /c (Hubei Provincial Laboratory animal Center, China) por via intraperitoneal. Os ratinhos foram sacrificados após 4 dias e H22 células foram colhidas com solução de PBS. As células H22 foram lavadas uma vez com PBS estéril e foram injectados subcutaneamente (3×10

6 células por rato) na parte inferior das costas de ratinhos /c Balb. Uma vez que os tumores atingiram um tamanho médio de (mm 8×8, 340 mm

3), nove ratinhos foram divididos aleatoriamente em três grupos (3 por grupo) e injectados com 100 uL de soro fisiológico (com 0,1% de DMSO), AZT (50 uM em PBS estéril com 0,1% de DMSO) ou dT-QX (50 uM em PBS estéril com 0,1% de DMSO) no local do tumor no dia 1 e no dia 7. o crescimento do tumor e o peso corporal foram monitorizados diariamente. No dia 12 seguiu a primeira injecção, todos os ratinhos foram sacrificados e as imagens dos tumores foram registados. A análise estatística (one way ANOVA com o teste de comparação múltipla de Tukey) dos tratamentos foi realizada utilizando o software GraphPad Prism.

Resultados e Discussão

Síntese de dT-QX foi conseguida por acoplamento AZT com phenylquinoxaline 4 através de cobre (I), reacção catalisada por clique (Figura 2). Intermediário 3 foi obtido a partir de substituição nucleófila de bromoalkyne 2 com terpenone oxidada 1. Phenylquinoxaline 4 foi obtido por condensação com

O

-diaminobenzene e gel de sílica, sob refluxo em tolueno, que foi muito melhor do que o acetonitrilo, DMF ou etanol. A conjugação de AZT com phenylquinoxaline 4 a dT-QX foi realizada com um rendimento de 75% utilizando a redução in situ de cobre (II) por ascorbato [20], [21]. Phenylquinoxaline 4, uma molécula de referência, se verificou ser fracamente solúvel em solução aquosa a 1% de DMSO e, portanto, foi modificado para um

N-metilpiperazina

derivado Pip-QX como mostrado na Figura 2. Pip-QX foi sintetizado um modo semelhante ao dT-QX através de conversão de um derivado piperazina para o 5, seguido por condensação com

o

-diaminobenzene com um rendimento global de 61%. Pip-QX serviu como um dos compostos de referência na sequência de estudos biológicos. Vários lotes de compostos de controlo dT-QX e foram sintetizados, e todos os lotes consistentemente realizada não só em química, mas também em estudos biológicos.

A actividade biológica de dT-QX foi avaliada em primeiro lugar utilizando a viabilidade das células ensaio de um painel de linhas celulares de cancro incluindo carcinoma de fígado humano HepG2 e Hep3B, carcinoma de fígado de rato de H22, adenocarcinoma da mama MCF-7, e células de glioma C6 de cérebro de rato. A linha celular HL-7702 fígado humano foi usado como um representante de células normais no estudo. As células HL-7702 são transformados hepatócitos humanos normais com baixa expressão de marcadores de câncer [24]. O tratamento das células HL-7702 com a dT-QX não resultou em qualquer citotoxicidade significativa a concentrações tão elevadas como 200 uM (Figura 3A). A CE

50 de dT-QX em todas as células cancerosas foi encontrado na faixa de 6,6 a 42,1 mM. A citotoxicidade foi mais pronunciado observado em células de carcinoma hepatocelular humano Hep3B com morte celular superior a 80%, a 20 ^ M, seguido por células de glioma C6 de cérebro adenoma da mama MCF-7 e. Em contraste, Pip-QX não-selectivamente mortas todas as linhas de células, incluindo HL-7702 a 50 ^ M (Figura 3b). O segundo composto de referência, o AZT como um análogo 3′-desoxitimidina, verificou-se exibem baixa citotoxicidade contra estas linhas de células (Figura 3C), enquanto que o co-tratamento de AZT mais Pip-QX também não selectivamente mortas todas as linhas celulares (Figura 3D ), semelhante ao do tratamento Pip-QX sozinho. Estes resultados sugerem que a morte selectiva de células de cancro em relação às células normais do fígado pela DT-QX era devido à conjugação covalente única de phenylquinoxaline porção citotóxica com 3′-desoxitimidina. Em comparação, a doxorrubicina anticancerígeno droga foi encontrada altamente tóxicas para todas estas células. Na verdade, a doxorrubicina foi ainda mais tóxico para o fígado normal de 7702 células do câncer de fígado Hep3B ou H22 células em concentrações superiores a 0,5 mM (Figura 3e).

Um painel de linhas celulares de cancro (cor preta) e um fígado normal, a linha de células de hepatócitos (cor vermelha) foram tratados com um) dT-QX; b) Pip-QX; c) AZT; d) Pip-QX mais AZT e e) a doxorrubicina, respectivamente. A viabilidade das células foi avaliada após 72 h de incubação por ensaio MTT. A percentagem de viabilidade foi calculada e equipado com as curvas de dose-resposta utilizando o software GraphPad Prism. Todos os tratamentos foram realizados em triplicado e repetidos pelo menos três vezes.

Para entender melhor a citotoxicidade selectiva de dT-QX em relação às células cancerosas, que inicialmente investigada a proliferação de células utilizando o ensaio de fluorescência de anti-BrdU. BrdU (5-bromo-3′-desoxiuridina) é um análogo da timidina, que é incorporado no genoma da célula uma vez que se replica [25]. Assim, o nível de BrdU no núcleo da célula reflecte o nível de divisão e proliferação celular. Considerando os resultados de viabilidade celular acima, HL-7702 humano, HepG2 e células Hep3B foram investigados como representantes das células normais e cancerosas. O ensaio anti-BrdU foi efectuada a 5 h após o tratamento dT-QX para permitir a acumulação suficiente de composto nas células e para determinar o seu impacto sobre a síntese do ADN celular. O nível de BrdU em núcleos de células foi medido utilizando um conjugado fluorescente anti-BrdU [25] (de cor verde), com núcleos de células contra-coradas pela Hoechst 33342 (cor azul), como mostrado na Figura 4.

ensaio BrdU foi realizado após as células tratadas com compostos durante 5 h. O BrdU incorporada foi corado com o anticorpo monoclonal anti-BrdU Alexa Fluor®488 (cor verde) com núcleos de células contra-corados com Hoechst 33342 (cor azul). a) A incorporação de BrdU em células HL-7702, as células HepG2 ou Hep3B tratadas com DMSO ou dT-QX; b) As células BrdU incorporação inHep3B tratado com DMSO, AZT ou Pip-QX.

Nas células HL-7702 humanas normais, tratamentos de DMSO e dT-QX resultou em níveis semelhantes de incorporação de BrdU em núcleos de células , o que indicou a presença de dT-QX não interferir com a divisão e proliferação celular. No entanto, foi observada uma perda significativa de fluorescência verde em células cancerosas HepG2 e Hep3B com tratamento dT-QX, em comparação com a do controlo de DMSO (Figura 4a). Estes resultados indicaram que a DT-QX inibiu selectivamente a síntese de ADN celular de células HepG2 e Hep3B na fase inicial do tratamento, resultando em morte selectiva tanto de células cancerosas. A inibição da incorporação de BrdU foi muito mais pronunciada em células Hep3B com a perda completa de fluorescência verde nos núcleos celulares (Figura 4a). Isto foi consistente com os resultados de viabilidade celular que a DT-QX foi mais eficaz em matar Hep3B do que as células HepG2. A citotoxicidade mais pronunciada em células Hep3B do que HepG2 pode ser devido ao facto de Hep3B é originado a partir de infecções da hepatite B [26].

Para elucidar quais chemophore de dT-QX foi responsável pela inibição da síntese de ADN, o ensaio de fluorescência de anti-BrdU foi efectuada com AZT ou Pip-QX em células Hep3B (Figura 4b). Tratamento de AZT resultou em nenhuma inibição da síntese de ADN significativa, enquanto Pip-QX inibiu significativamente a síntese de ADN em células, semelhante ao de dT-QX, indicando phenylquaxinoline chemophore foi responsável pela inibição da síntese de ADN observada. Em combinação com os resultados de viabilidade celular, foi sugerido que a conjugação com 3′-desoxitimidina modificado exclusivamente o phenylquinoxaline chemophore citotóxica para torná-lo mais selectiva em relação às células cancerosas do que hepatócitos normais. Estes resultados também confirmaram que a porção de conjugação com quinoxalina 3′-triazol-3′-deoxythymine levou a segmentação selectivamente as células cancerosas, bloqueando a síntese de ADN.

A inibição selectiva da síntese de ADN nuclear por dT-QX em cancro células levou à hipótese de que a dT-QX pode inibir selectivamente a síntese de ADN mitocondrial e causar disfunção mitocondrial bem. Infelizmente, o ensaio de fluorescência de anti-BrdU não foi suficientemente sensível para observar tal inibição em células. Alternativamente, a disfunção mitocondrial devido ao esgotamento do DNA por análogos de nucleósidos tem sido relatada a ocorrer concorrentemente com nível elevado de superóxido na mitocôndria após tratamento durante 4 dias [27]. Portanto, o impacto de dT-QX sobre a função mitocondrial foi avaliada utilizando um ensaio de imagiologia superóxido mitocondrial de fluorescência com base. células Hep3B foram investigados como representante do modelo de célula de câncer por causa da pronunciada inibição da síntese de DNA na fase inicial por dT-QX observado no ensaio anti-BrdU (Figura 4a).

fluorescência vermelha significativo indicativa de produção de superóxido foi detectada em células Hep3B após o tratamento de 50 uM dT-QX durante 8 h que em comparação com DMSO (Figura 5). A presença citosólica de coloração com vermelho de superóxido foi confirmada por núcleos de células de contra-coloração com um corante Hoechst. Verificou-se também que o tratamento de células Hep3B com a dT-QX para um tempo mais curto, tal como 3 ou 5 h não induzir fluorescência vermelha significativa, sugerindo a produção de superóxido mitocondrial foi acumulativo e foi provavelmente devido à inibição da síntese do DNA celular. Além disso, um controlo positivo, com um Mn (III), na qualidade de um -chelator NADPH /GSH: O

2

– oxidorredutase em células [28] resultou num nível semelhante de fluorescência vermelha em células Hep3B para que tratada com dT-QX (veja a Figura S8). Em contraste, a partir do fundo de fluorescência vermelha foi observada em células HL-7702 humanos normais tratados com a dT-QX, semelhante ao tratado com DMSO (Figura 5). Assim, estes resultados sugerem que a DT-QX poderia causar disfunção mitocondrial, induzindo o stress superóxido mitocondrial em células de cancro na sequência da inibição da síntese de ADN.

linha de células de cancro ou células Hep3B HL-7702 normais foram tratadas com DMSO ou 50 uM dT-QX durante 8 h. O nível de superóxido mitocondrial foi detectado com indicador de superóxido mitocondrial MitoSOX (cor vermelha). núcleos celulares foram contra-coradas com Hoechst corante (cor azul).

Um vivo estudo preliminar em antitumoral com dT-QX foi realizado em um modelo de rato. tumores subcutâneos foram estabelecidos com células cancerosas H22 fígado murino [29]. Os tumores foram deixados a alcançar um tamanho médio de 8,8 x 8,8 milímetros. A baixa solubilidade relativa de dT-QX em solução de PBS limitado a via de administração a ser injecções intra-tumorais. Assim, o AZT ou dT-QX (100 mL x 50 ^ M cada) foi injectada directamente nos tumores no dia 1 e no dia 7. Não obstante os tratamentos, nem ratinhos morreram nem houve uma perda de peso corporal significativo observado durante o estudo de 12 dias. O perfil de crescimento do tumor ao longo de 12 dias após a primeira injecção é mostrado na Figura 6a. Os tumores em ratinhos tratados com AZT cresceu rapidamente, semelhantes aos de controlo negativo (solução salina); Considerando que o crescimento do tumor foi significativamente inibido em DT-QX ratinhos tratados (Figura 6a). No dia 12 após a primeira injecção, os tamanhos de tumores em ratinhos injectados com a dT-QX foram claramente menores do que aqueles com AZT ou solução salina (Figura 6b). A análise estatística também confirmou que o tratamento de dT-QX foi significativamente diferente dos outros dois (

P

0,01). Estes resultados sugerem que a injecção intra-tumoral de dT-QX numa dosagem baixa (equivalente a 0,13 mg /kg por ratinho) foi muito eficaz em inibir o crescimento de tumores subcutâneos em um modelo de ratinho.

tumor subcutâneo foi estabelecida através da injecção de células H22 na parte inferior das costas de ratinhos BALB /c por via subcutânea (3 × 10

6 células por ratinho).