Sumário

factor de crescimento transformante β (TGFp) derivada a partir do microambiente do tumor induz fenótipos malignos, tais como a transição epitelial-mesenquimal (EMT) e motilidade celular aberrante em cancros do pulmão. translocação induzida por TGF-p de β-catenina a partir de complexos de E-caderina no citoplasma está envolvido na transcrição de genes alvo EMT. PTEN (fosfatase e homólogo tensina eliminado do cromossoma 10) é conhecido por exercer actividade da fosfatase por ligação a complexos de E-caderina através de β-catenina, e estudos recentes sugerem que a fosforilação da cauda PTEN terminal C pode causar a perda desta actividade fosfatase PTEN . No entanto, se o TGF-p é capaz de modular a translocação tanto β-catenina e a actividade da fosfatase PTEN via fosforilação da PTEN C-terminal permanece elusiva. Além disso, não foi avaliado o papel da fosforilação de PTEN C-terminal em fenótipos malignas induzidas por TGF-p. Para investigar se a modulação da fosforilação da PTEN C-terminal pode regular fenótipos malignas, aqui nós estabelecemos as células de câncer de pulmão que expressam a proteína PTEN com a mutação de sítios de fosforilação no PTEN C-terminal (PTEN4A). Encontrámos que a estimulação TGFp produziu um aumento de duas vezes na razão -PTEN /PTEN fosforilada. Expressão de PTEN4A reprimido EMT induzida por TGF-p e a motilidade celular mesmo após expressão de Snail. Os nossos dados mostraram que PTEN4A pode reprimir EMT através do bloqueio completo de translocação β-catenina para o citoplasma, além de o efeito inibitório de PTEN4A sobre a activação induzida por TGF-p de vias de sinalização independentes de smad. Em um modelo de xenoenxerto, a taxa de crescimento do tumor foi reprimida em células que expressam PTEN4A. Tomados em conjunto, estes dados sugerem que os locais de fosforilação na PTEN C-terminal pode ser um alvo terapêutico para fenótipos malignas induzidas por TGF-p em células do cancro do pulmão

citação:. D Aoyama, Hashimoto N, K Sakamoto, T Kohnoh , Kusunose H, Kimura M, et al. (2013) Envolvimento de fosforilação TGF-induzida do PTEN C-terminal de TGF-Induced Aquisição de fenótipos malignos em células de câncer de pulmão. PLoS ONE 8 (11): e81133. doi: 10.1371 /journal.pone.0081133

editor: Yulia Komarova, Universidade de Illinois em Chicago, Estados Unidos da América

Recebido: 08 de maio de 2013; Aceito: 18 de outubro de 2013; Publicação: 22 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Aoyama et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por Kowa Life Science Foundation e Grant-in-Aid para a Investigação científica (C) (21590987 e 24591162). Este estudo foi parcialmente financiado por uma doação para as Doenças pulmonares difusas Grupo de Pesquisa do Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-Estar, Japão. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

provas crescentes sugerem a importância do microambiente do tumor, em que as células de cancro do pulmão interagir com fibroblastos associada a carcinoma (FAC) e a matriz extracelular (ECM) e, por conseguinte adquirir diversos fenótipos malignas incluindo transição epitelial-mesenquimal (EMT) e motilidade celular aberrante [1,2]. Factor de crescimento transformante β (TGF-p), um dos factores mais críticos-endurecimento dos tecidos derivados do microambiente do tumor, faz com que a aquisição do fenótipo maligno, acompanhadas pela expressão alterada de genes relacionados com o EMT tais como caracol [3]. Um estudo recente sugere que a transcrição induzida por TGF-p de genes alvo, tais como fibronectina EMT e vimentina é acelerada pela translocação de β-catenina a partir de complexos de E-caderina na membrana celular para o citoplasma [4]. estimulação TGFp também faz com que a motilidade celular aberrante embora vias Smad-independente, tais como os que envolvem quinase de adesão focal (FAK) e fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K) [5,6]. Embora muitas vias de Smad-independentes no microambiente tumoral são regulados negativamente pelas acções concertadas de lípidos e proteínas fosfatases de PTEN (fosfatase e tensina homólogos suprimido do cromossoma 10) [7], cancros do pulmão, em que a mutação do gene PTEN é raramente observada [8,9], muitas vezes mostram hiperativação destas vias [9-11]. Embora PTEN exerce a sua actividade de fosfatase por ligação a complexos de E-caderina através de β-catenina [12], estudos recentes têm sugerido que a fosforilação da cauda PTEN C-terminal pode estar estreitamente associada com a perda de actividade de PTEN [13]. Rahdar et ai. sugeriu que a substituição com quatro resíduos de alanina (Ala), resultando na eliminação dos sítios de fosforilação de serina /treonina correspondentes (S380A, T382A, T383A, e S385A), Associação de membrana melhorada de PTEN com uma conformação aberta [14]. Algumas vias de sinalização pode modular a expressão de PTEN, resultando em diminuição da atividade da fosfatase PTEN [15,16]; No entanto, se o TGF-p é capaz de modular a translocação tanto β-catenina e a actividade da fosfatase PTEN via fosforilação da PTEN C-terminal permanece elusiva. Além disso, totalmente não foi avaliado o papel exacto da fosforilação de PTEN C-terminal em EMT induzida por TGF-p e a motilidade celular aberrante. No presente estudo, investigou-se o TGF-p é capaz de modular a fosforilação de PTEN terminal C em células do cancro do pulmão e se quatro Ala substituição no terminal C- PTEN (PTEN4A) poderia inibir EMT induzida por TGF-p e a motilidade celular aberrante relacionados. Além disso, examinou-se o mecanismo, ou seja, se pode modular PTEN4A complexos juncionais caderina e vias de sinalização subjacente. Também avaliamos o efeito da indução de compensação de PTEN4A no crescimento do tumor

in vivo

.

Materiais e Métodos

Declaração de ética

Todos os estudos em animais têm sido analisado e aprovado pelo Comitê da Universidade de uso e cuidados dos animais no Nagoya University Graduate School of Medicine.

Eles também foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. Todos os ratos foram alojados individualmente em uma instalação de barreira estéril com fade-in /fade-out de 12 horas de luz: 12 horas de escuridão. Quando os ratos foram sacrificados após as experiências, os ratinhos foram sacrificados com uma sobredosagem anestésica, seguido por deslocamento cervical imediato, para minimizar o sofrimento.

Materiais

monoclonais, anti-PTEN anticorpo (clone 6H2.1) era de Cascade Bioscience (Winchester. Reino Unido). -PTEN anti-fosfo (//Thr383 Ser380 Thr382), anticorpo Akt de coelho anti-Pan,-Akt anti- fosfo,-Akt anti- fosfo, anticorpo de coelho purificado por anticorpo de coelho (Thr308) anticorpo de coelho (Ser473) anticorpo de coelho anti-FAK , anticorpo de coelho anti-fosfo-FAK (Tyr397), anticorpo anti-rato de Smad2 e de coelho anti-fosfo-Smad2 (Ser465 /467) de anticorpo foram de Cell Signaling Technology (Boston, MA). anticorpo anti-fibronectina foi purificada a partir de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Purificada anticorpo de ratinho anti-E-caderina e anticorpo anti-β-catenina eram da BD Biosciences (San Diego, CA). Estreptavidina (SAv) -Alexa 594 (SAV-594) -conjugated anticorpo anti-rato foi a partir de Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA). monoclonal de murganho anti-vimentina de anticorpo foi de Millipore (Cambridge, Reino Unido). -Afinidade de anticorpo isolado de coelho anti-actina e SB 431542, um inibidor potente de tipo I TGFp-cinases recetoras, foram da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Pode obter sinal era de Toyobo Co. (Tóquio, Japão). Doxiciclina foi de Clontech (Mountain View, CA). PhosSTOP e WST-1 foram a partir de Roche Applied Science (Mannheim, Alemanha). Hoechst33342 foi de Dojindo (Kumamoto, Japão). 1,2,4,5-tetra Benzenetetramine (FAK inibidor 14) era de Tocris Bioscience (Bristol, Reino Unido).

Plasmids e Gene transfecção

PTEN Humano (NM_000314) cDNA foi subclonado no vector pEGFP-C1 (Clontech; Mountain View, CA). GFP ou uma fusão com o gene de GFP-PTEN foi colocado no vector de PTRE-Tight (Clontech; Mountain View, CA), respectivamente. O QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene; La Jolla, CA) foi utilizado para o estabelecimento de quatro Ala substituição (S380A, T382A, T383A, e S385A) na cauda PTEN C-terminal (PTEN4A). Por último, GFP no vector PTRE-Tight (GFP), GFP-PTEN em PTRE-Tight vetor (GFPPTENWt) e GFP-PTEN4A na PTRE-Tight vetorial (GFPPTEN4A) foram estabelecidas neste estudo. Após o estabelecimento de células H358, a linha de células de cancro do pulmão humano, levando pTet-On Avançado (H358ON), GFP, GFP-PTENWt, ou GFP-PTEN4A foi co-transfectadas com o Linear higromicina marcador (Clontech; Mountain View, CA) , usando Nucleofector II ™ (Amaxa Biosystems, Gaithersburg, MD). Após selecção com higromicina, os clones individuais foram isolados. PTEN humana também foi colocado em pcDNA4 (Invitrogen Life Technologies; Carlsbad, CA). células H1299, a outra linha de células de cancro do pulmão humano, foram electroporadas com pcDNA4 somente (4HC), pcDNA4 com PTENWt (PTENWt) ou pcDNA4 com PTEN4A (PTEN4A) usando Nucleofector ™ II. Após selecção com zeocina, os clones individuais foram isolados.

Células

As linhas de células de pulmão humano, H358 e H1299, foram mantidas em meio RPMI suplementado com 2 mmol /L de L-glutamina, 100 U /mL de penicilina , 100 ug /mL de estreptomicina, 0.25μg /ml de fungizona, e FCS a 10% [17]. Para avaliar o efeito de TGF-p nestas células, as células foram tratadas com TGFp em 2 ng /ml e analisadas para os níveis de ARNm e os níveis de proteína nos pontos de tempo indicados e conforme descrito abaixo. Para avaliar o efeito da transdução na estimulação PTEN TGFp, células que expressam GFP H358ON Dox-dependente, GFP-PTENWt, ou GFP-PTEN4A foram incubadas com Dox a 1 ug /ml durante 24 horas antes do tratamento TGF-p, como descrito acima. Para examinar os efeitos directos de estimulação TGFp na modulação do índice P-PTEN /PTEN, as células foram incubadas com veículo ou SB 431542 durante 1 hora antes do tratamento com TGFp. Para examinar o papel da fosforilação de FAK em EMT induzida por TGF-p, as células foram incubadas com veículo ou inibidor da FAK 14 durante 24 horas antes do tratamento TGF-p.

A migração celular ensaio

Um tamanho de poro de Boyden câmara 8 mícrons foi utilizado para o ensaio in vitro de migração em [18]. Depois de ser tratada com Dox durante 24 horas, as células (3×10

4 células) em meio RPMI contendo 0,5% de soro e o TGF-p a 2 ng /ml foram plaqueadas na câmara superior e 15% de soro fetal bovino (FCS) em meio RPMI foi adicionada à câmara inferior, como um quimioatractor.

A análise de PCR para a expressão de genes alvo

-PCR em tempo real foi realizado utilizando um ABI 7300 Sequence Detection System TaqMan (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). Snail (NM_005985), torção (TWIST1: NM_000474), e glyceraldehydes-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) foram detectados ARNm, utilizando uma mistura de iniciadores de oligonucleótidos e sondas de Nippon EGT, Inc (Toyama, Japão). Os níveis de ARNm foram normalizados para GAPDH mRNA sinal [19].

Western blot análise

Para extractos de células completas, as células foram colhidas em tampão de lise gelado e clarificado por centrifugação [20,21]. As amostras foram então sujeitas a SDS-PAGE e analisados ​​por imunotransferência. Para detectar os níveis de fosforilação das proteínas-alvo, Phosphostop foi adicionado ao tampão de lise e pode adquirir o sinal, também foi adicionada à solução de diluição de anticorpo primário e anticorpo secundário. β-actina foi avaliada como um controlo de carga.

WST-1 de ensaio

O reagente de proliferação celular WST-1 foi utilizado para a determinação quantitativa da proliferação de células [18]. A absorvância das amostras foi medida a 450 nm usando um spectrofluorophotometer (Wallac 1420 ARVO-SX; PerkinElmer, Inc., Waltham, MA). Salvo disposição em contrário, apenas meio foi medida como um controle de fundo.

imunofluorescência e microscopia confocal de varrimento laser

Immunochtochemistry foi realizada conforme relatado anteriormente [22]. Para avaliar o efeito da transdução PTEN4A sobre a translocação induzida por TGF-p de β-catenina, células H358ON expressam Dox-dependente GFP, GFP-PTENWt, ou GFP-PTEN4A foram incubadas com anticorpo anti-β-catenina seguido por SAV-594 conjugado anti-rato anticorpo. coloração nuclear foi realizado pela Hoechst 33342. Para determinar os níveis de distribuição β-catenina, microscopia confocal de varrimento laser (LSM 5 PASCAL; Carl Zeiss Co., Ltd, Jena, Alemanha) foi utilizada. As intensidades de fluorescência das β-catenina e núcleo foram avaliados utilizando o software de imagem (LSM Software ZEN 2008; Carl Zeiss Co., Ltd, Jena, Alemanha). Para realizar a observação visual da fluorescência, as intensidades fluorescentes ao longo de um corte transversal aleatória das células foram plotados [23,24]. Para determinar os níveis de distribuição subcelular PTEN, microscopia confocal de varrimento laser também foi utilizado. Os níveis de intensidade de fluorescência da GFP no citoplasma e o núcleo também foram quantificados, utilizando o software de imagem. Um mínimo de 5 campos de alta potência selecionados aleatoriamente foram examinados por amostra para medir a intensidade de fluorescência no núcleo e citoplasma [25].

modelo de xenoenxerto mouse

3×10

6 H358ON células que expressam Dox-dependente via subcutânea GFP, GFPPTENWt ou GFPPTEN4A, foram inoculados (sc) no flanco de 6 semanas de idade nu feminino camundongos e depois mantida na água com Dox a 2 mg de concentração final /ml e autoclavado ad libitum feed. O crescimento foi seguido ao longo do tempo, tomando medições de calibre nos tempos indicados como previamente descrito [26,27]. Cada experimento utilizou 5 ratos nua para GFPPTENWT, 7 ratos nua para a GFP, e 7 ratinhos nus para GFPPTEN4A. Três experimentos independentes foram realizados.

A análise estatística

Os resultados foram analisados ​​por meio do teste de Mann-Whitney para comparação entre dois grupos, e por equivalentes não paramétricos de análise de variância (ANOVA) para comparações múltiplas. Um valor de p . 0.05was considerado para indicar significância estatística

Resultados

TGF modula os níveis de fosforilação da PTEN C-terminal na expressão de PTEN em células H358, seguido de EMT e motilidade celular aberrante

para avaliar EMT induzida por TGF em células de câncer de pulmão [28,29], análise de transferência de western para fibronectina [4,30] e e-caderina [4,29] foi realizada. análise de transferência de Western demonstrou que o tratamento com TGFp induziu um aumento de aproximadamente 12 vezes na expressão de fibronectina em células naive H358, em comparação com o veículo, enquanto que a expressão de E-caderina nas células tratadas com TGFβdecreased por mais de 20% em comparação com os tratados com veículo; Assim, a estimulação TGFp produziu mais do que uma proporção 15 vezes maior de fibronectina /E-caderina nas células naive H358, em comparação com o veículo (Figura 1A). Para avaliar a associação entre EMT induzida por TGF e capacidade de migração, foi realizado um ensaio de migração. células naive H358 tratadas com TGFβat 2 ng /ml apresentaram uma aproximadamente 20 vezes maior capacidade para migrar em direcção um quimioatractor, em comparação com os tratados com veículo (Figura 1B). Estudos recentes sugerem que a translocação de β-catenina para o citoplasma induz diretamente

de novo

expressão de genes em células epiteliais mesenquimais [4,31]. Por conseguinte, a localização de β-catenina também foi avaliada em células de cancro do pulmão tratadas com TGFp por imunofluorescência. imagens de imunofluorescência obtidos por microscopia confocal sugeriu que β-catenina foi localizada na membrana celular em células naive H358 tratadas com nenhuma TGFp (Figura 1C e 1D), ao passo que se observou translocação β-catenina para o citoplasma em células naive H358 tratadas com TGFp, acompanhada de co-localização de β-catenina com Hoechst33342 (Figura 1C e 1D). Para avaliar as vias de sinalização induzidas por TGF-p, foi efectuada transferência de western. TGFp induziu um aumento da fosforilação da Smad2 começando em 5 minutos e atingindo um máximo a 1 hora, após o que fosforilada expressão Smad2 foi mantida a um nível constante durante até 6 horas (Figura 1E). Para avaliar o efeito da estimulação de TGFp em vias independentes-smad, a activação de Akt e FAK também foi analisada por Western blotting. tratamento TGFp induzida aumentando a fosforilação de Akt Ser473 e Thr308 em (Akt308 e Akt473) começando aos 20 minutos e atingindo um nível máximo, em 1 a 3 horas (Figura 1F); Em contraste, foi observado aumento da fosforilação de FAK em Tyr397 em 6 horas e atingiu um nível máximo de 12 a 24 horas (Figura 1G). Além disso, avaliou-se o efeito de TGFp em ambos os níveis de expressão e fosforilação de PTEN PTEN (p-PTEN) na sua extremidade C-terminal em células de cancro de pulmão. Os resultados mostraram que o tratamento com TGFp ligeiramente mas substancialmente aumentou a fosforilação de PTEN em sua extremidade C-terminal e também diminuiu os níveis totais de PTEN em H358 células naive, obtendo-se assim um aumento de duas vezes na razão /PTEN p-PTEN 24 horas após o tratamento com TGF-p ( Figura 1H). quinases Para avaliar se o TGFp pode modular directamente a relação P-PTEN /PTEN, H358 células foram tratadas com o SB 431542, um inibidor potente do tipo TGF-p eu receptor [32]. O tratamento com SB 431542 inibiu com sucesso o aumento induzido por TGF-p em relação a P-PTEN /PTEN (Figura 1I), uma descoberta apoiada por dados que mostram que o tratamento com 10 uM SB 431542 activação Smad2 inibido (dados não mostrados). Assim, um aumento induzido por TGF-p em relação a P-PTEN /PTEN pode estar envolvida na aquisição induzida por TGF-p de fenótipos malignas em células de cancro de pulmão. As células H358

(A) tratados com veículo ou TGFp foram colhidas para análise da fibronectina e E-caderina. A expressão relativa de fibronectina a E-caderina (índice F /E) é apresentada em comparação com a de células tratadas com veículo. Os dados mostrados representam a média ± SE. A experiência foi repetida três vezes com resultados semelhantes. *: P 0,05 (B) Um ensaio de migração foi realizada para a linha celular H358 tratadas com veículo ou TGFp. Os dados apresentados representam as médias ± DP. A experiência foi repetida três vezes com resultados semelhantes. *: P 0,05 As intensidades de fluorescência de β-catenina (vermelha) nas células tratadas foram avaliadas por meio de microscopia confocal de varrimento laser e software de imagem. A coloração nuclear foi realizada por Hoechst33342 (azul). A imagem da esquerda em (C) mostra células sem estimulação TGF. A imagem da direita em (C) mostra células estimuladas com TGF. As células incubadas com IgG de controlo do mesmo isotipo está representada na inserção em (C). O painel superior em (D) representa graficamente a intensidade de fluorescência de β-catenina (vermelho) e o núcleo (azul) ao longo de uma secção transversal das células sem estimulação TGFp. O painel inferior em (D) representa graficamente a intensidade de fluorescência de β-catenina (vermelho) e o núcleo (azul) ao longo de uma secção transversal das células estimuladas com TGFp. Estas figuras são representativas de pelo menos três experiências independentes. (E, F e G) os extractos celulares foram colhidas nos períodos indicados após tratamento com TGF-p para a análise dos níveis de Smad2 total e fosforilada (E), Akt473 (F), Akt308 (F), e FAK (L). Os resultados são apresentados para as células sem tratamento prévio com H358 a 0 minutos (pista 1), 5 minutos (pista 2), 20 minutos (pista 3), 1 hora (pista 4), 3 horas (pista 5), ​​6 horas (pista 6), 24 horas (pista 7) , e 48 horas (pista 8) após o tratamento com TGF-p (à esquerda na e, F e G). A proporção de proteína fosforilada a proteína total é apresentada como o nível de intensidade em relação à de células naive H358 aos 0 minutos (pista 1), após tratamento com TGF-p (à direita na E, F e G). Os dados mostrados representam a média ± SE. A experiência foi repetida três vezes com resultados semelhantes. *: P 0,05 (H) As células tratadas com veículo ou TGF-p para 0 minutos ou 24 horas foram recolhidas para análise de PTEN fosforilada (pPTEN) e PTEN total. A expressão relativa de pPTEN ao total de PTEN (rácio /PTEN pPTEN) é mostrado em comparação com a que nas células tratadas com o veículo durante 0 minutos. Uma mancha representativa de três experiências independentes, é apresentada. Os dados mostrados representam a média ± SE. A experiência foi repetida três vezes com resultados semelhantes. *: P 0,05 N. S. indica “não significativo”. As células naive (I) H358 foram incubados com veículo ou SB 431542 em 10 pM durante uma hora antes do tratamento com TGFp. proporção pPTEN /PTEN é mostrado em comparação com a de células tratadas com veículo. Uma mancha representativa de três experiências independentes, é apresentada. Os dados mostrados representam a média ± SE. A experiência foi repetida três vezes com resultados semelhantes. *: P 0,05 N. S. indica “não significativo”.

A mutação de sítios de fosforilação no PTEN C-terminal reprime motilidade celular EMT e aberrance induzida por TGF em células H358

Para confirmar os efeitos biológicos do TGF a fosforilação induzida do PTEN C-terminal em células de cancro do pulmão, foi investigado se a mutação dos locais de fosforilação em PTEN podem afetar tanto EMT induzida por TGF-p e a capacidade de migração de células de cancro de pulmão, usando um sistema de expressão do gene dependente de Dox porque vários PTENWt reconstituição modelos sugeriram que PTENWt transdução pode induzir uma taxa de crescimento lento em células de glioma [15]. Em primeiro lugar para verificar que a substituição de quatro Ala inibe a fosforilação do terminal C de PTEN em

de novo

proteína PTEN induzida por Dox, transferência de Western foi realizada em células que expressam H358ON Dox-dependente GFP, GFP-PTENWt, ou GFP -PTEN4A na ausência ou na presença de Dox. Embora

de novo

expressão de GFP-PTEN foi observada em células que expressam GFP H358ON Dox-dependente Dox-dependente GFP-PTENWt ou GFP-Dox PTEN4A quando foi adicionado, fosforilado GFP-PTEN foi detectado apenas em células expressando H358ON PTENWt (Figura 2A). Uma vez que estudos recentes sugerem que PTEN não fosforilada pode ser sujeito a ubiquitinação, resultando na translocação para o núcleo [21], avaliou-se a localização da fluorescência da GFP em células que expressam H358ON Dox-dependente GFP, GFP e GFP-PTENWt-PTEN4A. GFP sozinho estava difusamente expressa no citoplasma e o núcleo (à esquerda na Figura 2B e 2C), ao passo que GFP-PTENWt e GFP-PTEN4A estavam localizados principalmente no citoplasma com expressão fraco nuclear (central e direita na Figura 2B, respectivamente, e 2C). Não houve diferença na razão núcleo /citoplasma de fluorescência da GFP entre GFP e GFP-PTENWt-PTEN4A (Figura 2C). Para avaliar se ou não EMT induzida por TGF-p pode ser modulada por

de novo

expressão de GFP-PTEN, análise de transferência de Western de fibronectina e E-caderina foi realizada. Não houve redução na proporção de fibronectina /E-caderina em células que expressam GFP sozinho e uma redução parcial (31,8%) naqueles expressando GFP-PTENWt; No entanto,

de novo

proteína GFP-PTEN4A induzida por Dox causou uma diminuição significativa de cerca de 75% na proporção de fibronectina /E-caderina (Figura 2D). Para avaliar se a GFP-PTEN4A pode afectar a motilidade celular induzida por TGF-p, foi realizado um ensaio de migração. Em células H358ON, o aumento induzido por TGF-p na migração para um quimioatractor não foi inibida por qualquer proteína GFP ou GFP-PTENWt induzida por Dox, enquanto

de novo

GFP-PTEN4A proteína migração de células reprimidas induzida por estimulação TGFp ( Figura 2E). Estes resultados indicam que a inibição da fosforilação de PTEN o C-terminal pode reprimir EMT induzida por TGF-p e o bloco de motilidade celular aberrante em células de cancro do pulmão, para além do efeito de transdução de PTEN em si observada em células que expressam PTENWt. células H358ON

(A) que expressam GFP Dox-dependente, GFP-PTENWt, ou GFP-PTEN4A foram incubadas com veículo ou Dox por 24 horas antes do tratamento TGF. As células foram então tratadas com veículo ou TGFp durante mais 24 horas na ausência ou na presença de Dox. As células foram colhidas para análise da pPTEN (painel superior), PTEN total (painel do meio) e β-actina (painel inferior) por western blotting. Uma mancha representativa de três experiências independentes, é apresentada. (B) por meio de microscopia confocal de varrimento laser, a localização da fluorescência da GFP em células H358ON expressando GFP-Dox tratado (painel da esquerda), GFP-PTENWt (painel do meio) e GFP-PTEN4A (painel da direita) foi avaliada. Os níveis de intensidade de fluorescência da GFP no citoplasma e o núcleo (C) também foram quantificados, por um software de imagem. A intensidade de fluorescência foi expressa como a razão núcleo /citoplasma, para cada amostra. Os dados apresentados representam as médias ± SEM de três experiências independentes. *: P 0,05 N. S. indica “não significativo”. células H358ON (D) expressando GFP Dox-dependente, GFP-PTENWt, ou GFP-PTEN4A foram tratados com veículo ou TGF-p para 48 horas na ausência ou na presença de Dox, e, em seguida, colhidas para análise de fibronectina, E-caderina, e β -actina por western blotting. A razão F /E é mostrado em comparação com a de células tratadas com o veículo na ausência de Dox. Uma mancha representativa de três experiências independentes, é apresentada. Os dados mostrados representam a média ± SE. A experiência foi repetida três vezes com resultados semelhantes. *: P 0,05 N. S. indica “não significativo”. Um ensaio de migração (E) foi executado por H358ON células expressando GFP Dox-dependente, GFP-PTENWt, ou GFP-PTEN4A na ausência ou na presença de Dox e /ou estimulação do TGFp. Os dados apresentados representam as médias ± DP. A experiência foi repetida três vezes com resultados semelhantes. *: P 0,05 N. S. indica “não significativo”.

A mutação de locais de fosforilação no terminal C PTEN inibe vias independentes-smad induzida por TGF-p, mas não a via dependente de Smad em células H358

para elucidar os mecanismos moleculares subjacentes, foi avaliado o efeito de GFP-PTEN4A em vias de sinalização induzidas por TGF-p. Nem

de novo

GFP, GFP-PTENWt, nem a expressão da GFP-PTEN4A induzida por Dox reprimido o aumento da fosforilação nas células Smad2 H358ON tratados com TGF-p (Figura 3A). O aumento em fosforilação de Akt em células H358ON tratados com TGFp expressando Dox-dependente GFP-PTENWt e GFP-PTEN4A retornou aos níveis basais ou inferior quando Dox foi adicionado, enquanto que em TGFp-tratados células H358ON expressando GFP Dox-dependente não se alterou quando Dox foi adicionada (Figura 3B). Deve notar-se que a GFP-PTEN4A firmemente reprimida níveis Akt fosforilada, em comparação com a GFP-PTENWt (GFP-PTEN4A, decréscimo de 88% na Akt473 e 79% de decréscimo de Akt308; GFP-PTENWt, decréscimo de 74% no Akt473 e 68% de diminuição em Akt308) (Figura 3B). O nível de FAK fosforilada em TGFp-tratados células H358ON que expressam quer GFP ou GFP-PTENWt não foi alterada quando Dox foi adicionado, enquanto que em células H358ON tratados com TGFp expressando GFP-PTEN4A retornado com êxito para o nível basal quando Dox foi adicionada (Figura 3C).

Os extractos celulares a partir de células que expressam H358ON Dox-dependente GFP, GFP-PTENWt, ou GFP-PTEN4A na ausência ou na presença de Dox foram colhidas para análise dos níveis de total e fosforilada por Smad2 (A), Akt473 (B), Akt308 (B), e FAK (C) nos períodos indicados, após tratamento com veículo ou TGF-p (1 hora para Smad2, uma hora para Akt473, uma hora para Akt308, e 24 horas para FAK, respectivamente). Uma mancha representativa de três experiências independentes, está mostrado (topo em A, B e C). A proporção de proteína fosforilada a proteína total é apresentada como o nível de intensidade em relação ao que, em células expressando GFP H358ON Dox-dependente tratados com o veículo na ausência de Dox (inferior em A, B e C). Os dados mostrados representam a média ± SE. A experiência foi repetida três vezes com resultados semelhantes. *: P 0,05 N. S. indica “não significativo”.

Um inibidor FAK segmentação blocos Tyr397 TGF-induzida motilidade celular aberrante, mas não EMT TGF-induzida em células H358

Porque PTEN4A reprimiu os níveis de fosforilada FAK em Tyr397 induzida por TGF, determinou-se a inibição da ativação de FAK induzida por TGF pode resgatar EMT e bloquear motilit celular aberrante. Em primeiro lugar, as células foram tratadas com inibidor de FAK 14, dirige ao local Tyr397 de FAK [33], que inibiu com sucesso a fosforilação de FAK induzida por TGF-p na Tyr397 de um modo dependente da dose (Figura 4A). A inibição da actividade da FAK-TGFp induzida por inibidor de FAK 14 produziu reprimida motilidade celular induzida por TGF-p (Figura 4C), mas isso não afectou a aquisição de fenótipos EMT permaneceu persistente (Figura 4B). Além disso, constatou-se que o TGF-p induzida pelo β-catenina translocação para o citoplasma e o núcleo não foi bloqueada por tratamento com inibidor da FAK 14 (Figura 4D-4G).

Para examinar o papel da FAK fosforilação em Tyr397 em EMT induzida por TGF, as células H358ON tratados com Dox expressando GFP Dox-dependentes foram incubadas com veículo ou FAK inibidor de 14 para 24 horas antes do tratamento TGF. (A) Os extractos celulares foram colhidas 24 horas após o tratamento com TGF-p para a análise dos níveis de FAK total e fosforilada. células tratadas H358ON-Dox expressando GFP-Dox dependente foram tratados com veículo (pista 1) ou TGF-p (pista 2, 3, 4, e 5). As células foram também incubadas com veículo (pista 1 e 2), ou inibidor da FAK 14 a 0,1 nM (pista 3), 1 nM (pista 4), e 5 nM (pista 5) (superior em A). A proporção de proteína fosforilada a proteína total é apresentada como o nível de intensidade em relação ao que, em células tratadas H358ON-Dox expressando GFP-Dox dependente tratados com veículo (inferior em A). Uma mancha representativa de três experiências independentes, é apresentada. Os dados mostrados representam a média ± SE. A experiência foi repetida três vezes com resultados semelhantes. *: P 0,05 (B) Dox-tratados células H358ON expressando GFP Dox-dependente foram tratados com veículo ou TGF-p para 48 horas na ausência ou na presença de FAK inibidor de 14 a 5 nM, e, em seguida, colhidas para análise de fibronectina, a E-caderina , e β-actina por western blotting. A razão F /E é mostrado em comparação com a de células tratadas com veículo (inferior em B). Uma mancha representativa de três experiências independentes, é apresentada. Os dados mostrados representam a média ± SE. A experiência foi repetida três vezes com resultados semelhantes. *: P 0,05 N. S. indica “não significativo”. Um ensaio de migração (C) foi realizada para células tratadas H358ON-Dox expressando GFP-Dox dependente tratados com veículo ou TGF-p para 48 horas na ausência ou presença do inibidor de FAK em 14 5 nM. Os dados apresentados representam as médias ± DP. A experiência foi repetida três vezes com resultados semelhantes. *: P 0,05 Para avaliar o efeito da FAK inibidor 14 sobre a localização da β-catenina em células H358ON tratados com Dox expressando GFP Dox-dependente tratados com veículo ou TGFp, foram avaliadas as intensidades de fluorescência de β-catenina nas células. As células foram tratadas com veículo (D e E) ou inibidor da FAK em 5 nM (F e G). A imagem da esquerda em (D e F) mostra células sem estimulação TGF. A imagem da direita em (D e F) mostra células estimuladas com TGF. As células incubadas com IgG de controlo do mesmo isotipo está representada na inserção em (D).