-Ras K cancerosas dependentes pulmão de não pequenas células (CPNPC) são ‘viciados’ para autofagia basal que reprograma o metabolismo celular de uma maneira sensível ao lisossômico. Aqui demonstramos que o TBK1 cinase associada ao xenophagy impulsiona autofagia basal, consistente com o seu requisito conhecida na proliferação NSCLC K-ras-dependente. Além disso, a autofagia basal, neste contexto, é caracterizada por sequestro do xenophagy receptor de carga Ndp52 e sua parálogo TAX1BP1, que demonstramos aqui para ser um bona fide

receptor de carga

. Autofagia destes receptores de carga promove não-canônica de sinalização de NF-kB. Propomos que este mecanismo dependente de TBK1 para sinalização de NF-kB contribui para a dependência de autofagia em K-Ras impulsionado NSCLC

Citation:. Newman AC, Scholefield CL, Kemp AJ, Newman M, McIver EG, Kamal A, et ai. (2012) TBK1 Kinase Addiction em células de câncer de pulmão é mediada através Autophagy de TAX1BP1 /Ndp52 e não-Canonical NF-kB Sinalização. PLoS ONE 7 (11): e50672. doi: 10.1371 /journal.pone.0050672

editor: Edward Harhaj, Johns Hopkins School of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 26 de julho de 2012; Aceito: 23 de outubro de 2012; Publicação: 29 de novembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Newman et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho no laboratório SW foi financiado por uma Cancer Research UK Career Development Fellowship (C20685 /A12825), realizada pelo SW. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Ahmad Kamal, Ed McIver e Michelle Newman são funcionários de Tecnologia Conselho de Investigação Médica, Lynton House, 7-12 Tavistock Square, Londres WC1H 9LT, Reino Unido. Medical Technology Research Conselho é dono de um pedido de patente (PCT não WO2010100431) sobre inibidores TBK1 incluindo MRT68601. Estes autores pode, portanto, receber benefícios financeiros a partir de qualquer exploração futura desta patente. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Uma estratégia para atingir a progressão do tumor é identificar vulnerabilidades moleculares específicos conferidos pelo fundo genético. A activação de K-Ras por mutação, ou por outros meios, torna o cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) células “viciado” à presença de TBK1 (cinase de ligação ao tanque 1) proteína para a proliferação e /ou a sobrevivência [1] continuação, possivelmente através da estimulação direta da atividade TBK1 [2]. TBK1 e sua parálogo, IKKε, juntamente com as proteínas e IKKα IKKβ bem caracterizados, constituem uma subfamília de proteínas cinases de serina-treonina [3]. TBK1 e IKKε foram originalmente descrito como mediando NF-kB activação do factor de transcrição [4], [5], [6]. Também foi proposto que a promoção constitutiva de sinalização de NF-kB em células NSCLC, a jusante de K-Ras, podem estar subjacentes TBK1 “dependência” [1]. De facto, a expressão do gene de perfis tem mostrado que um K-Ras conduzido, NF-kB-assinatura como é dependente do gene TBK1 [1]. No entanto, evidências mecanicista para o engajamento NF-kB mediada por TBK1 no câncer tem sido escassa. explicações alternativas de vício TBK1 têm sido propostas, tal como a activação directa da pró-sobrevivência de sinalização de Akt quinase [7], [8]. No entanto, nenhuma contribuição individual de TBK1 é necessariamente mutuamente exclusivos com os outros.

A segunda via envolvida a jusante da activação K-Ras é macroautofagia (autofagia a seguir) [9], [10], [11]. Autophagy é um processo de passos múltiplos a degradação lisossómica [12]. Nos estágios iniciais, dependendo da ação dos genes autofagia essenciais, tais como

Atg5

e

ULK1

, vesículas membranados duplos decorados com proteínas ubiquitina-like da LC3 família /GABARAP, chamados autofagossomas, começam a formar. Estes autofagossomas nascentes coloque ao redor, e sequestram, citosol à medida que amadurecem. Dependendo do contexto, este pode ser um processo não-selectiva ou selectiva, o último envolvendo o sequestro de populações discretas, ou ”, cargas de organelos, proteínas ou outras estruturas, tais como bactérias, no caso do ‘xenophagy’. A selectividade é mediada através de receptores de carga que ligam proteínas LC3 /GABARAP para a carga, em complexos de multi-moleculares presumíveis [12]. Autophagy impactos sobre o destino celular tanto pela presente sequestro selectiva de complexos de carga a partir do citosol e através do subsequente degradação lisossomal dos conteúdos autophagosome, que libera metabólitos para o citosol. Este último passo é inibida pelas drogas lysosomotrophic tais como a cloroquina. Tais compostos são uma classe potencial de agentes para a manipulação terapêutica de autofagia [11], [13].

O papel da autofagia em resposta aguda à mutação Ras não é clara. Demonstrou-se a actuar como um efector de sobrevivência, morte celular ou senescência [9], [14], [15]. No entanto, autofagia basal contínua é inequivocamente necessária para a proliferação e /ou a sobrevivência de células cancerosas conduzido estabelecidos K-Ras [10], [11], [13]. Um papel de autofagia aqui é a regulação do metabolismo celular directa, através de homeostase mitocondrial, o controlo de qualidade de proteínas e /ou remodelação da piscina metabolito celular. Cumulativamente, esses mecanismos de regular o equilíbrio entre a fosforilação oxidativa e glicólise aeróbica [10], [11], [13]. Alguns destes mecanismos são dependentes da degradação lisossomal, tal como mostrado pela sensibilidade dos efeitos metabólicos para agentes lysosomotrophic, tais como a cloroquina. No entanto, isso não tem sido abordada como autofagia é acoplado a jusante do K-Ras. Além disso, não é claro se a autofagia ‘vício’ pode ser explicada apenas por efeitos metabólicos directos ou se sequestração de proteínas específicas modula destino celular, através de alteração de transdução de sinal dentro da célula.

Curiosamente, TBK1 tem sido implicada na autofagia de citosólico

Salmonella spp.

de bactérias no interior das células [16]. A nova proteína de ligação ao receptor de carga e TBK1 xenophagy, Ndp52, reconhece proteínas ubiquitinadas, na superfície de bactérias, e proteínas de ligação ao hidrato de carbono em vesículas hospedeiras ruptura [17], [18]. Um passo não redundante nesta via tem sido recentemente demonstrado ser a fosforilação mediada por TBK1 de um novo receptor de carga novo, Optineurin [16]. A relevância da TBK1 sinalização fora do xenophagy não é clara. No entanto, nós mostramos aqui que a autofagia basal, com alguns paralelos com xenophagy e resultando em volume de negócios de receptores de carga, tais como Ndp52 ea proteína parálogas TAX1BP1, é constitutivamente envolvidos em células NSCLC viciado-TBK1 pela atividade de cinase de TBK1. Nós demonstramos um papel central para este autofagia na condução não-canónica de sinalização de NF-kB mediada por meio do factor de transcrição RelB. Propomos que esta via complementa mecanismos metabólicos diretos na contribuição de autofagia basal de apoiar a proliferação e /ou sobrevivência em células NSCLC. Nossas descobertas, assim, expandir o papel do vício autofagia em câncer impulsionado K-Ras e mostrar interação mecanicista com a via TBK1-NF-kB.

Resultados

Autophagy em K-Ras Dependentes As células do cancro do pulmão é Downstream de TBK1 Kinase

Para investigar o papel do TBK1 em K-Ras autofagia basal conduzido foi desenvolvido um modelo de cultura NSCLC em células A549 K-Ras ‘addicted’ [1]. Descobrimos que o citosol delas continha estruturas puntiformes abundantes que marcadas com proteína de fusão GFP-LC3B, mas não com lípidos unconjugatable-GFP-LC3BΔG- A (Fig. 1a). A abundância de pontos lacrimais-GFP foi dramaticamente LC3B elevado por tratamento com cloroquina (Fig. 1a). De acordo com a metodologia do campo [19], que, em seguida, levou estes LC3B puncta para representar um basal, nível de estado estacionário de autofagossomas. Estes autofagossomas estavam ausentes quando RNAi foi usada para knockdown a autofagia genes

Atg5

e

ULK1

(Fig. 1b-d). RNAi de

TBK1

produziu efeitos similares, posicionando esta quinase a montante da basal abundância autophagosome (Fig. 1b-d). Nós estendida estas descobertas utilizando ensaios autofagia de fluxo em combinação com um membro de uma família recentemente descrita de inibidores enzimáticos de TBK1 (MRT68601, daqui em diante referido como TBKi, Fig. S1) [20]. tratamento com inibidor de células LC3B Tandem-fluorescente A549 [21] resultou na redução tanto autofágica precoce ( ‘verde + vermelho’) puncta LC3B e autofagossomas final ácidas (puncta ‘vermelho’) (Fig. 1e, f). Correspondentemente, a acumulação mediada por cloroquina de lipidada LC3B-II ou GABARAP-II, a forma destas proteínas correlacionaram-se com a formação de autofagossomas, foi impedida por tratamento com inibidor (Fig. 1g). Tomados em conjunto, estes dados mostram que, de facto TBK1 quinase promove autofagia, actuando ao passo precoce de formação autophagosome, em vez de reprimir autophagosome maturação no compartimento lisossómico ácida [19].

A549-GFP ou GFP-LC3B LC3BΔG – a células foram tratados com PBS ou 5 uM de cloroquina (CQ) durante 8 h e células fotografada para GFP. b, c) células A549 GFP-LC3B foram transfectadas com ARNsi indicados durante 72 h (

NTC

= controlo não segmentação) e b), extractos de células transferidas para proteínas indicadas (α-banheira = α-tubulina) ou As células foram c) fotografada para pontos lacrimais GFP-LC3B. d) As células A549 FLAG-HA-LC3B foram transfectadas com o indicado siRNA e pontos lacrimais HA-positiva imunocoradas, fotografadas e contadas às 72 h (n = 3, ± S.E.M., * = p 0,05, ** = p 0,01). e, f) A549 Tandem-fluorescente-LC3B (células tfLC3B) foram tratadas com DMSO ou 1 uM MRT68601 (TBKi) durante 24 h e e), representada por imagem e f) quantificação para o número total de pontos lacrimais autophagic (verde + vermelho) e o subconjunto destes pontos lacrimais com sinal detectável GFP (vermelho), como descrito em detalhe em Materiais e Métodos. g) As células A549 foram tratadas com DMSO ou 10 ^ M MRT68601 (TBKi) durante 24 h na presença ou ausência de PBS ou 5 uM cloroquina (CQ) e extractos celulares riscados para proteínas indicadas. Barras de escala = 50 mm em todos os painéis.

Basal Autophagy Alvos de Carga Receptores Ndp52 e TAX1BP1

autofagia bacteriana (xenophagy) é mediada através TBK1 e seus parceiros de ligação, a carga xenophagy receptores Ndp52 e Optineurin [16], [18]. Em paralelo a isto, nós achamos recrutamento de Ndp52, e o Ndp52 parálogo TAX1BP1, para autofagossomas basais em células A549 (Fig. 2A, C). Também demonstrou uma constitutiva Ndp52-TBK1 complexo e confirmou um relatório anterior que TAX1BP1 poderia ligar TBK1 [22] (Fig. S2a, b). Estes dados implicam que Ndp52 e TAX1BP1 pode estar a ser alvo de sequestro por autofagia basal. Por conseguinte, o tratamento de cloroquina estabilizado TAX1BP1 semelhante a um controlo positivo, o receptor p62 de carga (fig. 2b), e com o aumento concomitante de localização TAX1BP1 para vesículas LC3B-positivos (Fig. 2c). proteínas ubiquitina-like das subfamílias LC3 e GABARAP são capazes de se ligar TAX1BP1, com afinidades variáveis ​​(Fig. 2D). Isto sugere que TAX1BP1 é, como, Ndp52, um

bona fide

proteína receptora de carga. Um apoio adicional para este achado vem da observação de que a exclusão de motivos de ligação putativo LC3 família /GABARAP em TAX1BP1 ablates de localização para autofagossomas (Fig. 2e). Estes motivos incluem tanto um LIR motif “canônica” (região interagindo LC3) (W49, V50, G51, I52) e um motivo de “não-canônica LIR ‘, este último deduziu que, recentemente descrita para a ligação Ndp52 para LC3C (L141, V142, V143) [23] (Fig. 2e, veja também os alinhamentos em Fig. S2c). Consistente com o papel de TBK1 nos processos acima, TBK1 proteína também foi mostrado para localizar a autofagossomas basais (fig. 2f).

A549 células GFP-LC3B foram coradas para Ndp52 e fotografada. b, c) células A549 foram tratados com PBS ou 5 cloroquina uM (CQ) durante a noite e b) extractos de células transferidas para proteínas indicadas (α-banheira = tubulina) ou c) células co-coradas para TAX1BP1 e LC3B, e fotografada pela microscopia confocal. d) 293FT células foram transfectadas com o vector de expressão de myc-TAX1BP1, ou controlo de vector vazio, e os lisados ​​submetidos a puxar para baixo com uma proteína de fusão indicada, tal como descrito em Materiais e Métodos (- = GST única, B = GST-LC3B, C = GST-LC3C, L = GST-GABARAP). e) linhas de células A549 FLAG-HA-TAX1BP1 que expressam estavelmente as variantes indicadas de proteína TAX1BP1 (ver texto) foram tratadas com 5 uM de cloroquina durante a noite e coradas para HA pontos lacrimais. f) as células A549 GFP-TBK1 mCherry-LC3C foram fotografadas (setas indicam colocalisation). Barras de escala = 25 mm em todos os painéis.

TBK1 unidades não-canônica NF-kB Sinalização por autofágica sequestro de Ndp52 e TAX1BP1

A seguir, a hipótese de uma ligação entre a autofagia-driven TBK1 e basal de sinalização de NF-kB. A localização nuclear de NF-kB canónicos subunidades da via c-Rel ou RelA não era detectável na linha de células A549 (p53 de tipo selvagem), mas a localização nuclear basal da subunidade via não-canónica RelB era detectável (Fig. S3). RelB localização nuclear era dependente de actividade quinase TBK1 como mostrado pela perda de corante nuclear RelB (Fig. 3a, b) ou perda de residência na fracção nuclear (Fig. 3c), após tratamento com inibidor TBK1. TAX1BP1 tenha sido previamente demonstrado para inibir canónica de sinalização de NF-kB por nucleação de um complexo de edição de ubiquitina para canónicos reguladores de NF-kB e TRAF6 RIP1 [24]. No entanto, relatos conflitantes têm demonstrado um efeito potenciador NF-kB, embora a jusante da desregulação da função TAX1BP1 pelo Imposto oncoproteína viral [25]. Descobrimos que RNAi de

Atg5

,

ULK1

,

TBK1, TAX1BP1

ou

NDP52

inibida localização nuclear RelB (Fig. 3d-f), o que implica que uma consequência jusante da TAX1BP1 e Ndp52 sequestro por autofagia é o envolvimento de não-canônico NF-kB. O tratamento com o composto inibidor autofagia 3-MA (adenina 3-metil) também ablated RelB localização nuclear, apoiando ainda mais estes resultados (fig. 3G). Não é claro se a degradação autofágica de cargas nos lisossomos, ou mera sequestro autofágica de carga, é necessário para sinalização RelB. Enquanto E64D /A pepstatina Um tratamento não teve qualquer efeito inibitório sobre a localização nuclear RelB, um efeito pequeno, mas significativo foi observado com doses elevadas de cloroquina e um efeito inibitório significativo foi observado com bafilomicina A1 (Fig. S4). Para confirmar a observação de que a autofagia promove a atividade RelB, avaliou mudanças na transcrição de genes. As análises de potenciais genes alvo RelB demonstrou que

BIRC3

níveis de mRNA foram robustamente reprimidos pela inibição RelB (Fig. 3 h, i). É importante ressaltar que RNAi de

Atg5

,

ULK1

,

TAX1BP1

e

TBK1

semelhante subregulado

BIRC3

mRNA (Fig. 3-J) .

células A549 foram tratadas durante a noite com DMSO ou 10 ^ M MRT68601 (TBKi) e a) corados para RelB (barra de escala = 50 um), de localização nuclear quantificada em b) (n = 3, ± SEM, * * = p 0,01) ou c), extractos nucleares preparados e colocados a hibridar para as proteínas indicadas. d-f), células A549 foram transfectadas com ARNsi indicados (

NTC

= não segmentação de controlo) durante 72 h e e) extractos de células transferidas para proteínas ou d indicados, f) as células foram coradas e quantificada para RelB nuclear (n = 3, ± SEM, * = p 0,05). g) As células A549 foram tratados com PBS ou 3-metiladenina 10 mM (3-MA) ​​durante 24 horas e, em seguida, coradas e quantificada para RelB nuclear (n = 3, ± S.E.M., *** = p 0,005). H, I) células A549 foram infectadas com lentivírus indicado e, às 72 horas após a infecção, h) extratos de células apagados para proteínas indicadas ou i) RNA total quantificado para

BIRC3

mRNA (n = 3; ± SD) . j) As células A549 foram transfectadas com ARNsi indicados durante 72 h e os extractos de ARN total foram submetidas a qRT-PCR para

BIRC3

ARNm (n = 3; D.P. ±). k) As células A549 foram infectadas com lentivírus indicada e a 120 h após a infecção o número de células contadas como descrito em Materiais e Métodos (n = 3, ± SEM, * = p . 0,05)

RelB Atividade contribui para TBK1 e Autophagy ‘Addiction’

Nós confirmamos observações anteriores [1], [11] que silenciamento crônica da

Atg5

ou

TBK1

, por lentiviral segmentação shRNA, levou a uma diminuição no número de células em células A549, assim como ARNi de

KRAS

(Fig. S5a-F). Importante, lentiviral RNAi de

RELB também

levou à redução acentuada no número de células (Fig. 3k). Isto sugere TBK1- e regulação mediada por autofagia de RelB pode, ao menos em parte, subjacentes TBK1- e autofagia-dependência.

A autofagia e Ndp52 /TAX1BP1 mediada RelB Sinalização pode ser independente da Optineurin e não TAX1BP1 não Promover Canonical NF-kB sinalização

nas células A549, o outro receptor autofagia carga previamente implicado na função TBK1, Optineurin [16], parece ter uma participação limitada na sinalização RelB. Existe apenas um pequeno, mas significativo, na redução de localização nuclear RelB mediante

OPTN

RNAi (Fig. 4a, b). No entanto, estes resultados não excluem um papel para Optineurin em diferentes origens genéticas ou sob condições de estresse, e essas possibilidades devem ser abordadas em trabalhos futuros. Nas células A549, o papel de TAX1BP1 na promoção de sinalização de NF-kB também é específico para a nova via autofagia-RelB aqui descrito. A estimulação da sinalização de NF-kB por meio de tratamento de TNFa canónica, tal como avaliado pela localização nuclear de RelA, não é perturbado por

TAX1BP1

RNAi, pelo menos na medida em que não se observa qualquer redução de translocação nuclear induzida por TNFa (Fig. 4c , d). Assim, o papel estimulador de TAX1BP1 em NF- kB parece ser específico para a sinalização RelB não canónicas. No entanto, é importante notar que este ensaio não aborda o papel inibitório já bem descrita de TAX1BP1 sobre a duração e magnitude do canónica de sinalização de NF- kB [24].

células A549 foram transfectadas com ARNsi indicada (

NTC

= não segmentação de controlo) durante 72 h e a) extractos de células transferidas para proteínas indicadas ou b) células coradas e quantificada para RelB nuclear (n = 3, ± sEM, * = p 0,05) . c, d) de células A549 foram transfectadas com ARNsi indicados (

NTC

= controlo não segmentação) e estimuladas com 5 ng /ml de TNF-α durante 3 h e c) corado e d) quantificação para RelA nuclear ( n = 3, ± SEM). Barra de escala = 25 um.

RelB Ativação por autofagia e Ndp52 /TAX1BP1 também é visto em, Células NSCLC K-Ras-dependentes mutante p53-

Foi proposto que, em linhas de NSCLC mutada-p53, tais como NCI-H23, canónica de sinalização de NF-kB basal é muito mais elevado do que em linhas de p53 de tipo selvagem, tais como A549. No entanto, pelo menos em NCI-H23, ainda encontramos engajamento constitutivo da RelB sinalização, dependente função autofagia basal, sugerindo que a sinalização de NF-kB não-canônico e canônico basal pode ser co-incidente (Fig. 5a-e). Especificamente, verificou-se que as células NCI-H23 tinha autofagia constitutivo, tal como avaliada com a proteína marcador em tandem LC3-fluorescente, a qual foi regulada negativamente por

TBK1

RNAi (Fig. 5A-C), e que a localização nuclear constitutiva de RelB nesta linha celular foi sensível à inibição RNAi mediada por

TBK1

,

Atg5

,

NDP52

ou

TAX1BP1

(Fig. 5d, e) .

células NCI-H23 foram transfectadas com ARNsi indicados (NTC = controlo não-targeting) durante 72 h e a) extractos de células transferidas para proteínas indicadas. b, c) células LC3B Tandem-fluorescente NCI-H23 foram transfectadas com ARNsi indicados e analisados ​​como descrito em Materiais e Métodos. d, e), as células NCI-H23 foram transfectadas com ARNsi indicados durante 72 h, e as células foram d) corado e e) quantificada para RelB nuclear (n = 3, ± SEM, * = p 0,05, ** = p 0,01) . Barra de escala = 50 mm em todos os painéis.

Um Modelo para Contratação de Basal RelB Sinalização em K-Ras-dependentes cancro do pulmão células

Os dados apresentados neste chumbo manuscrito ao formulação do modelo seguinte (Fig. 6). Enquanto a actividade de receptores de carga de ligação TBK1 Optineurin, Ndp52 e, potencialmente, TAX1BP1, impulsiona autofagia de células bacterianas durante xenophagy, um sequestro autophagic mediada por TBK1 semelhante de TAX1BP1 e Ndp52 é accionado por autofagia basal em células NSCLC K-ras-dependentes . Isto leva ao engate da proliferação e sinalização celular de NF-kB não canónicas e /ou sobrevivência. Se TBK1 também regula a função direta, lisossômico da autofagia no metabolismo celular é desconhecida; Também continua a ser abordado se este papel da autofagia é experimentalmente dissociável de sequestro seletiva de TAX1BP1 e Ndp52. Mecanicamente, ele também não está claro como TBK1 impulsiona a autofagia. No entanto, como este manuscrito era nas fases finais de revisão, o grupo de Deretic publicado que a fosforilação do receptor de função autofagia geral e facilitador da biogénese autophagosome, p62 /SQSTM1, no domínio de ligação a ubiquitina (UBA), pode estar envolvido na um novo papel para TBK1 em autofagia induzida pela inanição [26], [27]. Na verdade, os primeiros resultados deste laboratório sugerem que as células A549 tem p62 basally fosforilada que é diminuída em abundância por meio de tratamento TBKi (Fig. S6).

Veja o texto para discussão detalhada. Ub = ubiquitina.

Discussão

A autofagia é um processo multifacetado, decretar mudanças no destino da célula por ambos os mecanismos não-seletivos e seletivos [12]. É provável que o acoplamento de autofagia em células de cancro actua directamente sobre o metabolismo [10], [11], [13] e a sinalização celular, em uma resposta integrada. É tentador especular que xenophagy é acoplado a uma resposta de sinalização imune inato via não-canônico NF-kB, e este mecanismo é simplesmente aberrante envolvidos por autofagia conduzida-oncogene em células NSCLC. O papel da TBK1 na condução autofagia também pode explicar como a autofagia está envolvida, apesar actividade mTOR basal alta prevista, em células NSCLC. Mecanisticamente, a fosforilação de p62 pode desempenhar um papel neste processo [26]. No entanto, especula-se que TBK1 é uma quinase promíscua com numerosos substratos, e prever que a p62 e, na verdade Optineurin (ao lado LIR motif) fosforilação [16], representa apenas um subconjunto de metas funcionalmente relevantes do TBK1 em autofagia. Assim, é possível que diferentes substratos de ato TBK1 em diferentes fases de autofagia, quer em etapas iniciais, como os nossos dados sugerem que, ou em passos posteriores de maturação, tal como foi recentemente proposto [26].

Geralmente, sinalização de NF-kB foi pensado para mentir a montante da autofagia [28], [29], [30]. No entanto, a regulamentação direta da sinalização de NF-kB canônica por autofagia foi recentemente proposto. mecanismos hipótese incluíram o sequestro de p62, IκBα, NEMO ou Bcl10 [31], [33], [34], [35] [32]. A diversidade de mecanismos de acção autofagia ilustra as diversas funções do presente processo; aqui vamos adicionar outro mecanismo de regulação de NF-kB, desta vez na regulação da via RelB não-canônico. Recentemente, a actividade aberrante RelB foi identificado nos tumores do pulmão, encaixando com o nosso modelo [36]. No entanto, o p53 de tipo selvagem NSCLC também pode ser dependente, até certo ponto, sobre canónica de sinalização de NF-kB [37], [38]. Com efeito, as células A549 (p53 do tipo selvagem) são dependentes da actividade de c-Rel para proliferação e sobrevivência [1]. Isto não é mutuamente exclusiva com os nossos resultados; uma quantidade não detectável de nuclear c-rel pode ser necessária para a proliferação /sobrevivência, juntamente com RelB. Na verdade, o contexto do mutante p53-NSCLC, onde o envolvimento da sinalização de NF-kB canônico é muito mais evidente [39], será uma boa arena para dissecar tal interação. Curiosamente, temos mostrado neste manuscrito que em pelo menos algumas linhas de células com a mutação p53, e relatou proeminente basal canónica de sinalização de NF-kB (por exemplo, NCI-H23), que basal, localização nuclear impulsionada RelB-autofagia pode ser, no entanto, detectada. Futuro investigação das cargas autofagia trouxe para autophagosomal membranas por TAX1BP1 e Ndp52, ubiquitinada ou de outra forma, também irá lançar luz sobre o mecanismo pelo qual estes receptores de carga estão envolvidos na mediação de não-canônica de sinalização de NF-kB. experimentos de proteômica para determinar a identidade destas cargas estão em andamento em nosso laboratório.

Dado o interesse em desenvolver inibidores TBK1 para tratamento de câncer, precisamos entender em detalhes as consequências da perda da via descrita aqui. Na

in vivo

definição, os efeitos da regulamentação RelB por autofagia e TBK1 não são susceptíveis de ser totalmente célula autónoma, dado o papel bem estabelecido de sinalização de NF-kB em controlar a comunicação célula-célula e inflamação. Curiosamente,

TAX1BP1

pode regular tumorigénese intestinal em modelos de ratos com câncer [40]. Além disso, germinativas

TAX1BP1

knockout camundongos exibir um fenótipo inflamatória específica do órgão [41]. É possível que estas observações podem dizer respeito ao papel para TAX1BP1 aqui descrito ou, alternativamente, para o papel melhor descrito na repressão canónica de sinalização de NF-kB [24]. Finalmente, a segmentação de autofagia também é proposto como um meio de tratamento de cancro, pelo menos em alguns origens genéticas. Os dados aqui sugerem cautela ao extrapolar os resultados de inibição genética de autofagia, visando a formação de autophagosome e sequestro, à ação de drogas que alvejam função lisossomal, como a cloroquina, os inibidores da protease ou bafilomicina A1. Não está claro que os agentes como estes irão afetar todas as mudanças, como a atividade de NF-kB, que a segmentação os primeiros estágios da autofagia vontade, e

vice-versa

.

Materiais e métodos

linhas celulares e plasmídeos

Todas as células foram cultivadas em DMEM (Sigma) + 10% FCS (Sigma), sob 5% de CO2 a 37 ° C. As células foram HEK293FT de Invitrogen. As células A549 utilizados foram obtidos a partir Institute of Cancer Research (Londres, Reino Unido) e identidade verificada por meio de microssatélites genotipagem (Health Protection Agency, UK). células NCI-H23 foram comprados diretamente do ATCC. As células A549 e NCI-H23 foram derivatizados para expressar receptor ecotrópico utilizando Pecor-neo e selecção em G418. Retrovírus para fazer os infectantes estáveis ​​foi gerado em células Phoenix-Eco por técnicas padrão. Estes vírus foram: GFP-pBabe Puro LC3B [42]: ADNc LC3B rato fundido no terminal N a GFP. pBabe GFP-LC3BΔG- Um puro: acima de proteína plasmídeo truncado de modo C-ter Gli exposta pela transformação de C-terminal por Atg4 é constitutivamente exposta. Este Gli ter C-é mutado para Ala pBabe tfLC3B puro:. Puro pBabe com conjunto LC3B fluorescente [21] clonado em NheI (rombo) /Sall no local SnaBI /SalI. pWZL GFP-TBK1 HYGRO: pWZL GFP DEST IRES HYGRO vector (não publicado) com TBK1 comprimento completo fundido a C-terminal da GFP por recombinação com pDONR TBK1 223 (não publicado) por tecnologia Gateway (Invitrogen). pBabe mCherry LC3C BLAST: pBabe cereja DEST vector BLAST (não publicado) com LC3C comprimento total fundida com C-terminal de mCherry por recombinação com pDONR 223 LC3C [43] pela tecnologia Gateway (Invitrogen). MSCV FLAG-HA-LC3B: Tal como descrito na literatura {Behrends, 2010 # 4}. MSCV FLAG-HA- TAX1BP1 (WT e mutantes LIR): ADNc foi clonado em TAX1BP1 pDONR 223 por meio de técnicas de clonagem Gateway padrão usando pcDNA 3.1 myc-TAX1BP1 (a seguir) como um modelo. TAX1BP1 ADNc foi então clonado no gateway MSCV NTAP IRES PURO [43]. mutagénese dirigida ao local foi realizada em pDONR antes da recombinação em MSCV NTAP IRES PURO para produzir ADNc que codifica TAX1BP1 com mutações no motivo canónico ou não canónicas putativo (LIR mutações tal como descrito no texto). Todos os cADNs mutagenizados foram totalmente sequenciados

Outros plasmídeos utilizados neste estudo foram:. PcDNA 3.1 myc-His: Invitrogen, pcDNA 3.1 myc-TAX1BP1: myc-TAX1BP1 de comprimento completo de ADNc (NCBI isoforma 1) foi amplificado por PCR com os seguintes iniciadores de um clone de imagem e clonado BamHI-XhoI em pCDNA 3.1 myc-His: GGA TCC GCC ACC ATG GAG CAG AAG CTG ATT TCC GAG GAG GAC CTG ACA TCC TTT CAA GAA GTC CCA TTG CAG ACT TC e CTC GAG CTA GTC AAA ATT TAG AAC ATT CTG ATC AAA ATG GGT C. o cDNA resultante codifica a variante 307I desta proteína (polimorfismo comum). pDEST15 vector vazio (para a expressão da proteína de controlo GST): criado através da inserção de uma paragem em enquadramento codão contendo a cassete em pDEST15 pela Gateway clonagem de um plasmídeo de pDONR223 especialmente construída. pDEST15-LC3B, pDEST15-LC3C e pDEST15-GABARAP (para a expressão de proteínas de fusão GST) foram criados por recombinação com pDONR 223 LC3B, pDONR 223 LC3C ou pDONR GABARAP 223 [43], através da tecnologia Gateway (Invitrogen).

Chemicals

a cloroquina foi obtido a partir de Sigma e mantida como uma solução estoque congelada em PBS. 3-MA foi obtido a partir de Sigma e soluções frescas feitas em DMEM antes na concentração de trabalho, antes da aplicação às células. O TNFa foi obtido de Sigma e armazenados em alíquotas congeladas em solução aquosa. TBKi (MRT68601, Fig. S1) foi obtida a partir de tecnologia de MRC e mantido como uma solução estoque congelada em DMSO. Bafilomicina A1 foi obtido a partir de Sigma e armazenado como uma solução estoque congelada em DMSO. A pepstatina A foi obtido a partir de Sigma e armazenado como uma solução estoque em etanol. E64D foi obtido a partir de Calbiochem e armazenado como uma solução estoque congelada em DMSO

Anticorpos

Os anticorpos utilizados neste estudo são as seguintes:. (Monoclonal de coelho AOW9, Millipore) TBK1, fosfo-Ser172 -TBK1 (BD Pharmingen), Atg5 (para ATG5-12, coelho policlonal, Cell Sinalização Technology), ULK1 (policlonal A705 Coelho, Cell Signaling Technology), LC3B (Immunoblot, D11 monoclonal Coelho, Cell Signaling Technology), LC3B (imunofluorescência, monoclonal 2G6, Nanotools), GABARAP (coelho policlonal Ap1821a, Abgent), ERK (coelho policlonal 9102, Cell Sinalização Technology), RelB (monoclonal C1E4 Coelho, Cell Signaling Technology), histona H3 (H3, monoclonal 6-6-2 , Millipore), TAX1BP1 (Rabbit poli HPA024432, Sigma HPA), Ndp52 (ab68588 poli Coelho, Abcam), p62 (mouse 3 /p62 monoclonal, BD Pharmingen), tag myc (Rat JAC6 monoclonal, AbD Serotec [experimentos TBK1 coIP] ou rato 4A6 monoclonal, Millipore [GST experiências pulldown]), c-Rel (policlonal de coelho, 4727, Cell Signaling Technology), RelA (monoclonal C22B4 coelho, Cell Signaling Technology), α-tubulina (monoclonal de ratinho DM1A, Sigma), HA ( Rat 3F10 monoclonal, Roche), GST (GST-2 monoclonal, Sigma), Optineurin (policlonal item Coelho não. 100000, Cayman Chemical), K-Ras (rato monoclonal 3B10-2F2, Sigma). Anti-fosfo-S403-p62 era um presente tipo de Nobuyuki Nukina (RIKEN, Japão). anticorpos específicos para fosfo para IRF3, RELA e JNK foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology.

Transfection siRNA

Em 35 pratos mm, 0,8 × 10

5 A549 ou 1.2 × 10

5 NCI-H23 foram plaqueadas durante a noite. As células foram transfectadas durante 8 h com Oligofectamine (Invitrogen) e 10 nM de ARNsi (A549) ou 20 nM de ARNsi (NCI-H23), de acordo com as instruções do fabricante.