Sumário

factor de crescimento epidérmico (EGF) e insulina-like factor-I (IGF-I) são reguladores críticos da diferenciação das células, a sobrevivência, a proliferação, a migração e em cancros. Este estudo concluiu que ARNO (cytohesin-2), um activador do EGF e vias de IGF-I, foi mais altamente expresso em tecido de cancro colorrectal do que no tecido colorrectal benigno adjacente. Quando ARNO-siRNA ou o inibidor químico SecinH3 bloqueada ARNO, a jusante do EGF e IGF-I caminhos diminuiu em linhas de células colorretal HT29 e HCT116. Este bloqueamento também enfraqueceu a proliferação celular, invasão, migração e in vitro. Além disso, o receptor EGF (EGFR) dependentes de xenoenxertos de tumores colorretais em ratinho nu exerceu efeitos de supressão anti-proliferativa e crescimento, injectando secineH3. Estes dados sugerem que a inibição da cytohesins ou ARNO como activadores citoplasmáticos do EGFR e do IGF-I no cancro colo-rectal resultou no anti-proliferação, invasão reduzida, diminuição da migração, e suprimiu o crescimento in vivo e in vitro. Portanto, cytohesins ou ARNO pode ser um alvo potencial terapia para alguns câncer colorretal

Citation:. Pan T, Sun J, Hu J, Hu Y, Zhou J, Chen Z, et al. (2014) Cytohesins /ARNO: A função nas células do câncer colorretal. PLoS ONE 9 (3): e90997. doi: 10.1371 /journal.pone.0090997

editor: Jung Weon Lee, da Universidade Nacional de Seul, República da Coreia

Recebido: 27 de agosto de 2013; Aceito: 06 de fevereiro de 2014; Publicação: 11 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Pan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiada de Pesquisa Nacional de alta Tecnologia e do Programa de Desenvolvimento da China (No. 2012AA02A506), Zhejiang Provincial Natural Science Foundation da China (LD13H160015) e Zhejiang Provincial Key científica e tecnológica Projetos de Pesquisa de Cooperação Internacional (No. 2009C14010). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) continua a ser o terceiro câncer mais comumente diagnosticado em homens ea segunda em mulheres, apesar das melhorias significativas no seu prognóstico atribuídas aos avanços nas modalidades de diagnóstico e terapêutica. Mais de 1,2 milhões de novos casos de câncer e 608 700 mortes são registradas anualmente [1]. Os tratamentos eficazes para o cancro colo-rectal são a cirurgia, quimioterapia e terapia-alvo. Avanços na quimioterapia convencional estenderam a expectativa de vida, mas a eficácia de muitos pacientes permanece baixa, especialmente para aqueles com metástase. A busca por terapias mais eficazes e menos tóxicas deu origem a uma nova geração de agentes antitumorais. O mais comum é o agente biológico alvo [2]. factor de crescimento epidérmico (EGF), o receptor (EGFR) e vias de transdução de sinal associadas surgiram como importantes alvos terapêuticos para o cancro colorectal moleculares [3].

EGFR /ErbB1, juntamente com o Her2 /ErbB2, HER3 /ErbB3, e ErbB4, é um membro da família ErbB. EGFR /ErbB1 inata regula a resposta imunitária do corpo [4], bem como a diferenciação de células, a sobrevivência, a proliferação, invasão, migração e. EGFR contém um domínio extracelular de ligação ao ligando, uma única região que atravessa a membrana e um domínio citoplasmático da tirosina-quinase [5]; [6]. Os ligandos ligam-se ao domínio extracelular, causando dimerização do receptor, desse modo induzindo alteração conformacional de componentes intracelulares de fosforilação e permitindo que a sinalização a jusante [7].

Hoje em dia, muitos agentes biológicos segmentados desempenham um papel importante na via de sinalização de EGFR. Anti-EGFR anticorpos monoclonais e inibidores da tirosina-cinase EGFR foram provados para inibir eficazmente a proliferação de tipos de câncer, especialmente câncer colorretal e de nasofaringe [8]; [9]. Cetuximab e panitumumab, os anticorpos contra o EGFR, são amplamente utilizados para tratar o cancro colo-rectal. No entanto, os pacientes eventualmente desenvolver resistência a esses agentes [10]. Uma hipótese comum de Cetuximab-resistência é EGFR ou mutação molecular a jusante no interior das células tumorais, como a mutação do EGFR adquirida ectodomínio S492R [10]. Além disso, o bloqueio do EGFR persistente aumenta com excepção da via EGFR vias, tais como o factor de crescimento receptor HER2, HER3, semelhante à insulina (IGF) -I receptor (IGF -IR) vias de sinalização [11] – [13].

IGF-I e IGF-II desempenham um papel central no crescimento celular, diferenciação, sobrevivência, transformação, e metástase. Os efeitos biológicos dos IGFs são mediadas pelo IGF-IR, um receptor tirosina-quinase com homologia ao receptor da insulina. Os pesquisadores descobriram recentemente que a desregulamentação do sistema IGF é um fator chave para a progressão de vários tipos de câncer, com a ativação do IGF-IR aumentando o potencial tumorigénico de mama, próstata, pulmão, cólon, bem como carcinomas de células escamosas de cabeça e pescoço [14 ]; [15].

Cytohesins como activadores de receptores ErbB foram relatados por Bill et ai. [16]. Eles mostraram que cytohesins aumentar a activação do EGFR através da interacção directa com os domínios citoplasmáticos dos receptores dimerizados e facilitando os rearranjos conformacionais destes domínios. Cytohesins mais de expressão aumenta a sinalização de EGFR em cancros do pulmão humanos, ao passo que a inibição química ou knockdown de cytohesins reduz a ativação do EGFR. Da mesma forma, os nossos estudos anteriores mostraram que o bloqueio cytohesins por SecinH3 ou derrubar ARNO por ARNO-siARN pode reduzir a activação do EGFR em linhas celulares de cancro colorrectal HT29 [17]. EGF e IGF são reguladores críticos da diferenciação das células, a sobrevivência, a proliferação, a migração e em cancros. Eles também estão envolvidos na apoptose, transformação, crescimento invasivo e metástase de células tumorais [15]. Cytohesins têm sido sugeridas como um novo alvo eficaz para reduzir a invasão, metástase, e Cetuximab ou células panitumumab-resistentes em pacientes com cancro colo-rectal. A possibilidade de que cytohesins pode ser novos alvos para pacientes com câncer de pré-estágio resistentes a drogas ou que tenham sido exploradas. Assim, nós examinamos cytohesins ou ARNO como um novo agente anti-cancro colorectal neste estudo.

Materiais e Métodos

Anticorpos e reagentes

Os meios de cultura de células 1640 e McCoy S 5A foram adquiridos de Gibco (Gibco, EUA). O coelho ou um rato monoclonais anticorpos anti-humanos utilizados foram ARNO (Abcam, ab56510), pEGFR (Py1068, Epitomics, 1138-1), pErk1 /2 (T202 /Y204, Bioworld, BS5016), (Cell Signaling, 3197) EGFR, GAPDH (Bioworld, AP0063), IGF-IR (Abcam, ab39675), pIGF-IR (Abcam, ab39398), Pirs (Abcam, ab52167), pAKT (Abcam, ab106693), pIRS1 (Abcam, ab66153), pShc (Abcam, ab155170) e Ki-67 (Cell Signaling, 9027). Outros reagentes e equipamentos utilizados foram como se segue: SecinH3 (Merck-565725 /SC-203260), siARN oligo (Genephama), MTT (Sigma, m5655), DMSO (Sigma, D5879), EGF humano (Peprotech, AF-100-15 ), IGF-1 humano (Peprotech, AF-100-11), FBS (Gibco, EUA), e 0,25% de tripsina (Sigma), kit de imuno-histoquímica (Zhongshan, China).

linhas de células e cultura

as linhas celulares de cancro colorectal humanas HT29 e HCT116, que foram identificados sem qualquer mutação no KRAS e BRAF, foram obtidos a partir da chave do Laboratório de Prevenção do câncer e Intervenção, cancer Institute, Segundo Hospital Filiado, Faculdade de Medicina, Zhejiang University, China. As culturas de células utilizadas foram as seguintes: A linha de células HT29 por 1640 (com 10% de FBS + 1% de estreptomicina /penicilina) e linha de células HCT116 por 5A de McCoy (com FBS a 10% + 1% de estreptomicina /penicilina). Todas as linhas celulares foram cultivadas em CO 37 ° C 5%

2 incubadora e passadas com 0,25% de tripsina (Sigma) em 0,2 M de solução salina tamponada com fosfato (PBS).

amostras tumorais

Antes da pesquisa de amostras de tumores humanos, deve ter sido obtido o consentimento informado dos pacientes. Nós tinha apresentado uma declaração do nosso comitê de ética do hospital e recebeu a aprovação da pesquisa. Todas as amostras tumorais derivam do Biobank na chave do Laboratório de Prevenção do Câncer e Intervenção, Cancer Institute, Universidade de Zhejiang, na China. Todos os tumores foram clinicamente e patologicamente identificados como sendo a lesão neoplásica primária e única e classificados de acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS) Classificação dos Tumores do Aparelho Digestivo (2010).

imunocoloração

Para imunocoloração, foram utilizados anticorpos monoclonais de coelho produzidos contra ARNO (Abcam, ab56510), anticorpos de ratinho contra pEGFR (Py1068, Epitomics, 1138-1), anticorpos policlonais de coelho contra pIGF-IR (Abcam, ab39398) e anticorpos monoclonais de coelho contra Ki-67 (Cell Signaling, 9027) como anticorpos primários. Antes da aplicação, todos os anticorpos foram diluídos (diluídos anticorpos primários 1:100, todos os outros anticorpos secundários diluída 1:200) em PBS (150 mM de NaCl, 10 mM de Na

2HPO

4, 10 mM de NaH

2 PO?

4, pH 7,4). A imuno-histoquímica foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. intensidades de coloração foram avaliadas individualmente por três observadores independentes, utilizando um sistema de pontuação de quatro camadas como descrito [18].

MTT

células

HT29 ou HCT116 foram semeados em placas de 96 poços a uma densidade de 3000 células /poço. As células foram cultivadas com 1% de FBS e reagentes (50 ng /mL de EGF ou de 25 ng /ml de IGF-1, SecinH3 com diferentes concentrações (0 uM, 10 uM, 20 uM, 40 uM)) durante 24, 48, e 72 h a 37 ° C e 5% de CO

2. Em seguida, 5 mg /mL de MTT foram adicionados a cada poço e incubou-se durante 4 h. Em seguida, 200 mL de DMSO foi adicionado ao substrato MTT resoluta e absorvância foi medida a 570 nm usando um leitor de placas de micro Spectra MAX (Bio-Rad, EUA)

Western blot análise

As células foram recolhido e extraiu-se com um tampão de lise de célula eucariótica de acordo com as instruções do fabricante. As proteínas foram separadas por 12% SDS-PAGE e transferidas para uma membrana de nitrocelulose com um dispositivo de transferência húmida (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). membranas riscados foram bloqueados com 10% de leite desnatado em PBS Tween-20 durante 1 h. Após lavagem das membranas três vezes com solução salina tamponada com Tris Tween-20 (TBST), que foram incubadas com anticorpo primário diluído 1:1000 à temperatura ambiente durante 1 h e em seguida incubadas em anticorpo marcado com HRP secundário diluído 1:10 000 no quarto temperatura durante 1 h. Após lavagem das membranas, a visualização foi realizada com um sistema de análise de Western blot quimioluminescência aumentada (Amersham Biosciences, Little Chalfont, Reino Unido), e as células foram expostas a filme de raios-X (Kodak). proteína GAPDH foi usada como um controlo interno. Os parafusos são detectados e análise por software Alpha Imager EP (Versão: 3.2.2.0).

ensaios de migração celular

ensaios de migração celular foram realizados utilizando 24 poços Tran inchar chapas (8 de poro tamanho; Costar). Cerca de 1 × 10

4 células (HT29 ou HCT116) foram carregados nas câmaras superiores. As câmaras inferiores foram cheias com o meio (1640 mais 1% de FBS) na ausência (DMSO 0,2%) ou na presença de SecinH3 (10, 20, ou 40 uM). As placas ondulação Tran foram em seguida incubadas num banho a 37 ° C, 5% incubadora de CO2 durante 48 h. Após a limpeza, as células a partir do lado superior da membrana de policarbonato e coloração com hematoxilina-eosina, a membrana de policarbonato foi cortada e colocada numa lâmina de microscópio, tampa deslizado, e examinado sob o microscópio. O total migraram número de células e percentual foram então contados.

modelos de tumor xenoenxerto

Todos os procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com as Leis da Universidade de Zhejiang para a Proteção Animal e aprovado pelo comitê de proteção animal Universidade de Zhejiang . Os tumores foram gerados através de injecções subcutâneas de 5 × 10

6 HT29 células em ratinhos nu /nu atimicos machos de acordo com Ullrich et ai. [19]. Depois de estabelecer tumores (cerca de 6 mm de diâmetro), de catorze murganhos foram divididos aleatoriamente em dois grupos. Os ratinhos no grupo SecinH3 foram tratados com injecções intraperitoneais diárias de SecinH3 (100 ul, 2,5 mM; 75% em solução de glucose (5%) /25% de DMSO). Os ratinhos no grupo de controlo foram tratados com o mesmo volume de solução de glucose a 75% e DMSO a 25% até ao dia 14. Durante o tratamento, foram medidos o maior diâmetro do tumor a cada 2 dias por ultra-sons e, em seguida, os ratinhos sacrificados para recolher os tumores. Em seguida, realizada coloração imuno-histoquímica para o Ki-67 para detectar a inibição da proliferação de SecinH3 nos modelos de tumor de xenoenxerto. O número de células total positivo Ki-67 e percentual foram então contados.

Estatísticas

Os resultados são apresentados como a média ± erro padrão da média (SEM). O SPSS16.0 software estatístico foi usado para análise estatística. Comparações pareadas foram realizadas por estudantes do

t

-teste. análise de correlação de Pearson foi conduzido, com a

p Art 0,05 (marcados com “*”) e

p

. 0,01 (marcado “**”) consideradas significativamente diferentes ou significativamente correlacionada

Resultados

ARNO mais expressão foi correlacionada com os níveis de EGFR e IGF-IR em tecido de cancro colorectal humano

EGFR e IGF-IR de sinalização desempenham papéis críticos em muitos tipos de câncer [16 ] eo nosso grupo descobriu que ARNO e outros cytohesins melhorar a activação de EGFR nas células de cancro colorrectal [17]. Assim, nos perguntamos se ARNO foi mais expressa em tecidos de câncer dos pacientes e da sobre-expressão foi correlacionada com EGFR e IGF-IR de sinalização. Portanto, nós utilizamos a imunohistoquímica para investigar adenocarcinomas colorretais humanas primárias com um anticorpo detectar ARNO, pEGFR (pY1068) e pIGF-IR (pY1185). Os resultados mostraram que o tecido colorectal normal ou tecido colorectal adjacente benigna tinha apenas fundo (30/36) ou coloração fraca (6/36). Além disso, todos os carcinomas apresentaram coloração positiva ARNO, 93,1% dos quais eram moderada ou forte. Encontramos uma muito significativa (

r

= 0,712,

p

= 0,012 para pEGFR;

r

= 0,684,

p

= 0,031 para pIGF- IR,

n

= 36) correlação entre o nível de ARNO e pEGFR ou pIGF-IR (Fig.1) expressão. Nossos estudos anteriores sobre o papel de ARNO em tecidos de câncer colorretal revelaram uma alta correlação com pEGFR e pIGF-IR, o que sugere que ARNO possivelmente aumenta a ativação e sinalização de EGFR e IGF-IR.

cancros colo de Doentes ou tecido adjacente secções consecutivas benignas foram coradas para ARNO (a), pEGFR (b), e pIGF-IV (c). Imagens representativas de tecido normal colorectal (coluna da esquerda) e moderada (coluna da direita) expressão ARNO são mostradas (aumento original x 100). O diagrama em (a) mostra a fracção de frequências e de tumores com o fundo (-), fraca (+), moderada (++) ou forte (+++) para coloração ARNO. Os diagramas em (b) e (c) mostram a correlação dos níveis de fosforilação de proteínas respectivas com a pontuação ARNO (

p

= 0,012 para pEGFR,

p

= 0,031 para pIGF-IR ,

n

= 36). Ele revela que ARNO sobre a expressão foi correlacionada com EGFR reforçada e IGF-IR.

inibição química da cytohesins e knockdown de ARNO reduzida sinalização celular

Para detectar a função de cytohesins ou ARNO na via de EGF de células de cancro colorectal, e SecinH3 ARNO-siARN (seleccionado pelas experiências preliminares) inibir cytohesins /ARNO em células HT29 [17]. No ensaio, HT29 células foram cultivadas em pratos de vidro com fundo de 35 mm marcados como grupo A, B, ou C. Todas as células foram cultivadas com meio de cultura FBS a 1%. SecinH3 (20? M ou uma mistura de 100 pmol de ARNO siRNA em 5 ul de Lipofectamina 2000) foi adicionado aos pratos do grupo B quando as células se espalhou para cobrir 70% dos pratos durante 10 h. Simultaneamente, 0,2% de DMSO (ou 5 ul de Lipofectamina 2000) foi adicionado aos pratos dos grupos A e C como um controlo, e, em seguida, 50 ng /ml de EGF foi adicionado aos pratos dos grupos A e B durante 5 min. A análise por Western blot foi usado para testar a expressão de EGF moléculas associadas a vias, incluindo ARNO, EGFR, pEGFR, pIRS1, pShc, e pErk1 /2. Os resultados indicaram que, quando SecinH3 bloqueada cytohesins ou ARNO inibidas por ARNO-siRNA, expressão ARNO foi reduzida em células HT29. Além disso, as moléculas fosforiladas da via EGF incluindo pEGFR, pShc, e pErk1 /2 foram regulados negativamente em células HT29 (Fig. 2).

(a e b) SecinH3 e ARNO siRNA reduzida a sinalização do receptor EGFR. A análise de transferência de Western de células HT29 SecinH3 tratados com (a) ou ARNO-siARN (b) e estimuladas com EGF é mostrado. A fosforilação das proteínas indicados foi determinado por imunodetecção, utilizando anticorpos fosfoespec�ico. Glyceraldehydes fosfato desidrogenase (GAPDH) serviu como um controlo de carregamento. Os diagramas mostram níveis de fosforilação relativos após a normalização para o GAPDH. As células estimuladas por ligando não tratados foram definidos como 3 (

N

= 3). Os dados são representados como a média ± SEM. *

p Art 0,05, **

p

. 0,01

Para detectar a função de cytohesins ou ARNO na via IGF, SecinH3 e ARNO -siRNA [17] em células HCT116 inibida cytohesins /ARNO. No ensaio, as células HCT116 foram cultivadas em pratos de vidro com fundo de 35 mm marcados como grupo A, B, ou C. Todas as células foram cultivadas com meio de cultura FBS a 1%. SecinH3 (20? M ou uma mistura de 100 pmol de ARNO siRNA em 5 ul de Lipofectamina 2000) foi adicionado aos pratos do grupo B quando as células se espalhou para cobrir 70% dos pratos durante 10 h. Simultaneamente, 0,2% de DMSO (ou 5 ul de Lipofectamina 2000) foi adicionado aos pratos dos grupos A e C como um controlo, e, em seguida, 25 ng /ml foi adicionado IGF-1 para pratos de grupos A e B durante 5 min. A análise por Western blot foi usado para testar a expressão de moléculas associadas a vias incluindo IGF ARNO, IGF-IR, pIGF-IR, pirs, e pAKT. Os resultados indicaram que quando cytohesins foram bloqueados por SecinH3 ou inibida por ARNO siRNA, ARNO expressão foi reduzido em células HCT116. Além disso, as moléculas fosforiladas da via de IGF incluindo pIGF-IR e pAKT foram regulados negativamente em células HCT116 (Fig. 3).

(a e b) SecinH3 e ARNO siRNA reduzida a sinalização do receptor IGF-IR. A análise de transferência de Western de células HCT116 SecinH3 tratados com (a) ou ARNO-siARN (b) e estimuladas com IGF-1 é mostrado. A fosforilação das proteínas indicados foi determinado por imunodetecção, utilizando anticorpos fosfoespec�ico. Glyceraldehydes fosfato desidrogenase (GAPDH) serviu como um controlo de carregamento. Os diagramas mostram níveis de fosforilação relativos após a normalização para o GAPDH. As células estimuladas por ligando não tratados foram definidos como 3 (

N

= 3). Os dados estão representados como a média ± SEM. *

p Art 0,05, **

p

. 0,01

cytohesins bloqueio reduziu a proliferação e migração de células colorretal

a imuno-histoquímica de tecidos de cancro dos pacientes revelou que ARNO sobre-expressão foi correlacionada com o EGFR e melhorada de IGF-IR. Essa descoberta nos levou a pensar sobre a possibilidade de proliferação reduzida ou migração de células EGFR /sensíveis ao IGF quando ARNO é bloqueado. Para seleccionar linhas de células sensíveis /IGF-EGFR, foi realizado um ensaio MTT por cultura das linhas celulares de cancro colorrectal HT29, SW620, SW480, HCT116, e LOVO em 1% de FBS com EGF ou IGF. Descobrimos que HT29 foi a linha celular dependente de EGFR e HCT116 foi IGF sensíveis (dados não mostrados). Ambas as linhas celulares foram identificados como sendo de tipo selvagem para KRAS e BRAF (dados não mostrados). Para detectar a relação de ARNO com proliferação e migração celular no cancro colo-rectal, adicionamos sesinH3 ao meio de cultura e verificou-se pode reduzir a proliferação (ensaio MTT com SecinH3 em 0 (DMSO), 10, 20, e 40 uM para 24, 48, e 72 h) (Fig. 4b), e a migração (Tran inchar com SecinH3 em 0 (DMSO), 10, 20 e 40 uM para 48 h) de HT29 e células HCT-116 (Fig. 4a). Ele mostra que SecinH3 pode inibir a infiltração e migração de células HT29 e HCT116. E os efeitos são proporcionais à concentração de SecinH3 e o tempo de operação.

coluna da esquerda do diagrama (a), são representativos de imagens Tran inchar ensaio de HT29 e células HCT-116 tratadas com SecinH3 em 0, 10, 20 , e 40 uM, respectivamente. As imagens esquerda são o resultado de células HT29 sem SecinH3 (DMSO 0,2%) durante 48 h e com SecinH3 (20 uM para 48 h) (ampliação original x 100). Parece que SecinH3 podem inibir a migração de células HT29 e HCT116. Os resultados são correlação com a concentração de SecinH3 e o tempo. Os diagramas (b) mostra o número relativo de células HT29 de HCT116 e determinado pelo ensaio de MTT na presença de SecinH3 em 0, 10, 20, e 40 uM para 24, 48, e 72 h. Parece que SecinH3 pode inibir a infiltração de células HT29 e HCT116. Os resultados são também correlação com a concentração de SecinH3 e o tempo. Os dados são representados como a média ± SEM. * P 0,05, ** p . 0,01 (

n

= 5)

SecinH3 reduziu o crescimento de xenoenxertos de tumor HT29 colorretais

A forte expressão de ARNO em tecido de cancro colorectal e sua correlação significativa com pEGFR e pIGF-IR nos levou a perguntar se o bloqueio cytohesins in vivo pode inibir a proliferação de células tumorais. Para investigar esta hipótese, as células HT29 que têm a maior expressão de EGFR do que outras células de cancro colorrectal [17], foi selecionado para fazer o modelo de ratinho de xenoenxerto. Portanto, injectados por via subcutânea células HT29 em ratinhos nus com xenoenxertos de tumor gerar. Quando o tamanho de xenoenxertos do tumor atingiu 6-7 mm de ratinhos que tinham sido injectados as células HT29 por quase uma semana, os murganhos começaram a tratar com ou sem SecinH3. Os tumores do grupo SecinH3 foram inibiu o crescimento, obviamente, após o tratamento com SecinH3 por mais de uma semana. Os dois grupos apresentaram diferenças óbvias até os dias 11 de após o tratamento (Fig. 5a). a coloração imuno-histoquímica do marcador de proliferação celular Ki-67 em tumores ressecados confirmou a proliferação celular reduzida. O número de células total positivo Ki-67 e percentual foram então contados. Encontrámos o nível de expressão diferente altamente significativa entre os ratos tratados com ou sem SecinH3 após o tratamento de 14 dias (p = 0,0083, n = 7) (Fig.5b, C, D). A análise por Western blot foi usado para testar a expressão de moléculas associadas a via EGF em tumores de ratinhos tratados durante 2 semanas, incluindo ARNO, pEGFR. Os resultados indicam que, quando SecinH3 bloqueada cytohesins, ARNO e expressão pEGFR foram reduzidos em xenoenxertos HT29. (Fig.5e).

O diâmetro do tumor xenoenxerto estabelecida em ratinhos foi medido por ultra-som a cada 2 dias durante o tratamento (figura a). T

1 foi o grupo controle. T

2 era o grupo SecinH3. Os tumores do grupo SecinH3 foram inibiu o crescimento obviamente, após injecções intraperitoneais diárias de SecinH3 para mais do que uma semana. Houve diferença significativa entre os dois grupos no th 11

, 14

th dias após o tratamento. Diagrama (b) e (c) representam os resultados esforçando imunohistoquímica para Ki-67 do tumor de ratos depois tratados com (b) ou sem SecinH3 (c) por 14 dias, (aumento original x 200). Ele emendas que SecinH3 diminui a expressão de Ki-67 em xenoenxertos HT29. O diagrama (d) mostra a taxa de expressão positiva de Ki-67 em que os tumores de ratinhos portadores de xenoenxertos de HT29 na 14

° dia após o tratamento com ou sem SecinH3. Diagrama (e) descreve a expressão positiva de ARNO, pEGFR nos tumores de ratos portadores de xenoenxertos de HT29 após o tratamento com ou sem SecinH3 durante 2 semanas. A expressão ARNO e pEGFR dos dois grupos têm diferenças significativas. Os diagramas mostram níveis de fosforilação relativos após a normalização para o GAPDH. Os dados estão representados como a média ± SEM. *

p Art 0,05, * *

p Art 0,01, n = 7.

Discussão

EGF e IGF são críticos reguladores das características biológicas das células, especialmente em cânceres [20]. O nosso estudo anterior demonstrou que o cytohesin ARNO é mais importante e é sobre-expresso em linhas celulares de cancro colorrectal como um activador que desempenha um papel crucial na via de sinalização de EGFR [17].

Para verificar a hipótese de que é ARNO relacionada com cancro colo-rectal, ativando EGF e IGF, foi realizada imuno-histoquímica de adenocarcinomas colorretais humanos ressecados coradas por ARNO, pEGFR e pIGF-IR. Em comparação com o tecido colorrectal normal ou o tecido adjacente colorrectal benigno, ARNO, pEGFR, e pIGF-IR foram sobre-expressa em adenocarcinomas. Nós também encontraram uma correlação significativa entre os níveis de ARNO e pEGFR ou pIGF-IR de expressão.

Além disso, usamos siRNA e SecinH3 inibido ARNO /cytohesins em linhas celulares de cancro colorrectal para explorar a atividade de ARNO e a sua associação com o sistema de sinalização do EGFR e do IGF-IR. Nós, então, detectado a jusante do EGFR e IGF-IR em associação com as taxas de incidência de cancro colorrectal. Quando inibida cytohesins ou ARNO, as moléculas a jusante de EGF via foram espelhados na ativação reduzida de pEGFR, pIRS1, pShc e pErk1 /2. A evidência sugeriram que cytohesins de bloqueio ou ARNO poderia reduzir o sistema via EGF. Em todos os momentos, foram detectados via IGF jusante incluindo IGF-IR, pIGF-IR, Pirs, e pAKT. Estas moléculas foram regulados quando ARNO foi inibida química ou por siRNA. Estes baixo regulamentos indicam que a amplificação do sinal e vias de transdução foram eficientemente inibida [21]; [22]. Assim cytohesins ou ARNO foi fortemente correlacionada com EGF e ativação da via IGF no cancro colorectal [23].

Em um contexto celular, foram utilizadas as linhas humanos colorretais de células cancerígenas HT29 e HCT116 identificados sem qualquer mutação no KRAS e BRAF . Quando ARNO siRNA ou SecinH3 bloqueado ARNO ou cytohesins, a proliferação de células de cancro colorrectal foram reduzidos em MTT. Além disso, a redução da proliferação foi positivamente correlacionada com a concentração SecinH3. Para o ensaio de invasão e migração, foi realizado ensaio de inchamento Tran. Os poros nas membranas ondulação Tran foram bloqueados com um gel (matrigel) composta de matriz extracelular para imitar as matrizes típicas que as células de tumor encontram durante o processo de invasão in vitro. Ao colocar as células colorrectais no lado superior do gel para ser atraído por uma concentração de soro mais elevada no outro lado do poço, invasão foi determinada pela contagem das células que tinham atravessado a membrana celular permeável ter invadido e migraram para a maior concentração sérica. Neste ensaio, verificou-se que a inibição por cytohesins SecinH3 diminuiu a invasão e migração de células de cancro colorrectal. Pesquisadores têm relatado recentemente reduções semelhantes em câncer de pulmão e de próstata [6]; [19]; [24]. Esta redução pode contribuir para a regulação para baixo de EGF e IGF-I e de amplificação de sinal via de transdução. No estudo in vivo, injectou SecinH3 diariamente após os xenoenxertos de tumor HT29 foram gerados em ratinhos nus. Descobrimos que o crescimento do tumor foi inibido, obviamente, após 9 dias de injeção SecinH3. Após 14 dias de tratamento, a proliferação do tumor em ratos também foi inibida.

Numa pesquisa recente, é encontrar ARNO que é altamente expresso em cancro colo-rectal, e a expressão está correlacionada com os EGFR e do IGF-IR vias . inibição ARNO pode reduzir a sinalização e condução destas vias, bem como diminuir a proliferação, invasão e migração de células de cancro colorrectal in vivo e in vitro. Ludovini [25] relataram que, se tanto o IGF-IR e EGFR são altamente co expressa no cancro do pulmão de células não-pequenas ressecado, os pacientes podem alcançar uma sobrevivência livre de doença mais curto. Choi et al. [26] indicaram que a inibição combinada da sinalização IGF-IR aumenta o inibidor do crescimento e dos efeitos indutores de apoptose de inibidor da via do EGFR. No entanto, as células cancerosas sempre tem muitas maneiras de canal de sinal para reproduzir, e EGFR e IGFR são apenas duas dessas maneiras. Embora ARNO pode ser um novo alvo de terapia de algumas células de cancro colorrectal, a maior concentração de ARNO em células de cancro do que em células normais pode ser devido a outras razões, tais como a proliferação e a imunidade. O mecanismo de migração pode também estar relacionado com integrina β [27]. Todas essas hipóteses precisam ser pesquisadas no futuro.

Reconhecimentos

Agradecemos Dr. Zhou Jiaojiao e Dr. Tan Chunwen por suas linhas celulares (HT29, HCT116), e também agradecer por seu apoio e entusiasmo. Gostaríamos de pedir desculpas aos autores cujo trabalho inestimável não é mencionado e citado no exemplo acima.