Abstract

Linfonodo metástase indica mau prognóstico no câncer de esôfago. Para entender os mecanismos subjacentes, a maioria dos estudos até agora focado em investigar a si mesmos e /ou gânglios linfáticos invadiram os tumores. No entanto, eles negligenciaram os potenciais eventos dentro do nicho metastático, que precedem a invasão. Aqui nós relatamos a primeira descrição destes regulamentos em pacientes no nível de transcrição. Nós determinamos perfis transcriptomic de ainda metástase livre de linfonodos regionais para dois grupos de pacientes: pacientes classificados como pN1 (n = 9, existem nódulos metastáticos) ou pN0 (n = 5, não existem nódulos metastáticos). Todos os gânglios linfáticos investigados, também os de pacientes pN1, ainda estavam metástase-free. Os resultados mostram que os nódulos linfáticos regionais de pacientes pN1 decisivamente diferem das dos pacientes pN0 – mesmo antes de metástases ocorreu. No grupo pN0 foram observados padrões diferentes de resposta imune. Em contraste, os nódulos linfáticos do grupo pN1 exibiu um perfil claro de resposta reduzida imunológico e proliferação reduzida, mas aumento da apoptose, o reforço da hipoplasia e processos de conversão morfológicas. DKK1 foi o gene mais significativo associado com os mecanismos moleculares que ocorrem nos gânglios linfáticos de pacientes que sofrem de metástases (pN1). Assume-se que os dois perfis moleculares observados constituem diferentes fases de uma doença progressiva. Por fim, sugerimos que DKK1 pode desempenhar um papel importante nos mecanismos que levam à metástase ganglionar

Citation:. Otto B, Koenig AM, Tolstonog GV, Jeschke A, Klaetschke K, Vashist YK, et al. (2014) alterações moleculares na pré-metastáticos gânglios linfáticos de pacientes com câncer de esôfago. PLoS ONE 9 (7): e102552. doi: 10.1371 /journal.pone.0102552

editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, China

Recebido: 08 de abril de 2014; Aceito: 20 de junho de 2014; Publicação: 21 de julho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Otto et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados de microarranjos foram depositados no repositório público NCBI GEO e são acessíveis sob o número de GSE51021

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Stiftung für Pathobiochemie und Molekulare Diagnostik, Deutsche Gesellschaft für Vereinte Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin e.V. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Em câncer de esôfago (ESC), metástases em linfonodos está associada com mau prognóstico. Durante a migração de células tumorais através dos vasos linfáticos e durante a sua homing em gânglios linfáticos, estas células de tumor entrar em contacto próximo com as células endoteliais e do seio dos linfonodos. expansão do tumor atualmente constitui a base principal para a seleção de terapia. Mas, apesar da alta relevância prognóstica de metástases lymphogenic, os mecanismos moleculares subjacentes a esta via metastática são ainda praticamente desconhecido

Uma série de estudos investigou os perfis moleculares dos tumores [1] – [4]. E /ou o . linfonodos metastáticos [5] Outros estudos investigaram metástase lymphogenic em correlação com a angiogénese linfático [6] – [9] e quimiocina associada [10] – [12], a migração. Supõe-se que dirige a migração de células de carcinoma esofágico pode ser guiadas por quimiocinas expressas localmente. [12], e com base nestes resultados seria imaginável que o processo homing para os gânglios linfáticos pode ser assistida por lectina-glicano-interações entre o tumor células endoteliais e células da linfa. Hirakawa et al. [13] demonstraram que em ratos, mesmo antes de metástase, tumores primários (cancro da pele) pode estimular o linfonodo sentinela lymphangiogenesis. Eles sugeriram que os tumores primários poderia ser capaz de preparar o seu futuro nicho metastático, produzindo fatores linfangiogênicas que podem mediar o seu transporte eficiente para os linfonodos sentinela.

No entanto, para melhor conhecimento dos autores não há nenhum trabalho publicado especificamente examinar os mecanismos moleculares iniciais neste nicho metastático em pacientes -. mecanismos dentro dos nodos linfáticos não-afectada, o que poderia propagar ou suprimir a metástase precoce em pacientes que sofrem de ESC

O objectivo deste estudo era, por conseguinte, para investigar especificamente essas alterações precoces em gânglios linfáticos antes histopatologicamente metástase detectável. O trabalho foi conduzido pela hipótese de que, antes de as células tumorais metástase para os linfonodos regionais, mudanças importantes já deve ter ocorrido propagação ou suprimir o processo de homing. Para obter insights sobre este processo, foram coletados tumores dos gânglios linfáticos regionais e distantes dos pacientes que sofrem de ESC encenado como pN0 (não existem nódulos metastáticos) ou pN1 (existem nódulos metastáticos). Todos os gânglios linfáticos incluídos na análise foram livre de metástases – independentemente do preparo do paciente. Foi realizada microarray analisa e investigou os mecanismos ligados aos genes diferencialmente expressos entre os nós regionais e distantes linfáticos do mesmo paciente.

A chave do nosso trabalho aqui são duas características. Primeiro, todos analisados ​​gânglios linfáticos sem exceção, mesmo aqueles dos pacientes pN1, ainda estavam livres de metástase. Em segundo lugar, foram utilizadas amostras de pacientes que não realizaram qualquer rádio-quimioterapia neoadjuvante e demais procedimentos estabelecidos que garantiram a alta qualidade da amostra.

Materiais e Métodos

fluxo de trabalho Análise geral

os pacientes incluídos sofria de câncer de esôfago e foi submetido a uma esofagectomia en-bloc tóraco-abdominal radical incluindo dissecção de linfonodos da parte superior e inferior do mediastino (ressecção R0) sem neoadjuvante radio-quimioterapia. Somente foram incluídos os gânglios linfáticos de pacientes estadiados como pN0 (gânglios linfáticos regionais livres de metástase) ou pN1 (linfonodos regionais metástase presente) e verificado por histopatologia que os gânglios linfáticos selecionados para a nossa análise foram todos de células tumorais livre. Nós também confirmado por imuno que esses nódulos linfáticos estavam livres de micro-metástases. Nós isolado a partir de ARN total de cada nó de linfa para análise de expressão de microarray. Um t-teste emparelhado foi utilizado para a identificação de genes que foram diferencialmente expressos entre os nódulos linfáticos regionais e distantes e uma Análise de Enriquecimento de rede e funcional foi realizada. Posteriormente principais candidatos foram validados através de PCR em tempo real e DKK1 foi validado além via coloração imuno.

Concepção de experiência

O objetivo do trabalho aqui apresentado foi identificar os fatores potenciais facilitar e dirigir metástase em os gânglios linfáticos de pacientes que sofrem de carcinoma esofágico. Para habilitar essa compreensão do delineamento experimental (Fig. 1) incorporou duas variáveis ​​de interesse.

Os linfonodos de dois grupos diferentes de pacientes que sofrem (pN1) ou que não sofrem (pN0) do linfonodo metástases foram investigados. De cada paciente nodos linfáticos regionais (adjacente ao tumor) foram comparados para os nódulos linfáticos distantes (linha de base) como referência. A chave para o experimento é que

toda

investigado gânglios linfáticos, incluindo os de pacientes pN1, foram feitas certeza de ser ainda livre de metástases, bem como micro-metástases.

Em primeiro lugar, as amostras foram classificadas de acordo com o principal estado dos pacientes que exibem (grupo pN1) ou não-expositoras (grupo pN0) metástases em linfonodos regionais. A comparação dos pacientes pN1 e pN0 deve destacar as diferenças gerais na regulamentação que podem causar ou impedem de metástase.

Em segundo lugar, duas amostras de linfonodos foram coletadas de cada paciente, um nó localizado perto do tumor (regional ) e o segundo nó distante para o tumor. Enquanto os nós distantes serviu como amostra de referência os nós regionais foram investigadas para os regulamentos de transcrição. A comparação par a par das amostras tumorais distantes com os nós regionais específicas paciente deve revelar os primeiros regulamentos potencialmente resultantes da localização perto do tumor. Nesta publicação, o termo “up-regulation” é utilizado para os genes e funções que apresentam uma expressão mais elevada nos nódulos linfáticos regionais, em comparação com os nódulos linfáticos distantes. Por outro lado, os genes e funções que são diminuiu nos gânglios linfáticos regionais são chamadas de “down-regulada”.

É importante notar que todos os nós investigados foram feitas certeza de ser ainda metástase livre, independente dos pacientes “classificação pN1 /pN0 e do local em relação ao tumor. Isso deve permitir a identificação de alterações precoces que ocorrem

antes

para homing metástase

Ética comitê de aprovação pacientes consentimento

Este estudo foi realizado em conformidade com os regulamentos aplicáveis ​​e foi aprovado pelo Comitê de Ética em Hamburgo, Alemanha, sob o número de votos PV3548. Pacientes consentimento para participar do estudo por escrito foi obtida em conformidade com os regulamentos aplicáveis.

Material de Amostra

amostras globais de 22 pacientes com carcinoma de esôfago foram analisados, dos quais 14 pares de amostras exibiram uma amostra adequada qualidade. Para cada paciente pares de amostras de tumor perto e tumores dos gânglios linfáticos distantes foram coletadas para reduzir as diferenças inter-individuais que podem ocorrer devido a diferentes antecedentes genéticos. linfonodos foram imediatamente dissecados após a extração na sala de operação. Os segmentos que foram dedicados para a análise de expressão de microarray foram transportadas directamente em azoto líquido para o laboratório para extracção de ARN. A outra parte dos gânglios linfáticos foi incluído em parafina para a classificação e diagnóstico.

Procedimento Operacional

Após o diagnóstico histológico de carcinoma de esôfago, pacientes com lesões em fase inicial (pT1a) foram submetidos à cirurgia tanto se a ressecção endoscópica foi incompleta ou o tumor foi encenado como pT1b. Os pacientes foram encaminhados diretamente à cirurgia se o estadiamento pré-operatório era suspeito para qualquer envolvimento muscular parede (cT2) ou comprometimento dos linfonodos (CN1). Nenhum paciente foi submetido à terapia neoadjuvante.

Todos os pacientes foram submetidos à laparotomia em forma de T mediana e toracotomia do lado direito. Para pacientes com anastomose colar foi realizada uma cervicotomia adicional do lado esquerdo para a anastomose colarinho. Cada paciente recebeu um radical en esophagectomy bloco com ressecção do esôfago, ducto torácico, veia ázigos, pleura ipsilateral, e todos os tecidos peri-esofageanas no mediastino posterior. Reconstrução foi realizada por meio de sonda gástrica ou interposição de cólon geralmente com uma alta intra ou anastomose cervical.

Além disso, foi realizada uma padronizado linfadenectomia em dois campos. Todos os nodos linfáticos foram sistematicamente amostrados de oito localizações: mediastinal regional, tanto na vizinhança do tumor e distante dele; infraclavicular; diafragmática (menor mediastino); linfonodos perigastric (incluindo a esquerda e direita do pericárdio); linfonodos artéria hepática comum; e gânglios linfáticos no tronco celíaco. Todos os nós foram mapeados pelo cirurgião acordo com o esquema da American Thoracic Society, modificado pelo Casson et al. [14] Todos os espécimes ressecados foram avaliadas por um patologista sênior.

acompanhamento pós-operatório foi realizado como parte do pós-tratamento habitual. Pacientes foram atendidos no ambulatório em intervalos de 3 a 4 meses para os primeiros 2 anos e em intervalos de 6 meses depois. avaliação de acompanhamento incluiu exame físico, radiografia simples de tórax, ultra-sonografia abdominal, endoscopia, endosonography, CT do tórax e abdome, com PET-CT a partir de janeiro de 2006, em casos selecionados, CEA e CA 19-9 tumorais estudos de marcador e cintilografia óssea . Sempre que a recaída era suspeito, radiológico adicional, endoscópica, ou a confirmação histológica foi procurado.

A recorrência foi diagnosticada se comprovada por biópsia ou por evidência inequívoca de massas tumorais (metástases recém-surgidas ou recorrência local) com tendência a crescer durante maior tempo de acompanhamento e /ou acompanhamento até a morte. doença recorrente foi definido como loco-regional (que ocorrem no abdômen superior ou mediastino) ou metástase tão distante.

coloração Micrometástase

hematoxilina e eosina foi utilizada para a detecção de células tumorais em uma primeira etapa de diagnóstico . Histologicamente gânglios linfáticos “livres de tumor” foram então pesquisados ​​por imunohistoquímica utilizando anticorpo anti-citoqueratina AE1 /AE3 (Dako, Glostrup, Dinamarca) diluído 1:50 (v /v) pelo método de biotina-estreptavidina, como descrito anteriormente [15]. AE1 /AE3 é uma mistura de dois anticorpos que reconhece de base e ácido CK na superfície e no citoplasma de todas as células epiteliais (excepto células parietais, hepatócitos, e as camadas superficiais do epitélio escamoso). Os anticorpos não reagem com tecido mesenquimal, incluindo tecido linfóide [16].

fixadas com formalina e secções embebidas em parafina de 5 a 6 um de espessura foram cortados em três níveis diferentes em cada nó e desparafinadas de acordo com técnicas histológicas convencionais e transferidas para lâminas de vidro tratadas com 3-triethoxysilylpropylamin (Merck, Darmstadt, Alemanha). Uma seção da amostra obtida em cada nível foi corado pela técnica de fosfatase da fosfatase alcalina-anti-alcalina combinada com a nova mancha fuchsine (Sena, Heidelberg, Alemanha) para a reação de visualização [17].

Seções do normal, cólon mucosa serviram de controlos de coloração como positivo e do mesmo isotipo, anticorpos monoclonais de murino irrelevante serviram como controlos negativos (proteína de mieloma de murganho imunoglobulina IgG1 purificado por; Sigma, Deisenhofen, Alemanha).

As lâminas foram avaliadas num procedimento cego por dois investigadores independentes. Em caso de resultados incongruentes um terceiro pesquisador foi consultado e uma decisão consensual foi feita. envolvimento de células tumorais no mínimo um nó de linfa, que foi considerado como sendo livres de tumor por coloração histológica convencional foi definido como a presença de uma a dez células positivas no corpo do nó.

A preparação das amostras e purificação

Isolamento de ARN total a partir de amostras de nódulos linfáticos de azoto líquido congelado foi realizada com o Trizol de Invitrogen de acordo com o protocolo do fabricante (Rev. data 12. Junho 2007) e purificou-se em seguida com o Qiagen RNeasy-Kit Mini. As concentrações foram determinados com um fotómetro PeqLab NanoDrop e a qualidade do RNA por electroforese em capilar utilizando um sistema 2100 da Agilent Bioanalyzer. Fora dos pares de amostras 22 9 pares de pacientes com metástase distante observada e 5 pares de amostras de pacientes sem metástase distante observada mostrou uma qualidade RNA suficiente para a seguinte análise.

análise Microarray

Microarray experimentos foram realizados utilizando Affymetrix total humano GeneChips genoma U133 Além disso 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. Para preparar o ARN para a expressão de cDNA matrizes-síntese anterior com determinação fotométrica da concentração de RNA foi realizada. Os passos seguintes foram realizados utilizando 250 ng de ARN total para a síntese da primeira cadeia. A preparação das amostras para os passos de síntese de ADNc, a purificação, síntese do ARNc rotulado com biotina, transcrição in vitro, a fragmentação, hibridação, bem como a lavagem e coloração incorporada. A preparação foi realizada de acordo com o Protocolo de um ciclo usando o Kit GeneChip 3 ‘IVT expresso da Affymetrix. Para a hibridação de 12,5 ug foram usadas ARNc fragmentado. As matrizes foram incubadas durante 16 h na Affymetrix Hybidization Forno 640 a 45 ° C. Lavagem e coloração etapas foram realizadas semi-automática no Fluidics Station 450 Affymetrix, os passos individuais na sequência do Protocolo Ciclo Affymetrix Um para matrizes padrão. Após a lavagem e coloração as matrizes foram escaneados usando o Scanner Affymetrix GeneChip 3000 7G eo software Command Console em um comprimento de onda de 570 nm e um tamanho de pixel de 1,56 mm.

A análise estatística

Os linfonodos a partir de ambos os grupos de doentes (pN0 e pN1) foram analisados ​​separadamente. Como o foco deste trabalho foram precocemente alterações anteriores metástase, foram analisadas apenas metástase linfonodos livres. As amostras dos nódulos linfáticos distantes do tumor foram utilizados como referência para os linfonodos regionais emparelhados.

As correcções de fundo e normalização foram realizados utilizando o procedimento de RMA e normalização quantil. Um t-teste emparelhado dentro dos dois grupos (pN0, pN1) foi realizado e um procedimento de bootstrap foi executada para ajustar para regulamentos falsos positivos. Como ponto de corte valoriza um p-valor corrigido de 0,05, um p-valor bruto de 0,01 e um sinal de-log-ratio (SLR) de ± 0,7 foram usadas para determinar o top genes regulados.

expressão do gene Seguindo diferencial a análise foi realizada enriquecimento conjunto de genes e análise de rede com software Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity Systems, versão 162.830). Para a análise do ponto de corte P-valor corrigido foi ajustado para um valor menos rigoroso de ± 0,1 para permitir a incorporação de mudanças mais subtis.

A validação por meio de RT-PCR

Doze dos determinada genes candidatos foram validados por meio de RT-PCR utilizando técnicas três repetições por amostra. A RT-PCR foi realizada com placas de 96 poços no TEMPO REAL StepOne PCR System Plus da Applied Biosystems. Para cada amostra de 2 mL com uma concentração de 5 ng /mL foram usadas. Para ter em conta as flutuações da concentração da amostra Beta-2-microglobulina (B2M) foi tomado como referência o serviço de limpeza. Para a determinação dos regulamentos sobre nível de expressão foi calculado o valor médio da-CT-valores delta os três “repetições técnicas. Significância das mudanças foi determinada usando um teste t pareado entre-CT-delta valores médios distantes do tumor próximos e tumorais dentro de cada grupo (pN0, pN1).

DKK1 Imunohistoquímica

A imuno-histoquímica foi realizada em cortes de parafina dos linfonodos investigada utilizando anticorpo policlonal contra a DKK1 (1:100, Abcam, # ab61034). Para as secções de detecção imuno-histoquímicos foram desparafinizadas, re-hidratadas, e pré-tratados com 0,1% de pronase, durante 10 min para desmascaramento antigénio enzimática. Depois da incubação em peróxido de hidrogénio a 3% durante 15 minutos para bloquear a actividade da peroxidase endógena e a incubação com 5% de BSA durante 30 minutos para bloquear a ligação não específica de anticorpos foi aplicada anticorpo primário. coloração imuno-histoquímica foi realizada durante a noite a 4 ° C. Foi utilizada uma IgG biotinilado de cabra anti-coelho secundário (1:200, Dako Cytomation), seguido por incubação com um estreptavidina /HRP (1:200, Dako Cytomation) como um terceiro anticorpo. A actividade da peroxidase foi detectada utilizando DAB como substrato cromogénico (Dako Cytomation). As secções foram contrastadas com hematoxilina, desidratadas, e montado. As imagens foram coletadas em um scanner de slides Zeiss Mirax MIDI (Zeiss) e as imagens foram capturadas usando o software Pannoramic Viewer.

Resultados

linfonodos regionais livre de metástases diferiu entre os pacientes pN1 e pN0 sobre transcriptomic nível

Perguntamos se a) o nicho metastático em linfonodos pode ser afetada, mesmo antes de metástases ocorreu e se b) ainda metástase-livres gânglios linfáticos de pacientes pN1 pode ser mais na iminência de invasão metastática do que aqueles de pacientes pN0 e se c), portanto, aqueles “pN1” linfonodos pode apresentar desregulamentações de transcrição distintos associados à preparação nicho

Foram incluídos tumorais linfonodos regionais de 14 pacientes com carcinoma de esôfago (n = 9 pacientes pN1.; n = 5 pacientes pN0) para investigar a expressão do gene no potencial metastático nicho. Além disso, recolheu um linfonodo distante tumor emparelhado de cada paciente para servir como referência para os linfonodos regionais (Fig. 1). Depois, eles foram analisados ​​em nível transcriptomic pela tecnologia de microarray.

A chave para o trabalho aqui apresentado é que todos os nós investigados foram confirmados para ser histopatologicamente e immunohistologically metástase e livre de micrometástases, independente da classificação pN1 /pN0 dos pacientes e do local em relação ao tumor. Isso deve permitir a identificação de alterações precoces que ocorrem

antes homing metástase. Informações sobre idade do paciente, sexo, histologia ou classificações é fornecida na Tabela S1.

Para identificar as possíveis mudanças pré-invasivas comparamos os gânglios linfáticos regionais com os gânglios linfáticos distantes utilizando um teste t emparelhado dentro do dois grupos (pN0, pN1). Os tumores dos gânglios linfáticos distantes serviu como referência para os linfonodos regionais, de tal forma que up-regulamentação retratam esses genes com um nível maior expressão nos gânglios regionais e para baixo-regulação respectivamente esses genes com um nível menor expressão. O teste T foi seguido por um procedimento de bootstrap para ter em conta vários testes. Como valores de corte de um p-valor corrigido de 0,05, um valor de p em bruto de 0,01 e um sinal de relação de log-(SLR) de ± 0,7 foram utilizados para determinar o topo genes regulados. Os candidatos mais significativos identificados são apresentados na Tabela 1, estatísticas completas são fornecidos na Tabela S2.

A aplicação destes limiares que identificamos 173 transcritos (128 genes) regulados de forma significativa entre os nós regionais e distantes linfáticos de pN0- pacientes classificados. Vários destes genes foram associados com a resposta imunológica (como o CD64, CD32,

FPR1

e

FPR2

, [18]

IGHG1

,

IL1R2

,

CCL23

,

MSR1

,

C5AR1

,

LILRA5

, [19] ou

LILRB2

[20]). Curiosamente um par de câncer e metástase genes associados foram desregulados bem (como

L1CAM

(CD171), [21]

EREG

, [22], [23]

NOVA1

,

HPR

, [24] ou

LAMC2

[25], [26]). Epirregulina, por exemplo, é um factor angiogénico que pode propagar a metástase, permitindo que as células tumorais a infringirem as barreiras endoteliais do pulmão e, por sua vez, liberando-os para o sistema de circulação [22], [23].

Em contraste, identificamos 134 transcrições desregulados (109 genes incluindo

IGF1

,

DKK1

,

PRIMA1

e

LTF

) nos nódulos linfáticos regionais de pacientes pN1-classificadas. Entre esses genes moléculas pró-proliferativa e anti-apoptóticos foram regulados negativamente – como

IGF1

e

LTF

que agem através da regulação da Akt [27] e ERK1 /2 via de sinalização [28], respectivamente. PRIMA1 modula a expressão de CXCR4 [29] -. Uma molécula que já foi descrito para correlacionar fortemente com o aumento da metástase linfática [11], [12], [29]

Notavelmente

DKK1 exibiu o

mais desregulamentação significativa (mudança de 2 vezes; p-valor 0,0029). O gene foi claramente regulada nos gânglios linfáticos regionais de pacientes pN1. DKK1 é um inibidor da via de WNT, que tem sido mostrado para ser de significado prognóstico em diversas entidades tumorais, tais como cancro da mama, cancro do pulmão, mieloma, mas também em carcinoma esofágico [30] – [38]. Além disso DKK1 foi relatado como sendo elevados em o soro de pacientes ESC [37].

validado 12 dos genes mais importantes através de RT-PCR (Fig. 2). Por cinco desses genes (

ISL1

,

LAMC2

,

NOVA1

,

EREG

,

L1CAM

) as tendências de regulação e pontos fortes foram confirmadas, embora os valores de p determinados na análise PCR variou entre 0,08 e 0,15, provavelmente devido ao pequeno tamanho da amostra. Sete genes (

IGF1

,

IGFBP5

,

DKK1

,

LTF

,

TBX3

,

FOXG1

,

LILRA

) poderia ser validada com êxito que mostra um valor p significativo abaixo de 0,05. Maior significância (p-valor de 3 * 10e-4) foi observada novamente para

DKK1

(ver Tabela S3).

exibido o sinal-log-relações dos linfonodos regionais em comparação ao tumor nódulos linfáticos distantes (referência) para um conjunto selecionado de melhores genes regulados.

na época de cinco pacientes pN1 análise de acompanhamento tinham morrido, bem como um paciente pN0. O último paciente tinha exibido metástase pulmonar em um exame de acompanhamento. Curiosamente esse paciente constitui um outlier em termos de

DKK1

expressão que mostra uma diminuição da regulação nos gânglios linfáticos regionais.

Os resultados descritos nesta seção mostram que estas livre de metástases pN1 linfonodos exposição regulamentos de genes claramente diferentes daquelas em linfonodos pN0. Além disso, eles indicam que DKK1 pode ser significativamente associada com os mecanismos subjacentes.

Os padrões funcionais em amostras pN0 e pN1 são distintas, mas intimamente ligada

Com base nestes resultados foi perguntado se os regulamentos observados na verdade, descrever os mecanismos moleculares diferentes – ou meramente diferentes representantes dos mesmos mecanismos. Nós, portanto, realizado enriquecimento conjunto de genes e análise de rede.

Por causa do tamanho da amostra utilizada em nosso trabalho é bastante pequena a distribuição p-valor é afetado no T-teste. Levando isso em conta e para permitir a incorporação de mudanças mais sutis, que, no entanto, pode adicionar à imagem grande, decidimos usar um p-valor menos rigoroso de ± 0,1 para identificar genes regulados para serem incluídos na análise.

a nossa análise revelou perfis notavelmente distintas (Fig. 3) a caracterização dos gânglios linfáticos tumorais adjacentes dos pacientes pN1 e pN0. Os resultados mostraram uma clara activação dos mecanismos de resposta imunitária no grupo pN0. Os genes regulados foram associados com a resposta inflamatória aumentada, a apresentação de antigénio, reduziram o crescimento celular, acompanhamento de células imunitárias e sinalização célula-a-célula, enquanto a proliferação e mecanismos associados ao cancro foram reduzidos.

funções biológicas e moleculares são apresentados e sub-funções associadas com os genes regulados nos linfonodos regionais, em comparação com os gânglios linfáticos distantes (de referência) de pN1 ou pacientes pN0. Os únicos círculos transparentes representam as principais funções, a cor (vermelho: ativado, azuis: inactivada) círculos dentro retratam as subfunções significativamente enriquecido (por exemplo, dentro pN1 círculo morte celular: ‘apoptose de linhas de células de leucemia’ – vermelho, ou “célula sobrevivência “- azul). Azul sub-funções têm uma previsão forte para ser inactivado, sub-funções vermelhos para ser activado. Quanto mais profunda a cor mais confiável (z-score) é a predição do estado de ativação. O tamanho dos círculos aumenta com a significância (p-value) da associação da lista de genes com os sub-funções. A análise foi realizada com software Ingenuity Pathway Analysis. Ele pode ser visto claramente que os linfonodos regionais livre de metástases de pacientes pN1 exibem um regulamento-padrão completamente diferente que as de pacientes pN0.

Em contraste gânglios linfáticos regionais de pacientes pN1 exibiu uma redução de imunológico mecanismos de resposta associada (Fig. 3). Além disso, a proliferação reduzida, bem como o tecido reduzido estrutura, morfologia e desenvolvimento foi observada, por um lado – e apoptose aumentada e hipoplasia do outro. Tempo sábio deve-se esperar que esses linfonodos seria mais perto do ponto de invasão metastática por isso foi surpreendente que o padrão de resposta imune foi regulada para baixo.

Além disso, a análise previu uma inativação de β-catenina e reguladores a jusante (Fig. 4a). Entre os principais alvos β-catenina,

VEGFA

,

CCND1

,

MSX1

,

IGFBP5 e DKK1

exibiu uma expressão diminuída na microarray. Embora apenas com base em probabilidades de estatística, a predição é notável porque β-catenina activo é necessário para a expressão

DKK1

. [39] O potencial de inactividade β-catenina, por conseguinte, pode correlacionar-se com a observada sub-regulação de

DKK1

.

A análise da rede foi realizada utilizando software Ingenuity Pathway Analysis. a) rede mecanicista da β-catenina reguladores a jusante exibindo previu estado de activação e a relação de regulamentação (activação ou inibição) entre os reguladores individuais. β-catenina e um número de reguladores a jusante são previstos para ser inactivada. b) A análise mostra uma ligação estreita entre os genes regulados nas amostras pN1 (nós cinza claro) e aqueles regulados nas amostras pN0 (nós cinza escuro) ligados por ERK1 /2 e DKK1 incorporado dentro da rede.

Para investigar mais como relacionados com as vias moleculares subjacentes são, incluímos os regulamentos de expressão gênica em amostras pN1 (109 genes) e em amostras pN0 (128 genes) em uma lista comum e realizada análise de rede. Curiosamente, apesar da clara diferença nos perfis mecanismo molecular entre as amostras pN1 e pN0, a análise revelou que vários dos genes envolvidos (28/128 genes pN0; 19/109 genes pN1) parecia estar intimamente ligada (Fig 4b.) Em ambos grupos -. com DKK1 incorporados dentro da rede

em conjunto estas observações sugerem que os linfonodos regionais livre de metástases de pacientes pN1 já estão sujeitos a processos moleculares diferentes aos dos pacientes pN0 – lugar embora metástase ainda não tomou nestes nodos. Além disso, um envolvimento de

regulação DKK1

através da via /β-catenina WNT parece mais plausível. Dito isto, as redes moleculares subjacentes a esses padrões diferentes podem ser conectados. Em ESC nó de linfa pacientes metástase é apenas uma questão de tempo, a menos que a ressecção do tumor oportuna é realizado. Por isso, parece plausível que os padrões de transcrição observadas não se correlacionam com dois mecanismos completamente diferentes, mas sim representam dois pontos de tempo de um processo progride.

DKK1 pode ser observada em subestruturas distintas do nódulo linfático e em células endoteliais dos vasos

devido à importância de

DKK1

nos nossos resultados e porque DKK1 já foi demonstrado ser de prognóstico para o resultado de um número de entidades tumorais malignas [30] – [38] que focado nesta molécula na validação de imuno-histoquímica. Nós coradas secções de parafina de gânglios linfáticos investigada utilizando um anticorpo policlonal contra o DKK1 e contrastadas as secções com hematoxilina. A coloração imuno-histoquímica revelou uma tendência de DKK1 a ser menos expressos em linfonodos dos pacientes pN1 regionais (Fig. 5a). Em DKK1 gânglios positivos a sua expressão pode ser claramente observada no seio subcapsular e, em alguns casos, que se estendem para dentro do seio intermediário e trabéculas (Fig. 5b). Além disso, em algumas amostras de expressão DKK1 poderia ser observada em células endoteliais dos vasos (Fig. 5c).

Os nódulos linfáticos foram coradas utilizando um anticorpo policlonal contra o DKK1 (1:100, Abcam, # ab61034) e contrastadas com hematoxilina. a) Representante DKK1 linfonodo negativo. Barra de escala: 200? m. b) Representante DKK1 nódulo positivo linfa. O seio subcapsular é marcado com (I) e o seio intermediário e trabéculas com (II). Barra de escala: 200? m. c) DKK1 células endoteliais vasculares positivos. Barra de escala:.. 100 mm

Discussão

Enquanto várias taxas de incidência de câncer caiu nos Estados Unidos e outros países ocidentais ao longo dos últimas décadas, a taxa de incidência de adenocarcinoma de esôfago tem aumentado [ ,,,0],40] Um parâmetros que indicam a progressão da doença é a expansão do tumor que, actualmente, é a base para a selecção da terapia.